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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410543156.4(22)申请日 2014.10.14C12Q 1/68(2006.01)C12Q 1/14(2006.01)C12R 1/46(2006.01)(71)申请人华中农业大学地址 430070 湖北省武汉市南湖狮子山街1号(72)发明人李锦铨 周洋 王小红 陈福生邓柳燕(74)专利代理机构武汉宇晨专利事务所 42001代理人王敏锋(54) 发明名称一种猪链球菌2型的SS2-LAMP检测试剂盒及应用(57) 摘要本发明公开了一种猪链球菌2型的SS2-LAMP检测试剂盒及应用，该试剂盒由猪链球菌前处理液和LAMP反应试。
2、剂组成，包括SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6；还包括以下组分：(1)前处理液；(2)LAMP反应液；(3)聚合酶；(4)显色液；(5)阳性对照样品为基因组，阴性对照为无菌去离子水。能快速检测食品中或者动物污染或携带的猪链球菌2型。提高了检测的灵敏度并减少了检测时间，在检测靶点的选择上进行了创新，极大提高检测的准确性。方法简单易行，节省时间，降低成本。检测过程不需要PCR仪和检测的设备，反应时间短，灵敏度高，能检测到fg级别的核酸，适合快速检测医疗卫生、动物疫病或食品安全领域中的猪链球菌2型。
3、。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书5页序列表2页 附图2页(10)申请公布号 CN 104404132 A(43)申请公布日 2015.03.11CN 104404132 A1/1页21.一种猪链球菌2型的LAMP检测试剂盒，该试剂盒由猪链球菌前处理液和LAMP反应试剂组成，其特征在于：包括引物组SS21-FIP的核酸序列SEQ ID NO.1所示、SS21-BIP引物的核酸序列SEQ ID NO. 2所示、SS21-F3引物的核酸序列SEQ ID NO. 3所示、SS21-B3引物的核酸序列SEQ ID NO. 3所示、SS。
4、21-F3引物的核酸序列SEQ ID NO. 4所示、SS21-LF引物的核酸序列SEQ ID NO. 5所示、SS21-LB引物的核酸序列SEQ ID NO. 6所示；所述的试剂盒还包括以下组分：(1)前处理液：20 mM Tris-HCl；(2) LAMP反应液：20 mM Tris-HCl、10mM (NH4)2SO4、10mM KCl、2mM MgSO4、10M dNTPs、20mol/L SS21-FIP、20mol/L SS21-BIP、10mol/L SS21-F3、10mol/L SS21-B3、10mol/L SS21-LF and 10mol/L SS21-LB；(3) 聚。
5、合酶：3个酶活单位的Bst DNA聚合酶；(4) 显色液：含有10%体积比SYBR Green I 的荧光染料；(5) 阳性对照样品为猪链球菌2型的基因组，阴性对照为无菌去离子水。2.权利要求1所述的一种猪链球菌2型的SS2-LAMP检测试剂盒在食品病原检测中的应用；所述的食品为疑似受到猪链球菌2型污染的生猪肉、猪内脏、以及腊肉、熏肉、灌肠猪肉各种猪肉制品。3.权利要求1所述的一种猪链球菌2型的SS2-LAMP检测试剂盒在动物疫病检测中的应用；所述的动物为疑似受到猪链球菌2型感染的猪和人。权 利 要 求 书CN 104404132 A1/5页3一种猪链球菌 2 型的 SS2-LAMP 检测试剂。
6、盒及应用技术领域0001 本发明属于食品安全检测或者病原微生物检测领域，更具体涉及一种检测病原微生物的试剂盒，还涉及一种猪链球菌2型的SS2-LAMP检测试剂盒的用途。适用于医疗卫生、食品和动物疫病的快速检测。背景技术0002 猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2, S. suis 2）是一种重要的人畜共患传染病病原。S. suis 2不仅导致猪出现脑膜炎、关节炎、肺炎、心内膜炎和败血症等症状，造成猪只大量死亡，给养猪业造成巨大的经济损失，还可以通过与感染猪、带菌猪肉直接接触而传染给人，导致人永久性听力丧失、败血症型休克甚至死亡，严重威胁着人类的身体健康和生。
7、命安全，已引起社会的高度关注。1998年在江苏南通S. suis 2造成病死猪10万余头，人群感染25例；2005年四川省S. suis 2造成死亡猪几千头，人群感染208例。同期广东、香港也有病例报导。猪链球菌病已成为泰国的重要传染病，也是香港引起脑膜脑炎的第三大病原（仅次于肺炎链球菌和结核分枝杆菌）和越南引起脑膜脑炎的第一大病原。0003 目前猪链球菌的检测方法主要有微生物学方法、免疫学方法和分子生物学方法等。在显微镜下猪链球菌呈圆形或椭圆形，常呈链状排列，长短不一，革兰氏染色阳性。猪链球菌在加有血液或血清的培养基中生长良好，在琼脂平板上培养可见表面光滑整齐的白色菌落。多数致病性猪链球菌具。
8、有溶血能力，在血平板上呈溶血。微生物学方法检测方法操作过程比较繁琐，对操作人员要求较高，耗时且灵敏度较低。免疫学的检测方法包括血清凝集实验、酶联免疫吸附实验和协同凝集实验，这类方法对操作人员要求较高，耗时。近年来分子生物学的检测方法的发展较大程度上提高了病原检测的特异性和灵敏度，如特异性的核酸探针和PCR检测方法。然而，该类方法需要仪器设备，检测耗时，无法满足快速检测的需求。0004 环介导等温扩增 （loop-mediated isothermal amplication，LAMP）是一种新型的核酸等温扩增技术， 该技术针对靶基因的6个区域设计6条特异引物， 利用一种链置换DNA聚合酶(Bs。
9、t DNA polymerase)，在6065恒温条件下反应几十分钟即可完成核酸扩增反应， 扩增出LAMP特征性梯状条带。在LAMP反应结束后加入荧光染料，可直接通过颜色变化来判定反应结果。LAMP技术在保持PCR技术优点的基础上，进一步增强了反应的特异性并缩短了检测时间； 特别是它不需使用昂贵的热循环仪，在等温条件下就能完成反应，且扩增产物用肉眼能观察，可用于病原微生物的现场快速检测。已广泛应用于细菌、寄生虫、转基因作物领域的检测，并取得了较理想的效果。适合基层推广检测；符合疾病检测的快速、准确的诊断需要。0005 通过检索有以下专利申请，CN1896279A公开了一种PCR法检测猪链球菌2。
10、型的方法，其中同时使用了3对引物进行PCR扩增，该方法需要PCR仪，只能在菌浓度为450个/mL以上时具有阳性结果。CN102605046A公开了一种试剂盒和检测猪链球菌2型的方法，该说 明 书CN 104404132 A2/5页4试剂盒包括上游引物、下游引物和探针，所述上游引物的5端和/或所述下游引物的5端被生物素修饰；所述探针的5端和/或3端被地高辛修饰；所述探针能够与所述双链DNA扩增产物中带有生物素修饰的单链DNA杂交，该方法特异性较强，但该方法操作复杂、检测耗费时间长，且其灵敏度具有很大的改进空间。CN103409546A公布了一种检测猪链球菌的试剂盒及应用，包括了细菌基因组DNA提。
11、取、CPS2J基因的LAMP扩增和电泳检测。所述的检测试剂盒所针对的检测靶CPSCPS2J基因的部分核酸序列存在于其他种属的细菌中，针对该靶点建立的猪链球菌2型检测方法的准确性受到影响。同时，所述的检测方法需要提取样本的基因组才能进行检测，耗时较长。发明内容0006 本发明的目的是在于提供了一种猪链球菌2型的SS2-LAMP检测试剂盒，能快速检测食品中或者动物携带的猪链球菌2型。与PCR检测方法相比，SS2-LAMP检测方法提高了检测的灵敏度并减少了检测时间。同时，在检测靶点的选择上进行了创新，SS2-LAMP检测方法与生物信息学结合，编写基因组比对程序高通量筛选出猪链球菌2型基因组中特有的靶。
12、序列，并设计相应的特异性引物，极大提高检测的准确性。此外，SS2-LAMP检测试剂盒不需要基因组提取步骤，提高检测效率降低检测成本。0007 本发明的另一个目的是在于提供了一种猪链球菌2型的LAMP试剂盒在食品、动物疫病和卫生检测中的应用，该方法简单易行，不需要提取基因组，节省时间，降低成本。检测过程不需要PCR仪和检测的设备，只需要能够设定温度的水浴锅，对设备依赖程度低，反应时间短，仅需要1小时可以完成整个检测过程，灵敏度高，能检测到fg级别的核酸。0008 为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：一种猪链球菌2型的SS2-LAMP检测试剂盒，借助生物信息学的方法，编写基因组比对程序，发。
13、掘了一段猪链球菌2型的特有序列，猪链球菌2型的SS2-LAMP检测试剂盒，包括猪链球菌前处理液和LAMP反应试剂，其特征包括引物组SS21-FIP引物的核酸序列如SEQ ID NO.1所示、SS21-BIP引物的核酸序列如SEQ ID NO. 2所示、SS21-F3引物的核酸序列如SEQ ID NO. 3所示、SS21-B3引物的核酸序列如SEQ ID NO. 3所示、SS21-F3引物的核酸序列如SEQ ID NO. 4所示、SS21-LF引物的核酸序列如SEQ ID NO. 5所示、SS21-LB引物的核酸序列如SEQ ID NO. 6所示。0009 所述的试剂盒还包括以下组分：(1)前处。
14、理液(A液)：20 mM Tris-HCl；(2) LAMP反应液(B液)：20 mM Tris-HCl、10mM (NH4)2SO4、10mM KCl、2mM MgSO4、10M dNTPs、20mol/L SS21-FIP、20mol/L SS21-BIP、10mol/L SS21-F3、10mol/L SS21-B3、10mol/L SS21-LF and 10mol/L SS21-LB；(3) 聚合酶(C液)：3个酶活单位的Bst DNA聚合酶；(4) 显色液(D液)：含有10% （体积比）SYBR Green I 的荧光染料。0010 (5) 阳性对照样品为猪链球菌2型的基因组(P液。
15、)，阴性对照为无菌去离子水(N液)。0011 一种猪链球菌2型的LAMP试剂盒在食品、动物疫病（病原）和医疗卫生检测中的应用，采用上述试剂盒中的试剂进行检测，具体包括如下步骤：说 明 书CN 104404132 A3/5页5(1)前处理：将从疑似被猪链球菌2型污染的生猪肉、猪内脏、肉制品、或其他食品以及疑似感染动物的组织、血液或脑脊液中划线分离到的疑似菌落，或者增菌液进行离心集菌。将菌落或离心得到的菌体加入50 L前处理液(A液)中振荡混匀，再于100中水浴10分钟，完成待检样品前处理。0012 (2)猪链球菌2型的LAMP扩增：步骤1.根据待测样品个数，设置LAMP反应管数N，N=样品个数+。
16、2（含有1管阳性对照和1管阴性对照）；步骤2.将含有LAMP反应液(B液)的反应管取出，加入1 L Bst DNA聚合酶，混匀；步骤3.依次向反应管中分别加入1 L阴性对照(N液)、待检样品和阳性对照基因组(P液) ，盖紧管盖并做好相应标记；步骤4.在55-65摄氏度下恒温反应30-50分钟均可。0013 (3)结果判读：两种判定方法选其一则可。0014 (3.1)显色反应：取出LAMP反应管，依次加入1 L 显色液(D液)，盖紧管盖，混匀后肉眼直接观察颜色变化或者用紫外灯观察颜色变化。在正常日光条件下呈绿色的为阳性反应，橙红色的为阴性反应。在紫外灯下发出强烈绿色荧光的为阳性反应，不能发出荧光。
17、的为阴性反应。0015 (3.2)电泳检测：从LAMP反应管中取出2 L样品直接点样于0.8%（质量体积比）的琼脂糖凝胶中，80V-120V电泳30-40分钟后可在凝胶成像系统中观察LAMP的梯状条形带。得到梯状条形带则判断为阳性，没有条形带则为阴性。0016 所述的食品主要是疑似受到猪链球菌2型污染的猪肉类食物，包括生猪肉、猪内脏、以及腊肉、熏肉、灌肠等各种猪肉制品。0017 所述的动物为疑似受到猪链球菌2型感染的猪和人及其他动物。0018 与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1) 准确性高：本发明基于生物信息学筛选出来的特异性核酸靶点建立检测方法，基于特异性靶点设计的特异性引物准确度更高。
18、。0019 (2) 快速高效：本发明建立的试剂盒不需要提取基因组，经过前处理液处理10分钟后直接用于LAMP反应过程，前期处理样品、扩增反应和显色反应全过程最短只需要50min即可完成。对恒温仪器的精密度要求低，可在55-65度间均能良好扩增。0020 (3) 操作简便：本发明建立的试剂盒不需要提取基因组，并将各种试剂配制成为预反应液，整个过程不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，检测结果肉眼可见，操作流程非常简便，对检测人员的技术素质要求较低。0021 本发明适合快速检测医疗卫生、动物疫病或食品安全领域中的猪链球菌2型。附图说明0022 图1A、1B、1C为一种猪链球菌2型不同浓度基因组的LAM。
19、P检测示意图。0023 M. Marker；N. 阴性对照；1. 100pg猪链球菌2型基因组；2. 10pg猪链球菌2型基因组；3. 1pg猪链球菌2型基因组；4. 100fg猪链球菌2型基因组. 5：10fg猪链球菌2型基因组。0024 图1A 为一种琼脂糖凝胶电泳分析LAMP反应产物示意图；说 明 书CN 104404132 A4/5页6图1B为一种LAMP反应产物中加入显色液后在正常光线下的结果示意图；图1C为一种LAMP反应产物在紫外灯下显示结果示意图。0025 图2A、2B、2C为一种猪链球菌2型不同菌液浓度LAMP反应产物检测示意图。0026 M. Marker；N. 阴性对照；。
20、1. 8*106cfu /L猪链球菌2型；2. 8*105cfu /L猪链球菌2型；3. 8*104 cfu /L. 4. 8*103cfu /L猪链球菌2型. 5：8*102cfu /L猪链球菌2型。图1A 为琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物；图1B为扩增产物中加入显色液后在正常光线下的结果；图1C为反应产物在紫外灯下显示结果。0027 图3A、3B、3C为一种扩增反应可在5565下进行示意图。0028 M. Marker；N. 阴性对照；1. 55；2. 59；3. 61；4. 63；5：65。图1A 为琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物；图1B为扩增产物中加入显色液后在正常光线下的结果；图1C为反应产。
21、物在紫外灯下显示结果。具体实施方式0029 以下结合具体实例，进一步阐明本发明，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。0030 实施例1：一种猪链球菌2型的SS2-LAMP检测试剂盒，它由以下组分组成：猪链球菌2型的SS2-LAMP检测试剂盒，包括LAMP引物组、反应液、Bst DNA聚合酶、阳性对照和阴性对照。0031 (1) LAMP引物设计：针对猪链球菌2型的特异性基因，设计猪链球菌2型的特异性检测引物。0032 (2) LAMP扩增反应液的配制：20 mM Tris-HCl、10mM (NH4)2SO4、10mM KCl、2mM MgSO4、10M dNTPs、20。
22、mol/L SS21-FIP、20mol/L SS21-BIP、10mol/L SS21-F3、10mol/L SS21-B3、10mol/L SS21-LF and 10mol/L SS21-LB、1 L Bst DNA聚合酶和显色液(SYBR Green I)。0033 (3) 扩增反应: 依次向反应体系中加入阴性对照(ddH2O)和不同浓度待检测的基因组(100pg10fg)在55或57或59或61或63或65摄氏度下恒温反应30或40或50分钟均可。0034 实施例2：一种猪链球菌2型的SS2-LAMP试剂盒在食品、动物疫病（病原）、医疗卫生检测中的应用，其步骤是：(1)前处理：将从疑。
23、似被猪链球菌2型污染的生肉、肉制品、或其他食品以及疑似感染动物的组织、血液或脑脊液中划线分离到的疑似菌落，或者增菌液进行离心集菌。将菌落或离心得到的菌体加入含有50 L前处理液(A液)的管1(前处理管)中振荡混匀，再于100中水浴10分钟，完成待检样品的前处理。0035 (2) LAMP扩增：步骤1.根据待测样品个数，设置LAMP反应管数N，N=样品个数+2（含有1管阳性对照和1管阴性对照）；步骤2.将含有LAMP反应液(B液)的管2 (反应管)的取出，加入1 L Bst DNA聚说 明 书CN 104404132 A5/5页7合酶，混匀；步骤3.依次向反应管中分别加入1 L N液 (阴性对照。
24、)、待检样品和P液 (阳性对照)，盖紧管盖并做好相应标记；步骤4.在55或57或60或63或65摄氏度下恒温反应30或40或50分钟均可。0036 (3)结果判读：两种判定方法选其一则可。0037 (3.1)显色反应：取出管2（LAMP反应管），依次加入1 L D液 (显色液)，盖紧管盖，混匀后肉眼直接观察颜色变化或者用紫外灯观察颜色变化。在正常日光条件下呈绿色的为阳性反应，橙红色的为阴性反应。在紫外灯下发出强烈绿色荧光的为阳性反应，不能发出荧光的为阴性反应。0038 (3.2)电泳检测：从管2(LAMP反应管)中取出2 L样品直接点样于0.8%（质量体积比）的琼脂糖凝胶中，80或90或100。
25、或110或120V电泳30或33或35或38或40分钟后可在凝胶成像系统中观察LAMP的梯状条形带。得到梯状条形带则判断为阳性，没有条形带则为阴性。0039 上述的一种猪链球菌2型的SS2-LAMP试剂盒在各种疑似受到猪链球菌2型污染的生猪肉、猪内脏、以及腊肉、熏肉、灌肠等各种猪肉制品中检测，其他疑似被污染的食品都可以通过该方法进行检测，检测的是病原。0040 上述的一种猪链球菌2型的SS2-LAMP试剂盒在疑似被猪链球菌2型感染的猪和人可以检测，检测的是病原。说 明 书CN 104404132 A1/2页8SEQUENCE LISTING华中农业大学一种猪链球菌2型的LAMP检测试剂盒及应用。
26、一种猪链球菌2型的LAMP检测试剂盒及应用6PatentIn version 3.1150DNA猪链球菌2型1ccatagtagc aatatcgcga atagtatttg cacattatcg agctattagc 50245DNA猪链球菌2型2acagctcaaa gaacaaatca gatggacctg aataagaggc ttctc 45323DNA猪链球菌2型3ccaaatgtaa ggatagaaca tca 23424DNA猪链球菌2型4ggtgcatgta taacattaca atca 24525DNA猪链球菌2型5ttgttttata aattaattgc tcttg 25622序 列 表CN 104404132 A2/2页9DNA猪链球菌2型6ctcattgaat ctggcgtgga ta 22序 列 表CN 104404132 A1/2页10图1A图1B图1C图2A图2B图2C说 明 书 附 图CN 104404132 A10。