白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201410781780.8	申请日：	2014.12.16
公开号：	CN104480184A	公开日：	2015.04.01
当前法律状态：	终止	有效性：	无权
法律详情：	未缴年费专利权终止IPC(主分类):C12Q 1/02申请日:20141216授权公告日:20160831终止日期:20161216\|\|\|授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/02申请日:20141216\|\|\|公开
IPC分类号：	C12Q1/02	主分类号：	C12Q1/02
申请人：	甘肃农业大学
发明人：	刘自刚; 张树娟; 孙万仓; 李学才; 方彦; 武军艳; 杨刚; 王月; 王凯音; 刘林波; 侯献飞; 马骊; 钱武; 杨建胜; 刘海卿
地址：	730070甘肃省兰州市安宁区营门村1号
优先权：
专利代理机构：	兰州振华专利代理有限责任公司62102	代理人：	张真
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内容摘要

本发明特别涉及白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法及其白菜型油菜花粉离体萌发培养液。一种白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其主要特点在于包括以下步骤：1）花粉采集：2）花粉离体萌发及花粉管生长；3）花粉活力的测定。本发明的优点是使用本发明提供的白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基，以BK为溶剂，包含组分有50 g·L-1 聚乙二醇6000、150 g·L-1 蔗糖、2mg·L-1赤霉素、10mg·L-1维生素B1，pH为6.5，35℃光照条件下培养，白菜型油菜花粉萌发率可达到75.3%，花粉管也能得到较好生长；由于添加了PEG，白菜型油菜花粉管生长较直，便于观察测量。

权利要求书

权利要求书
1.  一种白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)花粉采集：
选取发育正常、无病虫危害的健壮白菜型油菜植株，于白菜型油菜盛花期选取已开花的花序，收集花粉；
2)花粉离体萌发及花粉管生长：
将花粉均匀播种在白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基上，30℃～40℃恒温培养；pH 为6.0～7.0；
花粉离体萌发培养15min～25min后部分花粉开始萌发，花粉萌发后花粉管长度超过花粉粒直径，花粉管开始快速生长；
3)花粉活力的测定:
离体培养45min～1h后，以花粉管长度大于花粉粒直径为花粉萌发标准，每处理重复3 次，每重复随机观察3～5个视野，每视野观察花粉数30～80粒，统计花粉萌发率，花粉萌发率反应有生活力花粉所占比例。

2.  如权利要求1所述的白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其特征在于步骤还包括有：
4)用LeicaDM6000B全自动正置显微镜系统自带测微尺测量花粉管长度，每视野随机测量10～15个花粉，每处理共测30～40个花粉管长度，计算其平均值，花粉离体萌发花粉管生长情况反应花粉粒生理状况的优劣。

3.  如权利要求1所述的白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其特征在于所述的白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基，以BK为溶剂，其包含的组分有50g·L-1～100g·L-1的PEG 6000(聚乙二醇6000)、130g·L-1～150g·L-1的蔗糖、1.5mg·L-1～2.5mg·L-1的赤霉素和8.5m g·L-1～10mg·L-1的维生素B1，pH为6.0～7.0。

4.  如权利要求3所述的白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其特征在于所述的BK的组成为：H3BO3100mg·L-1、Ca(NO3)2·4H2O 300mg·L-1、MgSO4·7H2O 200mg·L-1和KNO3100mg·L-1。以蒸馏水为溶剂。

说明书

说明书白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法
技术领域
本发明属于植物花粉活力测定技术领域，特别涉及一种白菜型油菜花粉的离体萌发液体培养基，以及利用该白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基测定白菜型油菜花粉活力的方法。
背景技术
白菜型油菜(Brassica rapa L.)为芸薹属作物二倍体基本种之一，早熟、耐寒而且类型丰富，是我国栽培油菜的三大类型之一。白菜型油菜植株一般比较矮小，主根较发达或不发达，侧根中等或发达。叶基部全抱茎。花淡黄至深黄，花瓣圆形、较大，开花时花瓣侧迭或呈覆瓦状；花序中间花蕾低于开放的花朵；花药外向开裂。油菜花艳美蛟丽，能美化环境，有较高的观赏价值，并含有丰富的花蜜，是发展养蜂业的良好蜜源。
油菜是经济价值极高的作物，用油菜籽榨出的菜籽油，含有丰富的脂肪酸和多种维生素，营养丰富，易于消化，是较理想的食用植物油。随着近代育种技术的提高，菜籽油的油质随之得到提高，低毒低芥酸的新品种，逐渐被推广开来，用途也越来越广泛。冶金、机械、橡胶、化工、油漆、制皂、医药等工业，都把菜籽油作为原料。油渣俗称菜子饼，富含蛋白质、粗脂肪、氨基酸和矿物质元素，是上等有机肥料。菜子饼经过脱毒处理，还是极好的牲畜精饲料。油菜的菜杆、枝叶、果壳等，含3％以上的粗蛋白质、0.5％左右的粗脂肪以及少量糖类物质，埋于土中，转化为有机质，可肥田养地，被农民称做“嫩茬”，也可粉碎成饲料，用来发展养畜业。另外，油菜花粉，颗大质优，是上等营养品，被人称做“长寿者的最佳食品”
鉴于白菜型油菜花粉作为白菜型油菜遗传资源的主要载体，因此，进行白菜型油菜花粉活力测定的研究，对白菜型油菜种质资源保存与创新、优良品种的选育具有非常重要的理论和实践意义。目前，花粉活力测定的方法主要有显微镜形态观察法、无机酸检测法、染色法、田间授粉检测法、离体萌发法等。
形态观察法是依据不育花粉在生长过程中由于受到某些因素的影响，发育不完全或不良的花粉粒形态常常呈畸形，而正常花粉有规则的外形。白菜型油菜正常花粉为椭圆形，而不育花粉呈不规则形，根据形态可以鉴别花粉生活力。然而，贮藏一段时间的白菜型油菜成熟花粉，贮藏过程中花粉活力会逐渐下降，由于白菜型油菜正常花粉在贮藏过程中活力可能丧失，但形态并不发生明显变化；从而使得花粉粒形态观察法就不能鉴别贮藏后正常花粉活力变化情况。
无机酸法是靠经过无机酸处理后，花粉会出现萌发孔有膨胀外突起的现象来判断花粉是否有活力，但花粉吸水后也会出现此现象，采用无机酸不能判断花粉是否真正具有活力。
染色法是通过使用染色试剂对花粉粒进行染色，依据颜色变化判断花粉活力的高低，常用的染色试剂有I2-KI溶液、醋酸洋红和氯化三苯基四氮唑(TTC)等。而染色法测定花粉活力实验重复性较差，会造成很大的实验误差，也不能准确测定花粉的实际活力高低。
田间授粉法是根据果实和种子的形成情况来判断花粉生活力，虽然与实际生产最为接近，反映最终的结实率，但其时间周期长，工作量大，并且易受到天气条件、时间地点的影响，不利于生产，实际应用中采用较少。
花粉离体萌发与花粉管生长测定结果较为稳定，更能反应花粉活力的实际状况。但花粉离体萌发需要适宜的培养基，常用的培养基基本成分是糖和硼，蔗糖浓度一般为10％～20％，硼酸为0.001％～0.005％，pH 5.5～6.5。
不同植物花粉萌发需要的培养基种类和浓度不同，二核型花粉较易萌发，在一般基本培养基上培养即可，而三核型花粉较难萌发，要在基本培养基的基础上添加其它促进花粉萌发的元素，如Ca2+，Mg2+，K+，PEG等成分。近年来，人们对十字花科植物花粉离体萌发和花粉管生长进行了较多研究，宋红霞等(PEG对胡萝卜花粉离体萌发的影响，2011(06)：22-24. 长江蔬菜；胡萝卜花粉离体萌发研究，2010,38(4)：25-27，山西农业科学)认为PEG6000 对胡萝卜花粉离体萌发生长具有显著促进作用，且硼酸、Ca2+对胡萝卜花粉萌发有促进作用；曹毅等报道了(甘蓝型油菜花粉离体培养，2010，30(2)：0399-0404，西北植物学报)甘蓝型油菜花粉离体萌发的适宜培养基，赵艳玲等(萝卜离体花粉萌发与花粉管生长影响因子研究，2007年第一期，江苏农业科学)研究了萝卜离体花粉萌发与花粉管生长的影响因子。然而，关于白菜型油菜花粉离体萌发与花粉管生长的研究国内外尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于，为避免现有技术的不足，提供一种白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法。在确定白菜型油菜花粉离体萌发培养体系的基础上，对白菜型油菜花粉离体培养，可靠、有效的测定白菜型油菜花粉活力。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其主要特点在于包括以下步骤：
1)花粉采集：
选取发育正常、无病虫危害的健壮白菜型油菜植株，于白菜型油菜盛花期选取已开花的花序，收集花粉；
2)花粉离体萌发及花粉管生长：
将花粉均匀撒在白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基上，30℃～40℃恒温培养；pH为 6.0～7.0；
花粉离体萌发培养15min～25min后部分花粉开始萌发，花粉萌发后花粉管长度超过花粉粒直径，花粉管开始快速生长；
3)花粉活力的测定:
离体培养45min～1h后，以花粉管长度大于花粉粒直径为花粉萌发标准，每处理重复3 次，每重复随机观察3～5个视野，每视野观察花粉数30～80粒，统计花粉萌发率，花粉萌发率反应有生活力花粉所占比例。
所述的白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其特征在于步骤还包括有：
4)用LeicaDM6000B全自动正置显微镜系统自带测微尺测量花粉管长度，每视野随机测量10～15个花粉，每处理共测30～40个花粉管长度，计算其平均值，花粉离体萌发花粉管生长情况反应花粉粒生理状况的优劣。
所述的白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，所述的白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基，以BK为溶剂，其包含的组分有50g·L-1～100g·L-1的PEG 6000(聚乙二醇6000)、130g·L-1～150g·L-1的蔗糖、1.5mg·L-1～2.5mg·L-1的赤霉素和8.5m g·L-1～10mg·L-1的维生素B1，pH为6.0～7.0。
所述的白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，所述的BK的组成为： H3BO3(硼酸)100mg·L-1、Ca(NO3)2·4H2O(硝酸钙)300mg·L-1、MgSO4·7H2O(结晶硫酸镁)200mg·L-1和KNO3(硝酸钾)100mg·L-1。以蒸馏水为溶剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1、白菜型油菜花粉在本发明提供的白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基上，35℃光照条件下培养，白菜型油菜花粉萌发率可达到75.3％，花粉管也能得到较好生长；由于添加了PEG，白菜型油菜花粉管生长较直，便于观察测量。
2、利用白菜型油菜花粉离体萌发与花粉管生长测定技术测定花粉活力测定结果稳定可靠，花粉萌发率反应有生活力花粉所占比例，花粉管生长的观察与测量反应花粉粒生理状况的优劣，白菜型油菜花粉离体萌发与花粉管生长测定技术为白菜型油菜花粉活力的测定提供了一种可靠、有效的方法.
附图说明：
图1.白菜型油菜花粉离体萌发生长随培养时间的变化情况
图2.为pH6.5时，白菜型油菜花粉在BK+150g·L-1的蔗糖+50g·L-1的PEG6000+2mg ·L-1的赤霉素+10m g·L-1的维生素B1(35℃恒温)培养基上萌发40min后采集的照片示意图。
图3.为pH6.5时，白菜型油菜花粉在BK+150g·L-1的蔗糖+50g·L-1的PEG6000+2mg ·L-1的赤霉素+10m g·L-1的维生素B1(35℃恒温)培养基上萌发50min后采集的照片示意图。
图4.为pH6.5时，白菜型油菜花粉在BK+150g·L-1的蔗糖+50g·L-1的PEG6000+2mg ·L-1的赤霉素+10m g·L-1的维生素B1(35℃恒温)培养基上萌发1h后采集的照片示意图。
具体实施方式
以下结合附图所示之最佳实例作进一步详述：
实施例1：见图1，一种白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其主要特点在于包括以下步骤：
1)花粉采集：
选取发育正常、无病虫危害的健壮白菜型油菜植株，于白菜型油菜盛花期选取已开花的花序，收集花粉；
2)花粉离体萌发及花粉管生长：
将花粉均匀撒在白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基上，30℃恒温培养；pH为6.0；
花粉离体萌发培养15min后部分花粉开始萌发，花粉萌发后花粉管长度超过花粉粒直径，花粉管开始快速生长；
3)花粉活力的测定:
离体培养45min后，以花粉管长度大于花粉粒直径为花粉萌发标准，每处理重复3次，每重复随机观察3个视野，每视野观察花粉数不少于30粒，统计花粉萌发率，花粉萌发率反应有生活力花粉所占比例。
4)用LeicaDM6000B全自动正置显微镜系统自带测微尺测量花粉管长度，每视野随机测量10个花粉，每处理共测30个花粉管长度，计算其平均值，花粉离体萌发花粉管生长情况反应花粉粒生理状况的优劣。
实施例2：一种白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其主要特点在于包括以下步骤：
1)花粉采集：
选取发育正常、无病虫危害的健壮白菜型油菜植株，于白菜型油菜盛花期选取已开花的花序，收集花粉；
2)花粉离体萌发及花粉管生长：
将花粉均匀撒在白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基上，35℃恒温培养；pH为6.5；
花粉离体萌发培养20min后部分花粉开始萌发，花粉萌发后花粉管长度超过花粉粒直径，花粉管开始快速生长；
3)花粉活力的测定:
离体培养50min后，以花粉管长度大于花粉粒直径为花粉萌发标准，每处理重复3次，每重复随机观察4个视野，每视野观察花粉数不少于50粒，统计花粉萌发率，花粉萌发率反应有生活力花粉所占比例。
4)用LeicaDM6000B全自动正置显微镜系统自带测微尺测量花粉管长度，每视野随机测量12个花粉，每处理共测35个花粉管长度，计算其平均值，花粉离体萌发花粉管生长情况反应花粉粒生理状况的优劣。
实施例3：一种白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其主要特点在于包括以下步骤：
1)与实施例1相同。
2)花粉离体萌发及花粉管生长：
将花粉均匀撒在白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基上，40℃恒温培养；pH为7.0；
花粉离体萌发培养25min后部分花粉开始萌发，花粉萌发后花粉管长度超过花粉粒直径，花粉管开始快速生长；
3)花粉活力的测定:
离体培养1h后，以花粉管长度大于花粉粒直径为花粉萌发标准，每处理重复3次，每重复随机观察5个视野，每视野观察花粉数80粒，统计花粉萌发率，花粉萌发率反应有生活力花粉所占比例。
4)用LeicaDM6000B全自动正置显微镜系统自带测微尺测量花粉管长度，每视野随机测量15个花粉，每处理共测40个花粉管长度，计算其平均值，花粉离体萌发花粉管生长情况反应花粉粒生理状况的优劣。
实施例4：所述的白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基，以BK为溶剂，其还包含组分有 50g·L-1的PEG 6000(聚乙二醇6000)、130g·L-1的蔗糖、1.5mg·L-1的赤霉素和8.5m g·L-1的维生素B1，pH为6.0。
其中BK的组成为：H3BO3(硼酸)100mg·L-1、Ca(NO3)2·4H2O(硝酸钙)300mg·L-1、 MgSO4·7H2O(结晶硫酸镁)200mg·L-1和KNO3(硝酸钾)100mg·L-1。以蒸馏水为溶剂。
实施例5：所述的白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基，以BK为溶剂，其包含组分有 80g·L-1的PEG 6000(聚乙二醇6000)、100g·L-1的蔗糖、2.0mg·L-1的赤霉素和9m g·L-1的维生素B1，pH为6.5。
其中BK的成分如实施例4.
实施例6：所述的白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基，以BK为溶剂，其包含组分有 100g·L-1的PEG 6000(聚乙二醇6000)、150g·L-1的蔗糖、2.5mg·L-1的赤霉素和10mg·L-1的维生素B1的BK培养液，pH为7.0。
其中BK的成分如实施例4.
实验验证例：一种白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，
1、白菜型油菜花粉的采集
白菜型油菜花粉于某年10月初采自甘肃农业大学干旱生境重点实验室，采集方法为：选取发育正常、无病虫危害的健壮植株，于盛花期选取已开花的花序，花蕾自然开放，花粉从花药中散出，收集花粉备用。
2、花粉离体萌发培养条件的筛选：
2.1花粉离体萌发培养基的筛选:
培养基种类对植物花粉离体萌发有较大影响，不同植物花粉萌发的适宜培养基不同。以 BK培养基为基本培养基，在其基础上依次筛选合适浓度的PEG6000，蔗糖，GA3和VB1，最后调节合适的pH。
BK的组成为(mg·L-1)：H3BO3100mg·L-1、Ca(NO3)2·4H2O 300mg·L-1、MgSO4·7H2O 200 mg·L-1和KNO3100mg·L-1。以蒸馏水为溶剂。
2.2PEG浓度筛选
PEG6000是一种高分子量化合物，主要起到渗透调节作用。把新鲜花粉分别均匀散布在添加了0g·L-1、50g·L-1、100g·L-1、150g·L-1、200g·L-1的PEG6000的BK培养基(BK培养基是液体；这里的0g·L-1代表不添加PEG的BK培养基。没有再往BK中添加蒸馏水)中，
具体操作如下：(1)用1mol/L的NaOH调节上述不同PEG浓度培养基的pH至7.0；(2) 用移液枪吸取70μL培养基，轻轻滴在载玻片上形成球面状液滴，将两个雄蕊上的花粉播种在球面培养基上，播种时不要搅动培养基，以免花粉粒沉入液体培养基底部，在萌发过程中由于缺氧而影响实验结果，最好是将花粉粒均匀的铺在培养基上；(3)将上述载玻片放入铺有两层湿润滤纸(保持一定的湿度，避免萌发时间太久培养基蒸发)的培养皿中，不加盖玻片(以确保花粉萌发过程中有充足的氧气)，盖紧培养皿盖子于35℃培养箱中培养1h后在显微镜下观察统计萌发数及花粉管长度。(4)以花粉管长度大于花粉粒直径为花粉萌发标准，每处理重复3次，每重复随机观察3个视野，每视野观察花粉数不少于30粒，统计花粉萌发率；同时用LeicaDM6000B全自动正置显微镜系统自带测微尺测量花粉管长度，每视野随机测量10个花粉，每处理共测30个花粉管长度，计算其平均值。试验重复三次。
结果如表1所示，BK培养基中加入不同浓度的PEG6000，可明显提高白菜型油菜花粉萌发率，其中添加50g·L-1PEG6000效果最为显著，花粉萌发率达到41.8％；低浓度PEG(50～ 150g·L-1)促进花粉管生长，且随浓度增加，促进作用逐渐减弱，高浓度PEG(大于200g·L-1) 抑制花粉管生长；在显微观察时还发现，在添加了低浓度PEG的培养基中，白菜型油菜花粉管生长较直，而未加PEG或加了高浓度PEG的培养基花粉管生长弯曲，常交织在一起，不便观察测量。
表1 不同浓度PEG对花粉萌发生长的影响

2.3蔗糖浓度试验
蔗糖是一种渗透调节物质，同时也是花粉管生长的能源物质。在50g·L-1PEG6000+BK 的培养基中分别增加100g·L-1、150g·L-1、200g·L-1、250g·L-1的蔗糖，比较不同浓度的蔗糖对花粉萌发和花粉管生长的影响。
结果如表2所示，BK+50g·L-1PEG培养基中不同浓度蔗糖对白菜型油菜花粉萌发率和花粉管生长影响不同，低浓度蔗糖(150g·L-1)对花粉萌发和花粉管生长具有明显促进作用，而高浓度的蔗糖(≥200g·L-1)可明显抑制花粉萌发和花粉管生长，且随着蔗糖浓度的增加，受到抑制程度越明显。在含有150g·L-1蔗糖的BK+50g·L-1PEG培养基上白菜型油菜花粉生长最好，培养1h后，其花粉萌发率和花粉管长度分别达到65.1％和91.1μm。
表2 不同浓度蔗糖对花粉萌发生长的影响

2.4GA3浓度试验
赤霉素能抑制植物体内生长素分解系统的活动,以保证体内生长素含量水平的相对增加，一定浓度的外源赤霉素处理能促进花粉萌发和花粉管生长。在BK+50g·L-1PEG6000+150g·L-1蔗糖培养基中分别增加1mg·L-1、2mg·L-1、3mg·L-1的GA3，检测不同浓度的GA3对白菜型油菜花粉萌发和花粉管生长的影响。
结果如表3所示，不同浓度的GA3对白菜型油菜花粉萌发和花粉管生长的影响不同，低浓度GA3(2mg·L-1)对花粉萌发和花粉管生长具有明显促进作用，而GA3的浓度过低或过高都不利于花粉萌发和花粉管生长。在含有2mg·L-1GA3的BK+50g·L-1PEG+150g·L-1蔗糖培养基上白菜型油菜花粉生长最好，培养1h后，其花粉萌发率和花粉管长度分别达到69.2％和 157.2μm。
表3 不同浓度GA3对花粉萌发生长的影响

2.5VB1浓度试验
前人研究表明，生理活性类物质维生素B1对花粉萌发速度有所提高，达到了快捷的目的。在BK+50g·L-1PEG6000+150g·L-1蔗糖+2mg·L-1GA3的培养基中分别增加5mg·L-1、 10mg·L-1、15mg·L-1的VB1，研究不同浓度的VB1对白菜型油菜花粉萌发和花粉管生长的影响。
结果如表4所示，不同浓度的VB1对白菜型油菜花粉萌发和花粉管生长的影响不同，在含有10mg·L-1VB1的在BK+50g·L-1PEG6000+150g·L-1蔗糖+2mg·L-1GA3培养基上白菜型油菜花粉生长最好，培养30min后，其花粉萌发率和花粉管长度分别达到58.4％和76.4μm。
表4 不同浓度VB1对花粉萌发生长的影响

2.6pH梯度试验
在pH分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的BK+50g·L-1PEG6000+150g·L-1蔗糖+2mg·L-1GA3+10mg·L-1VB1培养基上培养白菜型油菜新鲜花粉，检测培养基不同pH对白菜型油菜花粉萌发和花粉管生长的影响。
结果如表5所示，培养基pH值变化对白菜型油菜花粉萌发和花粉管生长均有显著影响， pH值在5.5～8.5范围内，随pH值的增加，花粉萌发率和花粉管长度均呈“单峰”曲线变化，即在pH值较小时花粉萌发率和花粉管长度随pH的升高而增加，pH 6.5时达到最大，之后开始下降。表明培养基H+浓度过高或过低均不利于白菜型油菜花粉萌发生长。
表5 不同pH值对花粉萌发生长的影响

2.7不同培养时间下白菜型油菜花粉离体萌发及花粉管生长：
将新鲜的白菜型油菜花粉匀撒上在pH为6.5的BK+50g·L-1PEG6000+150g·L-1蔗糖 +2mg·L-1GA3+10mg·L-1VB1的培养基上，置于底部垫有双层滤纸的培养皿中，盖紧培养皿盖子并放入恒温培养箱内35℃培养，培养后10min、15min、30min、45min、1h、2h、3h、4h 定时观测花粉管生长情况。
白菜型油菜花粉萌发生长情况如图1所示，其中，横坐标为培养时间，左边纵坐标表示花粉萌发率(％)，右边纵坐标表示花粉管长度(μm)；白菜型油菜花粉15min开始萌动，20min 花粉管从花粉孔中突出，30min花粉管长度已超过花粉粒直径，花粉管开始快速生长，在开始培养的1h随培养时间的延长桔梗花粉萌发率迅速提高，1h后多数有活力花粉均已萌发， 2h达到最大，之后萌发率不再增加；花粉管长度在初始培养的2h之前快速生长，之后花粉管生长逐渐停顿，3h花粉管生长交织在一起，花粉管顶端开始膨大，3.5h许多花粉管顶端破裂，内容物放出。
因此，在白菜型油菜花粉在pH为6.5的BK+50g·L-1PEG6000+150g·L-1蔗糖+2mg·L-1GA3+10mg·L-1VB1的培养基上，35℃恒温条件下离体培养2h后，测量花粉的萌发率和花粉管的长度，能够稳定有效的反应白菜型油菜花粉的活力。
本试验所用仪器：RQX人工气候箱，JY/YP电子天平，CAP型电子天平，PHS-3C型pH 计，LeicaDM6000B全自动正置显微镜。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410781780.8(22)申请日 2014.12.16C12Q 1/02(2006.01)(71)申请人甘肃农业大学地址 730070 甘肃省兰州市安宁区营门村 1号(72)发明人刘自刚张树娟孙万仓李学才方彦武军艳杨刚王月王凯音刘林波侯献飞马骊钱武杨建胜刘海卿(74)专利代理机构兰州振华专利代理有限责任公司 62102代理人张真(54) 发明名称白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法(57) 摘要本发明特别涉及白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法及其白菜型油菜花粉离体萌发培养液。一。

2、种白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其主要特点在于包括以下步骤：1）花粉采集：2）花粉离体萌发及花粉管生长；3）花粉活力的测定。本发明的优点是使用本发明提供的白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基，以 BK 为溶剂，包含组分有 50 gL-1 聚乙二醇 6000、150 gL-1 蔗糖、2mgL-1赤霉素、10mgL-1维生素 B1，pH 为 6.5，35光照条件下培养，白菜型油菜花粉萌发率可达到 75.3%，花粉管也能得到较好生长；由于添加了 PEG，白菜型油菜花粉管生长较直，便于观察测量。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求。

3、书1页说明书8页附图2页(10)申请公布号 CN 104480184 A(43)申请公布日 2015.04.01CN 104480184 A1/1 页21.一种白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其特征在于包括以下步骤：1) 花粉采集：选取发育正常、无病虫危害的健壮白菜型油菜植株，于白菜型油菜盛花期选取已开花的花序，收集花粉；2) 花粉离体萌发及花粉管生长：将花粉均匀播种在白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基上，30 40恒温培养；pH为 6.0 7.0 ；花粉离体萌发培养 15min 25min 后部分花粉开始萌发，花粉萌发后花粉管长度超过花粉粒直径，花粉管开始快速生长。

4、；3) 花粉活力的测定 :离体培养 45min 1h 后，以花粉管长度大于花粉粒直径为花粉萌发标准，每处理重复3 次，每重复随机观察 3 5 个视野，每视野观察花粉数 30 80 粒，统计花粉萌发率，花粉萌发率反应有生活力花粉所占比例。2.如权利要求 1 所述的白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其特征在于步骤还包括有：4) 用 LeicaDM6000B 全自动正置显微镜系统自带测微尺测量花粉管长度，每视野随机测量 10 15 个花粉，每处理共测 30 40 个花粉管长度，计算其平均值，花粉离体萌发花粉管生长情况反应花粉粒生理状况的优劣。3.如权利要求1所述的白菜型油菜花粉的离体。

5、萌发培养测定花粉活力的方法，其特征在于所述的白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基，以BK为溶剂，其包含的组分有 50gL-1 100gL-1的 PEG 6000( 聚乙二醇 6000)、130gL-1 150gL-1的蔗糖、1.5mgL-1 2.5mgL-1的赤霉素和 8.5m gL-1 10mgL-1的维生素 B1，pH 为 6.0 7.0。4.如权利要求 3 所述的白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其特征在于所述的BK的组成为：H3BO3100mgL-1、Ca(NO3)24 H2O 300mgL-1、MgSO47 H2O 200mgL-1和 KNO3100mgL-1。以蒸馏水为。

6、溶剂。权利要求书CN 104480184 A1/8 页3白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法技术领域0001 本发明属于植物花粉活力测定技术领域，特别涉及一种白菜型油菜花粉的离体萌发液体培养基，以及利用该白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基测定白菜型油菜花粉活力的方法。背景技术0002 白菜型油菜 (Brassica rapa L.) 为芸薹属作物二倍体基本种之一，早熟、耐寒而且类型丰富，是我国栽培油菜的三大类型之一。白菜型油菜植株一般比较矮小，主根较发达或不发达，侧根中等或发达。叶基部全抱茎。花淡黄至深黄，花瓣圆形、较大，开花时花瓣侧迭或呈覆瓦状；花序中间花蕾低于开放的花朵。

7、；花药外向开裂。油菜花艳美蛟丽，能美化环境，有较高的观赏价值，并含有丰富的花蜜，是发展养蜂业的良好蜜源。0003 油菜是经济价值极高的作物，用油菜籽榨出的菜籽油，含有丰富的脂肪酸和多种维生素，营养丰富，易于消化，是较理想的食用植物油。随着近代育种技术的提高，菜籽油的油质随之得到提高，低毒低芥酸的新品种，逐渐被推广开来，用途也越来越广泛。冶金、机械、橡胶、化工、油漆、制皂、医药等工业，都把菜籽油作为原料。油渣俗称菜子饼，富含蛋白质、粗脂肪、氨基酸和矿物质元素，是上等有机肥料。菜子饼经过脱毒处理，还是极好的牲畜精饲料。油菜的菜杆、枝叶、果壳等，含3以上的粗蛋白质、0.5左右的粗脂肪以及少量糖类物质。

8、，埋于土中，转化为有机质，可肥田养地，被农民称做“嫩茬”，也可粉碎成饲料，用来发展养畜业。另外，油菜花粉，颗大质优，是上等营养品，被人称做“长寿者的最佳食品”0004 鉴于白菜型油菜花粉作为白菜型油菜遗传资源的主要载体，因此，进行白菜型油菜花粉活力测定的研究，对白菜型油菜种质资源保存与创新、优良品种的选育具有非常重要的理论和实践意义。目前，花粉活力测定的方法主要有显微镜形态观察法、无机酸检测法、染色法、田间授粉检测法、离体萌发法等。0005 形态观察法是依据不育花粉在生长过程中由于受到某些因素的影响，发育不完全或不良的花粉粒形态常常呈畸形，而正常花粉有规则的外形。白菜型油菜正常花粉为椭圆形，而。

9、不育花粉呈不规则形，根据形态可以鉴别花粉生活力。然而，贮藏一段时间的白菜型油菜成熟花粉，贮藏过程中花粉活力会逐渐下降，由于白菜型油菜正常花粉在贮藏过程中活力可能丧失，但形态并不发生明显变化；从而使得花粉粒形态观察法就不能鉴别贮藏后正常花粉活力变化情况。0006 无机酸法是靠经过无机酸处理后，花粉会出现萌发孔有膨胀外突起的现象来判断花粉是否有活力，但花粉吸水后也会出现此现象，采用无机酸不能判断花粉是否真正具有活力。0007 染色法是通过使用染色试剂对花粉粒进行染色，依据颜色变化判断花粉活力的高低，常用的染色试剂有 I2-KI 溶液、醋酸洋红和氯化三苯基四氮唑 (TTC) 等。而染色法测定花粉活。

10、力实验重复性较差，会造成很大的实验误差，也不能准确测定花粉的实际活力高低。0008 田间授粉法是根据果实和种子的形成情况来判断花粉生活力，虽然与实际生产最说明书CN 104480184 A2/8 页4为接近，反映最终的结实率，但其时间周期长，工作量大，并且易受到天气条件、时间地点的影响，不利于生产，实际应用中采用较少。0009 花粉离体萌发与花粉管生长测定结果较为稳定，更能反应花粉活力的实际状况。但花粉离体萌发需要适宜的培养基，常用的培养基基本成分是糖和硼，蔗糖浓度一般为10 20，硼酸为 0.001 0.005，pH 5.5 6.5。0010 不同植物花粉萌发需要的培养基种类和浓度不同，。

11、二核型花粉较易萌发，在一般基本培养基上培养即可，而三核型花粉较难萌发，要在基本培养基的基础上添加其它促进花粉萌发的元素，如 Ca2+，M g2+，K+，PEG 等成分。近年来，人们对十字花科植物花粉离体萌发和花粉管生长进行了较多研究，宋红霞等 (PEG 对胡萝卜花粉离体萌发的影响，2011(06) ：22-24. 长江蔬菜；胡萝卜花粉离体萌发研究，2010,38(4) ：25-27，山西农业科学 ) 认为PEG6000 对胡萝卜花粉离体萌发生长具有显著促进作用，且硼酸、Ca2+对胡萝卜花粉萌发有促进作用；曹毅等报道了 ( 甘蓝型油菜花粉离体培养，2010，30(2) ：0399-0404，。

12、西北植物学报 ) 甘蓝型油菜花粉离体萌发的适宜培养基，赵艳玲等 ( 萝卜离体花粉萌发与花粉管生长影响因子研究，2007 年第一期，江苏农业科学 ) 研究了萝卜离体花粉萌发与花粉管生长的影响因子。然而，关于白菜型油菜花粉离体萌发与花粉管生长的研究国内外尚未见报道。发明内容0011 本发明的目的在于，为避免现有技术的不足，提供一种白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法。在确定白菜型油菜花粉离体萌发培养体系的基础上，对白菜型油菜花粉离体培养，可靠、有效的测定白菜型油菜花粉活力。0012 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其主要特点在。

13、于包括以下步骤：0013 1) 花粉采集：0014 选取发育正常、无病虫危害的健壮白菜型油菜植株，于白菜型油菜盛花期选取已开花的花序，收集花粉；0015 2) 花粉离体萌发及花粉管生长：0016 将花粉均匀撒在白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基上，30 40恒温培养；pH 为 6.0 7.0 ；0017 花粉离体萌发培养 15min 25min 后部分花粉开始萌发，花粉萌发后花粉管长度超过花粉粒直径，花粉管开始快速生长；0018 3) 花粉活力的测定 :0019 离体培养 45min 1h 后，以花粉管长度大于花粉粒直径为花粉萌发标准，每处理重复 3 次，每重复随机观察 3 5 个视。

14、野，每视野观察花粉数 30 80 粒，统计花粉萌发率，花粉萌发率反应有生活力花粉所占比例。0020 所述的白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其特征在于步骤还包括有：0021 4) 用 LeicaDM6000B 全自动正置显微镜系统自带测微尺测量花粉管长度，每视野随机测量 10 15 个花粉，每处理共测 30 40 个花粉管长度，计算其平均值，花粉离体萌发花粉管生长情况反应花粉粒生理状况的优劣。说明书CN 104480184 A3/8 页50022 所述的白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，所述的白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基，以 BK 为溶剂，其包含的组分有。

15、50gL-1 100gL-1的 PEG 6000( 聚乙二醇 6000)、130gL-1 150gL-1的蔗糖、1.5mgL-1 2.5mgL-1的赤霉素和 8.5m gL-1 10mgL-1的维生素 B1，pH 为 6.0 7.0。0023 所述的白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，所述的 BK 的组成为：H3BO3( 硼酸 )100mgL-1、Ca(NO3)24H2O( 硝酸钙 )300mgL-1、MgSO47H2O( 结晶硫酸镁 )200mgL-1和 KNO3( 硝酸钾 )100mgL-1。以蒸馏水为溶剂。0024 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：0025 。

16、1、白菜型油菜花粉在本发明提供的白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基上，35光照条件下培养，白菜型油菜花粉萌发率可达到 75.3，花粉管也能得到较好生长；由于添加了 PEG，白菜型油菜花粉管生长较直，便于观察测量。0026 2、利用白菜型油菜花粉离体萌发与花粉管生长测定技术测定花粉活力测定结果稳定可靠，花粉萌发率反应有生活力花粉所占比例，花粉管生长的观察与测量反应花粉粒生理状况的优劣，白菜型油菜花粉离体萌发与花粉管生长测定技术为白菜型油菜花粉活力的测定提供了一种可靠、有效的方法 .附图说明：0027 图 1. 白菜型油菜花粉离体萌发生长随培养时间的变化情况0028 图 2. 为 pH6.5 时。

17、，白菜型油菜花粉在 BK+150gL-1的蔗糖 +50gL-1的PEG6000+2mgL-1的赤霉素 +10m gL-1的维生素 B1(35恒温 ) 培养基上萌发 40min 后采集的照片示意图。0029 图 3. 为 pH6.5 时，白菜型油菜花粉在 BK+150gL-1的蔗糖 +50gL-1的PEG6000+2mgL-1的赤霉素 +10m gL-1的维生素 B1(35恒温 ) 培养基上萌发 50min 后采集的照片示意图。0030 图 4. 为 pH6.5 时，白菜型油菜花粉在 BK+150gL-1的蔗糖 +50gL-1的PEG6000。

18、+2mgL-1的赤霉素 +10m gL-1的维生素 B1(35恒温 ) 培养基上萌发 1h 后采集的照片示意图。具体实施方式0031 以下结合附图所示之最佳实例作进一步详述：0032 实施例 1 ：见图 1，一种白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法其主要特点在于包括以下步骤：0033 1) 花粉采集：0034 选取发育正常、无病虫危害的健壮白菜型油菜植株，于白菜型油菜盛花期选取已开花的花序，收集花粉；0035 2) 花粉离体萌发及花粉管生长：0036 将花粉均匀撒在白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基上，30恒温培养；pH 为6.0 ；0037 花粉离体萌发培养 15min 。

19、后部分花粉开始萌发，花粉萌发后花粉管长度超过花粉说明书CN 104480184 A4/8 页6粒直径，花粉管开始快速生长；0038 3) 花粉活力的测定 :0039 离体培养 45min 后，以花粉管长度大于花粉粒直径为花粉萌发标准，每处理重复 3次，每重复随机观察 3 个视野，每视野观察花粉数不少于 30 粒，统计花粉萌发率，花粉萌发率反应有生活力花粉所占比例。0040 4) 用 LeicaDM6000B 全自动正置显微镜系统自带测微尺测量花粉管长度，每视野随机测量 10 个花粉，每处理共测 30 个花粉管长度，计算其平均值，花粉离体萌发花粉管生长情况反应花粉粒生理状况的优劣。0041。

20、实施例 2 ：一种白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其主要特点在于包括以下步骤：0042 1) 花粉采集：0043 选取发育正常、无病虫危害的健壮白菜型油菜植株，于白菜型油菜盛花期选取已开花的花序，收集花粉；0044 2) 花粉离体萌发及花粉管生长：0045 将花粉均匀撒在白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基上，35恒温培养；pH 为6.5 ；0046 花粉离体萌发培养 20min 后部分花粉开始萌发，花粉萌发后花粉管长度超过花粉粒直径，花粉管开始快速生长；0047 3) 花粉活力的测定 :0048 离体培养 50min 后，以花粉管长度大于花粉粒直径为花粉萌发标准，每。

21、处理重复 3次，每重复随机观察 4 个视野，每视野观察花粉数不少于 50 粒，统计花粉萌发率，花粉萌发率反应有生活力花粉所占比例。0049 4) 用 LeicaDM6000B 全自动正置显微镜系统自带测微尺测量花粉管长度，每视野随机测量 12 个花粉，每处理共测 35 个花粉管长度，计算其平均值，花粉离体萌发花粉管生长情况反应花粉粒生理状况的优劣。0050 实施例 3 ：一种白菜型油菜花粉的离体萌发培养测定花粉活力的方法，其主要特点在于包括以下步骤：0051 1) 与实施例 1 相同。0052 2) 花粉离体萌发及花粉管生长：0053 将花粉均匀撒在白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基上，40。

22、恒温培养；pH 为7.0 ；0054 花粉离体萌发培养 25min 后部分花粉开始萌发，花粉萌发后花粉管长度超过花粉粒直径，花粉管开始快速生长；0055 3) 花粉活力的测定 :0056 离体培养1h后，以花粉管长度大于花粉粒直径为花粉萌发标准，每处理重复3次，每重复随机观察5个视野，每视野观察花粉数80粒，统计花粉萌发率，花粉萌发率反应有生活力花粉所占比例。0057 4) 用 LeicaDM6000B 全自动正置显微镜系统自带测微尺测量花粉管长度，每视野随机测量 15 个花粉，每处理共测 40 个花粉管长度，计算其平均值，花粉离体萌发花粉管生说明书CN 104480184 A5/8 。

23、页7长情况反应花粉粒生理状况的优劣。0058 实施例 4 ：所述的白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基，以 BK 为溶剂，其还包含组分有 50gL-1的 PEG 6000( 聚乙二醇 6000)、130gL-1的蔗糖、1.5mgL-1的赤霉素和 8.5m gL-1的维生素 B1，pH 为 6.0。0059 其中 BK 的组成为：H3BO3( 硼酸 )100mgL-1、Ca(NO3)24H2O( 硝酸钙 )300mgL-1、MgSO47H2O( 结晶硫酸镁 )200mgL-1和 KNO3( 硝酸钾 )100mgL-1。以蒸馏水为溶剂。0060 实施例 5 ：所述的白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基，。

24、以 BK 为溶剂，其包含组分有 80gL-1的 PEG 6000( 聚乙二醇 6000)、100gL-1的蔗糖、2.0mgL-1的赤霉素和 9m gL-1的维生素 B1，pH 为 6.5。0061 其中 BK 的成分如实施例 4.0062 实施例 6 ：所述的白菜型油菜花粉离体萌发液体培养基，以 BK 为溶剂，其包含组分有 100gL-1的 PEG 6000( 聚乙二醇 6000)、150gL-1的蔗糖、2.5mgL-1的赤霉素和10mgL-1的维生素 B1 的 BK 培养液，pH 为 7.0。0063 其中 BK 的成分如实施例 4.0064 实验验证例：一种白菜型油菜花粉的离体萌发培养测。

25、定花粉活力的方法，0065 1、白菜型油菜花粉的采集0066 白菜型油菜花粉于某年 10 月初采自甘肃农业大学干旱生境重点实验室，采集方法为：选取发育正常、无病虫危害的健壮植株，于盛花期选取已开花的花序，花蕾自然开放，花粉从花药中散出，收集花粉备用。0067 2、花粉离体萌发培养条件的筛选：0068 2.1 花粉离体萌发培养基的筛选 :0069 培养基种类对植物花粉离体萌发有较大影响，不同植物花粉萌发的适宜培养基不同。以BK培养基为基本培养基，在其基础上依次筛选合适浓度的PEG6000，蔗糖，GA3和VB1，最后调节合适的 pH。0070 BK 的组成为 (mgL-1) ：H3BO3100。

26、mgL-1、Ca(NO3)24H2O 300mgL-1、MgSO47H2O 200mgL-1和 KNO3100mgL-1。以蒸馏水为溶剂。0071 2.2PEG 浓度筛选0072 PEG6000是一种高分子量化合物，主要起到渗透调节作用。把新鲜花粉分别均匀散布在添加了 0gL-1、50gL-1、100gL-1、150gL-1、200gL-1的 PEG6000 的 BK 培养基 (BK培养基是液体；这里的 0gL-1代表不添加 PEG 的 BK 培养基。没有再往 BK 中添加蒸馏水 )中，0073 具体操作如下：(1) 用 1mol/L 的 NaOH 调节上述不同 PEG 浓度培养基的 pH。

27、至 7.0 ；(2) 用移液枪吸取 70L 培养基，轻轻滴在载玻片上形成球面状液滴，将两个雄蕊上的花粉播种在球面培养基上，播种时不要搅动培养基，以免花粉粒沉入液体培养基底部，在萌发过程中由于缺氧而影响实验结果，最好是将花粉粒均匀的铺在培养基上；(3) 将上述载玻片放入铺有两层湿润滤纸(保持一定的湿度，避免萌发时间太久培养基蒸发)的培养皿中，不加盖玻片 ( 以确保花粉萌发过程中有充足的氧气 )，盖紧培养皿盖子于 35培养箱中培养1h 后在显微镜下观察统计萌发数及花粉管长度。(4) 以花粉管长度大于花粉粒直径为花粉萌发标准，每处理重复 3 次，每重复随机观察 3 个视野，每视野观察花粉数不少于。

28、 30 粒，统说明书CN 104480184 A6/8 页8计花粉萌发率；同时用 LeicaDM6000B 全自动正置显微镜系统自带测微尺测量花粉管长度，每视野随机测量 10 个花粉，每处理共测 30 个花粉管长度，计算其平均值。试验重复三次。0074 结果如表 1 所示，BK 培养基中加入不同浓度的 PEG6000，可明显提高白菜型油菜花粉萌发率，其中添加 50gL-1PEG6000 效果最为显著，花粉萌发率达到 41.8；低浓度PEG(50 150gL-1) 促进花粉管生长，且随浓度增加，促进作用逐渐减弱，高浓度 PEG( 大于 200gL-1) 抑制花粉管生长；在显微观察时还发现。

29、，在添加了低浓度 PEG 的培养基中，白菜型油菜花粉管生长较直，而未加PEG或加了高浓度PEG的培养基花粉管生长弯曲，常交织在一起，不便观察测量。0075 表 1 不同浓度 PEG 对花粉萌发生长的影响0076 0077 2.3 蔗糖浓度试验0078 蔗糖是一种渗透调节物质，同时也是花粉管生长的能源物质。在50gL-1PEG6000+BK 的培养基中分别增加 100gL-1、150gL-1、200gL-1、250gL-1的蔗糖，比较不同浓度的蔗糖对花粉萌发和花粉管生长的影响。0079 结果如表 2 所示，BK+50gL-1PEG 培养基中不同浓度蔗糖对白菜型油菜花粉萌发率和花粉管生长影响不同，。

30、低浓度蔗糖 (150gL-1) 对花粉萌发和花粉管生长具有明显促进作用，而高浓度的蔗糖 ( 200gL-1) 可明显抑制花粉萌发和花粉管生长，且随着蔗糖浓度的增加，受到抑制程度越明显。在含有 150gL-1蔗糖的 BK+50gL-1PEG 培养基上白菜型油菜花粉生长最好，培养 1h 后，其花粉萌发率和花粉管长度分别达到 65.1和 91.1m。0080 表 2 不同浓度蔗糖对花粉萌发生长的影响0081 0082 2.4GA3浓度试验0083 赤霉素能抑制植物体内生长素分解系统的活动,以保证体内生长素含量说明书CN 104480184 A7/8 页9水平的相对增加，一定浓度的外源赤霉素处理能。

31、促进花粉萌发和花粉管生长。在BK+50gL-1PEG6000+150gL-1蔗糖培养基中分别增加 1mgL-1、2mgL-1、3mgL-1的 GA3，检测不同浓度的 GA3对白菜型油菜花粉萌发和花粉管生长的影响。0084 结果如表 3 所示，不同浓度的 GA3对白菜型油菜花粉萌发和花粉管生长的影响不同，低浓度 GA3(2mgL-1) 对花粉萌发和花粉管生长具有明显促进作用，而 GA3的浓度过低或过高都不利于花粉萌发和花粉管生长。在含有 2mgL-1GA3的 BK+50gL-1PEG+150gL-1蔗糖培养基上白菜型油菜花粉生长最好，培养 1h 后，其花粉萌发率和花粉管长度分别达到69.2和 1。

32、57.2m。0085 表 3 不同浓度 GA3对花粉萌发生长的影响0086 0087 2.5VB1 浓度试验0088 前人研究表明，生理活性类物质维生素 B1 对花粉萌发速度有所提高，达到了快捷的目的。在 BK+50gL-1PEG6000+150gL-1蔗糖 +2mgL-1GA3 的培养基中分别增加 5mgL-1、10mgL-1、15mgL-1的 VB1，研究不同浓度的 VB1 对白菜型油菜花粉萌发和花粉管生长的影响。0089 结果如表 4 所示，不同浓度的 VB1 对白菜型油菜花粉萌发和花粉管生长的影响不同，在含有 10mgL-1VB1 的在 BK+50gL-1PEG6000+150gL-1。

33、蔗糖 +2mgL-1GA3培养基上白菜型油菜花粉生长最好，培养 30min 后，其花粉萌发率和花粉管长度分别达到 58.4和76.4m。0090 表 4 不同浓度 VB1 对花粉萌发生长的影响0091 0092 2.6pH 梯度试验0093 在 pH 分别为 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 的 BK+50gL-1PEG6000+150gL-1蔗糖 +2mgL-1GA3+10mgL-1VB1 培养基上培养白菜型油菜新鲜花粉，检测培养基不同 pH 对白菜型油菜花粉萌发和花粉管生长的影响。说明书CN 104480184 A8/8 页100094 结果如表5所示，培养基pH。

34、值变化对白菜型油菜花粉萌发和花粉管生长均有显著影响，pH 值在 5.5 8.5 范围内，随 pH 值的增加，花粉萌发率和花粉管长度均呈“单峰”曲线变化，即在 pH 值较小时花粉萌发率和花粉管长度随 pH 的升高而增加，pH 6.5 时达到最大，之后开始下降。表明培养基 H+浓度过高或过低均不利于白菜型油菜花粉萌发生长。0095 表 5 不同 pH 值对花粉萌发生长的影响0096 0097 2.7 不同培养时间下白菜型油菜花粉离体萌发及花粉管生长：0098 将新鲜的白菜型油菜花粉匀撒上在 pH 为 6.5 的 BK+50gL-1PEG6000+150gL-1蔗糖 +2mgL-1GA3+10mg。

35、L-1VB1 的培养基上，置于底部垫有双层滤纸的培养皿中，盖紧培养皿盖子并放入恒温培养箱内 35培养，培养后 10min、15min、30min、45min、1h、2h、3h、4h 定时观测花粉管生长情况。0099 白菜型油菜花粉萌发生长情况如图 1 所示，其中，横坐标为培养时间，左边纵坐标表示花粉萌发率 ( )，右边纵坐标表示花粉管长度 (m) ；白菜型油菜花粉 15min 开始萌动，20min 花粉管从花粉孔中突出，30min 花粉管长度已超过花粉粒直径，花粉管开始快速生长，在开始培养的 1h 随培养时间的延长桔梗花粉萌发率迅速提高，1h 后多数有活力花粉均已萌发，2h 达到最大，之后萌发。

36、率不再增加；花粉管长度在初始培养的 2h 之前快速生长，之后花粉管生长逐渐停顿，3h 花粉管生长交织在一起，花粉管顶端开始膨大，3.5h 许多花粉管顶端破裂，内容物放出。0100 因此，在白菜型油菜花粉在 pH 为 6.5 的 BK+50gL-1PEG6000+150gL-1蔗糖+2mgL-1GA3+10mgL-1VB1 的培养基上，35恒温条件下离体培养 2h 后，测量花粉的萌发率和花粉管的长度，能够稳定有效的反应白菜型油菜花粉的活力。0101 本试验所用仪器：RQX 人工气候箱，JY/YP 电子天平，CAP 型电子天平，PHS-3C 型 pH计，LeicaDM6000B 全自动正置显微镜。0102 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。说明书CN 104480184 A。

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