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1、10申请公布号CN104206276A43申请公布日20141217CN104206276A21申请号201410463173722申请日20140912A01H4/0020060171申请人南京通泽农业科技有限公司地址210046江苏省南京市栖霞区尧化街道甘家边108号1幢701室72发明人杨存54发明名称一种云南栘依悬浮细胞培养的快速繁殖方法57摘要本发明研究了一种云南栘依悬浮细胞培养的快速繁殖方法，包括无菌叶片的获得、愈伤组织的诱导、悬浮细胞的培养等步骤，本发明方法所制备的云南栘依悬浮细胞克服了生境的局限，生长分裂速度快，操作可控，有助于获得大量的药用代谢产物。51INTCL权利要求书1。
2、页说明书2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书2页10申请公布号CN104206276ACN104206276A1/1页21一种云南栘依悬浮细胞培养的快速繁殖方法，包括无菌叶片的获得、愈伤组织的诱导、悬浮细胞的培养，其主要步骤如下（1）采取云南栘依幼嫩的叶片，在超净工作台上对其进行消毒处理；（2）取步骤（1）消毒处理过的叶片接种入B5KT0305MG/L6BA0510MG/LIBA02025MG/L3蔗糖065琼脂培养基中进行愈伤组织诱导，光照强度800LX，光期7H，暗期17H；（3）取步骤（2）中诱导出来的嫩绿松散的云南栘依愈伤组织接入B515MG/L2，。
3、4D1MOL/L蛋白胨100MG/L水解酪蛋白1MOL/L蔗糖进行悬浮细胞的培养，PH56，光照3000LX，温度25；按照权利要求1所述的一种云南栘依悬浮细胞培养的快速繁殖方法，其特征在于步骤（1）中所述云南栘依无菌叶片的获得为，取云南栘依幼嫩的叶片，在漂白粉中浸泡2MIN，毛刷去除表面被毛和污垢，流水冲洗10MIN，超净工作台上01氯化汞溶液消毒11MIN，同时均匀摇动，无菌水冲洗67遍，吸水纸吸去表面水分。2按照权利要求1所述的一种云南栘依悬浮细胞培养的快速繁殖方法，其特征在于步骤（3）中培养基中附加了蛋白胨和水解酪蛋白，可促进悬浮细胞的生长分裂。3按照权利要求1所述的一种云南栘依悬浮细。
4、胞培养的快速繁殖方法，其特征在于步骤（3）细胞悬浮培养的方法为接种量为40，振荡速度为110R/MIN，培养10天后用80目的不锈钢筛对悬浮液进行过滤，除去大的细胞团，15天继代1次。权利要求书CN104206276A1/2页3一种云南栘依悬浮细胞培养的快速繁殖方法技术领域0001本发明涉及云南栘依悬浮细胞培养的快繁方法，属于植物技术领域。背景技术0002云南栘依，又称西南栘棍，桃姨云南土名，DOCYNIADELAVAYIFRANCHSCHNEID，蔷薇科，常绿乔木，高510米，小枝粗壮，幼时有黄白色绒毛，渐脱落，红褐色或紫褐色。叶片披针形或卵状披针形，长58厘米，宽23厘米，先端急尖或渐尖，。
5、基部阔楔形或近圆形，全缘或稍有浅钝锯齿，下面密生黄白色绒毛；叶柄长约1厘米，密生绒毛。花35朵丛生于小枝顶端；花梗短粗或近于无梗，果期伸长，密生绒毛；花白色，直径258厘米；萼筒钟状，外面密生黄白色绒毛。梨果较大，卵形或矩圆形，直径23厘米，萼裂片宿存；果柄较长。产云南、四川、贵州。生山谷、溪旁、灌或路旁杂木林中，海拔10003000米。在云南腾冲一带极为常见，当地人经常当山楂来食用，作为健胃消食和行气散淤之用，目前，国内对此研究和报道很少，悬浮细胞具有操作简单可控，生产成本低，繁殖率高等优点。发明内容0003本发明所要解决的技术问题是提供一种云南栘依悬浮细胞的快速繁殖方法，由该方法所制备得到。
6、的云南栘依悬浮细胞生长分裂速度快，操作可控，有助于获得大量的药用代谢产物，克服生境的局限。0004本发明所要解决的技术问题是通过以下方案来实现的取云南栘依幼嫩的叶片，在漂白粉中浸泡2MIN，毛刷去除表面被毛和污垢，流水冲洗10MIN，超净工作台上01氯化汞溶液消毒11MIN，同时均匀摇动，无菌水冲洗67遍，吸水纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接种入B5KT04MG/L6BA05MG/LIBA02MG/L3蔗糖065琼脂培养基中进行愈伤组织诱导，光照强度800LX，光期7H，暗期17H，诱导出来的嫩绿松散的云南栘依愈伤组织接入B515MG/L2，4D1MOL/L蛋白胨100MG/L水解酪蛋白1M。
7、OL/L蔗糖进行悬浮细胞的培养，PH56，光照3000LX，温度25，接种量为40，振荡速度为110R/MIN，培养10天后用80目的不锈钢筛对悬浮液进行过滤，除去大的细胞团，15天继代1次。0005采用本发明制备的云南栘依悬浮细胞生长分裂速度快，操作可控，有助于获得大量的药用次生代谢产物，克服生境的局限。0006下面将结合具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。具体实施方式0007实施例1取云南栘依幼嫩的叶片，在漂白粉中浸泡2MIN，毛刷去除表面被毛和污垢，流水冲洗说明书CN104206276A2/2页410MIN，超净工作台上01氯化汞溶液消毒11M。
8、IN，同时均匀摇动，无菌水冲洗67遍，吸水纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接种入B5KT03MG/L6BA05MG/LIBA02MG/L3蔗糖065琼脂培养基中进行愈伤组织诱导，光照强度800LX，光期7H，暗期17H，诱导出来的嫩绿松散的云南栘依愈伤组织接入B515MG/L2，4D1MOL/L蛋白胨100MG/L水解酪蛋白1MOL/L蔗糖进行悬浮细胞的培养，PH56，光照3000LX，温度25，接种量为40，振荡速度为110R/MIN，培养10天后用80目的不锈钢筛对悬浮液进行过滤，除去大的细胞团，15天继代1次。0008实施例2取云南栘依幼嫩的叶片，在漂白粉中浸泡2MIN，毛刷去除表面被毛。
9、和污垢，流水冲洗10MIN，超净工作台上01氯化汞溶液消毒11MIN，同时均匀摇动，无菌水冲洗67遍，吸水纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接种入B5KT05MG/L6BA10MG/LIBA025MG/L3蔗糖065琼脂培养基中进行愈伤组织诱导，光照强度800LX，光期7H，暗期17H，诱导出来的嫩绿松散的云南栘依愈伤组织接入B515MG/L2，4D1MOL/L蛋白胨100MG/L水解酪蛋白1MOL/L蔗糖进行悬浮细胞的培养，PH56，光照3000LX，温度25，接种量为40，振荡速度为110R/MIN，培养10天后用80目的不锈钢筛对悬浮液进行过滤，除去大的细胞团，15天继代1次。0009实施。
10、例3取云南栘依幼嫩的叶片，在漂白粉中浸泡2MIN，毛刷去除表面被毛和污垢，流水冲洗10MIN，超净工作台上01氯化汞溶液消毒11MIN，同时均匀摇动，无菌水冲洗67遍，吸水纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接种入B5KT04MG/L6BA10MG/LIBA025MG/L3蔗糖065琼脂培养基中进行愈伤组织诱导，光照强度800LX，光期7H，暗期17H，诱导出来的嫩绿松散的云南栘依愈伤组织接入B515MG/L2，4D1MOL/L蛋白胨100MG/L水解酪蛋白1MOL/L蔗糖进行悬浮细胞的培养，PH56，光照3000LX，温度25，接种量为40，振荡速度为110R/MIN，培养10天后用80目的不锈钢筛对悬浮液进行过滤，除去大的细胞团，15天继代1次。说明书CN104206276A。