PVARRP1蛋白及其编码基因在砷转运解毒和积累中的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102899348 A(43)申请公布日 2013.01.30CN102899348A*CN102899348A*(21)申请号 201210394041.4(22)申请日 2012.10.17C12N 15/82(2006.01)C12N 15/84(2006.01)A01H 5/00(2006.01)B09C 1/00(2006.01)(71)申请人中国科学院植物研究所地址 100093 北京市海淀区香山南辛村20号中国科学院植物研究所新实验楼E127(72)发明人徐文忠 麻密 陈焱山(74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司 11245代理人关畅(54) 。

2、发明名称PvARRP1蛋白及其编码基因在砷转运解毒和积累中的应用(57) 摘要本发明公开了PvARRP1蛋白及其编码基因在砷转运解毒和积累中的应用。本发明提供了一种培育转基因植物的方法，是将编码PvARRP1蛋白的基因导入目的植物中，得到砷富集能力高于所述目的植物的转基因植物；所述PvARRP1蛋白是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物砷转运解毒和积累相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明对培育对砷具有高抗性和超积累能力的植株，以及用所述植物治理环境砷污染具有重大应用。

3、价值。(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书5页序列表3页 附图1页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 5 页序列表 3 页 附图 1 页1/1页21.一种培育转基因植物的方法，是将PvARRP1基因导入目的植物中，得到砷富集能力高于所述目的植物的转基因植物；所述PvARRP1基因为编码PvARRP1蛋白的基因；所述PvARRP1蛋白是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物砷转运解毒和积累相关的由序列1衍生的蛋白。

4、质。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述PvARRP1基因为如下(1）或（2）或(3）或（4）所述的DNA分子：（1）序列表中序列2自5末端第1至1137位核苷酸所示的DNA分子；（2）序列表中序列2所示的DNA分子；（3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且编码植物砷转运解毒和积累相关蛋白的DNA分子；（4）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且植物砷转运解毒和积累相关蛋白的DNA分子。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述PvARRP1基因通过重组表达载体导入所述目的植物中；所述重组表达载体为将所述PvARRP1基因导入pSN1301质粒的多。

5、克隆位点得到的重组质粒。4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。5.一种治理存在砷污染的土壤的方法，包括如下步骤：在所述存在砷污染的土壤上种植权利要求1至4中任一所述方法得到的转基因植物。6.PvARRP1蛋白或其编码基因在植物砷富集和/或植物砷转运解毒和/或植物砷积累中的应用；所述PvARRP1蛋白是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物砷转运解毒和积累相关的由序列1衍生的蛋白质。7.如权利要求6所述的应用，其特征在。

6、于：所述编码基因为如下(1）或（2）或(3）或（4）所述的DNA分子：（1）序列表中序列2自5末端第1至1137位核苷酸所示的DNA分子；（2）序列表中序列2所示的DNA分子；（3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且编码植物砷转运解毒和积累相关蛋白的DNA分子；（4）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且植物砷转运解毒和积累相关蛋白的DNA分子。8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。权 利 要 求 书CN 102899348 A1/5页3PvARRP1 蛋白及其编码基因在砷转运解毒和积累中的应用技术领域0001 本发明。

7、涉及PvARRP1蛋白及其编码基因在砷转运解毒和积累中的应用。背景技术0002 砷是一种有毒的化学元素，其常见的存在形式为砷酸盐Arsenate,As(V)或亚砷酸盐Arsenic,As(III)。0003 砷污染在国内外都是一个非常突出的环境问题，我国是世界上砷污染最严重的国家之一。人类的经济活动可以直接导致较为严重的砷污染，包括矿石的冶炼、煤的燃烧、矿渣的抛弃、制革废物、染料生产、木材防腐、含砷农药、生化武器和杀虫剂的使用等。环境中的砷对人类和动植物都有很大的危害，可以通过呼吸道、食物或皮肤接触进入人体，目前砷污染已经造成了全球很多地方与砷毒害相关的流行疾病。鉴于砷污染的严峻形势，急需进行。

8、砷污染的治理工作。0004 传统的土壤砷污染治理方法费用昂贵，并破坏土壤微生物和土壤结构，其实用性较低。近年来，植物修复技术为土壤砷污染修复提供了新的途径。植物修复是利用超富集植物吸收、积累环境中的污染物，并降低其毒害的生物技术。它具有传统环境修复技术所不具备的优点：治理效果较好，成本较低，无二次污染，某些金属元素甚至可回收利用等。植物修复的前提是发现或培育对重金属具有抗性且在地上部分富集重金属的植物种或基因型。植物修复的长远发展依赖于超富集植物分子机制的阐明和通过基因工程手段培育具有砷积累能力的生长较快，适应性强，生物量大的工程植物。发明内容0005 本发明的目的是提供PvARRP1蛋白及其。

9、编码基因在砷转运解毒和积累中的应用。0006 本发明提供了一种培育转基因植物的方法，是将PvARRP1基因导入目的植物中，得到砷富集能力高于所述目的植物的转基因植物；所述PvARRP1基因为编码PvARRP1蛋白的基因；0007 所述PvARRP1蛋白是如下（a）或（b）：0008 （a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；0009 （b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物砷转运解毒和积累相关的由序列1衍生的蛋白质。0010 所述PvARRP1基因具体可为如下(1）或（2）或(3）或（4）所述的DNA分子：0011 （1）序列表。

10、中序列2自5末端第1至1137位核苷酸所示的DNA分子；0012 （2）序列表中序列2所示的DNA分子；0013 （3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且编码植物砷转运解毒和积累相关蛋白的DNA分子；0014 （4）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且植物砷转运解毒和积累相关蛋白的DNA分子。说 明 书CN 102899348 A2/5页40015 所述严格条件为在0.1SSPE（或0.1SSC）、0.1SDS的溶液中，65条件下杂交并洗膜。0016 所述PvARRP1基因具体可通过重组表达载体导入所述目的植物中；所述重组表达载体为将所述PvARRP1基因。

11、导入pSN1301质粒的多克隆位点得到的重组质粒。0017 携带有所述基因的重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化所述生物的细胞或组织。0018 所述目的植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，如哥伦比亚生态型拟南芥。0019 所述砷的存在形式具体可为砷酸盐（AsV），所述砷酸盐具体可为砷酸钠。0020 所述“砷富集能力高于所述目的植物”具体可体现为：在存在砷的环境中（特别是土壤环境），所述植物的地上部分的总砷含量高于所述目的植物。0021 本发明还保护一种治理存在砷污染的土壤的方法，。

12、包括如下步骤：在所述存在砷污染的土壤上种植以上任一所述方法得到的转基因植物。0022 本发明还保护所述PvARRP1蛋白或其编码基因在植物砷富集和/或植物砷转运解毒和/或植物砷积累中的应用。0023 所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，如哥伦比亚生态型拟南芥。0024 将本发明提供的PvARRP1蛋白的编码基因导入植物，可以在土培条件下显著提高植物地上部分砷的积累，并显著增强植物对砷胁迫的抗性，本发明可用于培育具有砷抗性和砷积累能力的工程植株，并用于植物修复治理砷污染环境提供了途径。附图说明0025 图1为植株在含10mg/L砷酸盐的土壤中培养70天后的表型。00。

13、26 图2为植株在含10mg/L砷酸盐的土壤中培养90天后地上部分各组织中总砷含量的测定。具体实施方式0027 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用到的砷酸盐（AsV）均为砷酸钠。0028 蜈蚣草（Pteris vittata L.）：公众可以从中国科学院植物研究所获得；参考文献：Yang XX,Chen H,Dai XJ,Xu WZ,He ZY,Ma M.2009.Evidence。

14、 of vacuolarcompartmentalization of arsenic in the hyperaccumulator Pteris vittata.Chinese Science Bulletin 54(22):4229-4233.。0029 pSN1301质粒：公众可以从中国科学院植物研究所获得；参考文献：Guo J,Dai X,Xu W,Ma M.2008.Overexpressing GSH1 and AsPCS1 simultaneously increases thetolerance and accumulation of cadmium and arsenic 。

15、in Arabidopsis thaliana.说 明 书CN 102899348 A3/5页5Chemosphere 72(7):1020-1026.。0030 农杆菌菌株c58：公众可以从中国科学院植物研究所获得；参考文献：Lv S,WangH,Yu B,Meng W,Cao S.2012.Cloning of Arabidopsis HIS1-3 gene and constructionof its expression vector.Journal of Hefei University of Technology.NaturalScience 35(1):120-123.。0031。

16、 哥伦比亚生态型拟南芥（Col）：购自Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)。0032 实施例1、PvARRP1蛋白及其编码基因的发明0033 蜈蚣草（Pteris vitata L.），属于蕨类植物凤尾蕨科凤尾蕨属。0034 发明人从蜈蚣草中发现了一个与砷转运解毒和超积累相关的基因，命名为PvARRP1基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示。PvARRP1基因编码的蛋白命名为PvARRP1蛋白，PvARRP1蛋白的氨基酸序列如序列表的序列1所示。0035 实施例2、转基因植物的获得和鉴定0036 一、重组表达载体的构建0037 1、提取蜈蚣草。

17、叶片的总RNA。0038 2、以步骤1提取的总RNA反转录为cDNA。0039 3、以步骤2得到的cDNA为模板，用PvARRP1S和PvARRP1A组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。0040 PvARRP1S：5-ATGGAGAACTCAAGCGCGGAGCGGA-3；0041 PvARRP1A：5-CTAAACAGAAGGCCCCTTCCTCTGA-3。0042 PCR扩增程序：9810s、5530s、7270s，35个循环；7210min；10保存。0043 4、以步骤3的PCR扩增产物为模板，采用PvARRP1S1/PvARRP1A1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR。

18、扩增产物。0044 PvARRP1S1：5- ggatccATGGAGAACTCAAGCGCGGAGCGGA-3；0045 PvARRP1A1：5- ggtaccCTAAACAGAAGGCCCCTTCCTCTGA-3。0046 方框标记的序列为与pSN1301质粒发生同源重组的序列，分别为针对pSN1301质粒的BamHI酶切位点上游的部分序列的同源臂和针对pSN1301质粒的KpnI酶切位点下游的部分序列的同源臂，所以PCR扩增产物可以与pSN1301质粒发生同源重组从而用PCR扩增产物BamHI和KpnI酶切位点之间的片段取代pSN1301质粒的BamHI和KpnI酶切位点之间的小片段。0。

19、047 PCR扩增程序同步骤3。0048 5、用限制性内切酶BamHI和KpnI双酶切pSN1301质粒，回收骨架载体（约13kb）。0049 6、将步骤4的PCR扩增产物和步骤5的载体骨架进行重组连接（采用CloneEZ重组克隆试剂盒并按说明书进行），得到重组质粒pSN1301-PvARRP1。根据测序结果，对重组质粒pSN1301-PvARRP1进行结构描述如下：将pSN1301质粒BamHI和KpnI酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列2所示的PvARRP1基因。0050 二、转基因植物的获得0051 1、将重组质粒pSN1301-PvARRP1导入农杆菌菌株c58，得到重组农杆菌。。

20、说 明 书CN 102899348 A4/5页60052 2、通过花浸泡法(Clough,S.J.,and Bent,A.F.(1998).Floral dip:asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant J 16,735-743.)将重组农杆菌导入哥伦比亚生态型拟南芥，得到T1代种子。0053 3、T1代种子收获后在1/2GM固体无糖培养基（含20mg/L潮霉素）中筛选抗性植株，将抗性植株移栽到土中，收获T2代种子并将其培育为植株（T2代植株）。0054 分。

21、别取T1代植株和T2代植株，先进行GUS染色鉴定。GUS染色鉴定的方法：待植株长至6-8片真叶时，剪取叶片进行GUS染色，呈现蓝色的的叶片对应的植株进行分子鉴定。分子鉴定的方法：提植株叶片的总RNA并反转录为cDNA，用PvARRP1S和PvARRP1A组成的引物对对来自各个样本的cDNA进行PCR鉴定（靶序列为约1.1kb的条带），PCR鉴定为阳性的植株即转基因植株。对于某一T1代植株，如果其T2代植株均PCR鉴定为阳性，则该植株为纯合的转基因植株，该植株及其后代即为1个纯合的转基因株系。0055 T2代转基因植株自交产生T3代种子。0056 随机选取两个纯合的转基因植株株系（L9株系和L1。

22、1株系）的T3代种子进行步骤四的鉴定。0057 三、转空载体对照植株的获得0058 用pSN1301质粒代替重组质粒pSN1301-PvARRP1进行步骤二的操作，得到转空载体对照植株。0059 四、转基因植株和对照植株对砷的富集能力比较0060 将L9株系的T3代种子、L11株系的T3代种子、转空载体对照植株的T3代种子和哥伦比亚生态型拟南芥分别进行如下鉴定（每个株系取50粒种子进行鉴定，进行三次重复试验，结果取平均值）：0061 将种子置于潮湿的滤纸上，4下保湿避光培2天；然后将种子播种在含10mg/L砷酸盐的土壤中培养（每天光照16小时，黑暗8小时）。0062 1、表型观察0063 在土。

23、壤中培养70天的植株的照片见图1。结果表明，转基因植株在含有AsV的环境中的生长情况显著优于哥伦比亚生态型拟南芥。0064 2、转基因植株和对照植株对砷的富集能力比较0065 取在土壤中培养90天的植株，分别取该植株的莲座叶、茎杆和种子。将不同材料分别放入烘箱，80烘干6h，称量干重。将称量过的材料放入消煮管并加入1.5ml混合酸硝酸：浓硫酸：高氯酸=4:1:0.5（体积比），均为优级纯，冷消煮过夜（加入混合酸后室温静置称为冷消煮），然后250消煮4h，用蒸馏水定容至30ml，滤纸过滤后用电感耦合等离子体发射光谱仪iCAP6300(Thermo Electron corporation,USA。

24、)测定总砷含量。0066 莲座叶的总砷含量、茎杆的总砷含量和种子的总砷含量见图2。转空载体对照植株的莲座叶的总砷含量、茎杆的总砷含量和种子的总砷含量均与哥伦比亚生态型拟南芥一致。与哥伦比亚生态型拟南芥相比，在含10mg/L砷酸盐（AsV）土培条件下培养90天，L9和L11莲座叶中总砷含量是哥伦比亚生态型拟南芥的4倍左右，L9和L11茎杆中总砷含量是哥伦比亚生态型拟南芥的7倍左右，L9和L11种子中总砷含量是哥伦比亚生态型拟南芥的3倍左右。0067 结果表明，PvARRP1蛋白及其编码基因参与砷转运解毒，可以促进植物中砷的积说 明 书CN 102899348 A5/5页7累，转基因植株在含有砷酸盐（AsV）的土壤环境中地上部分积累的总砷含量显著高于哥伦比亚生态型拟南芥，从而可以作为砷富集植物用于土壤砷污染的治理。说 明 书CN 102899348 A1/3页80001 0002 序 列 表CN 102899348 A2/3页90003 序 列 表CN 102899348 A3/3页10序 列 表CN 102899348 A10。