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1、10申请公布号CN104208667A43申请公布日20141217CN104208667A21申请号201410448846122申请日20140904A61K39/116200601A61P31/04200601A61K39/09200601A61K39/02200601A61K39/10220060171申请人天津瑞普生物技术股份有限公司地址300308天津市滨海新区空港经济区环河北路与中心大道交口空港商务园西区2120172发明人厚华艳吕茂杰杨保收盛长忠梁武74专利代理机构天津滨海科纬知识产权代理有限公司12211代理人韩敏54发明名称一种三联灭活疫苗制备方法57摘要本发明提供了一种三。
2、联灭活疫苗制备方法，本发明制备的副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪支原体肺炎三联灭活疫苗能够达到较好的免疫效果，同时可以达到一针多防、降低成本、减少猪只应激的目的。51INTCL权利要求书2页说明书12页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书12页10申请公布号CN104208667ACN104208667A1/2页21一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤1分别培养副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体，制备得到活菌液；2利用甲醛分别对步骤1制备得到的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体进行灭活；3利用超滤。
3、方法对步骤2灭活后的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体进行浓缩，后经生理盐水重悬浮菌体，再分别调整菌体浓度至1071012CFU/ML；4取步骤3调整浓度后的副猪嗜血杆菌4型菌液、副猪嗜血杆菌5型菌液、猪链球菌2型菌液、猪肺炎支原体菌液以12121212V/V的比例混匀得到混合抗原溶液；5取步骤4得到的混合抗原溶液与疫苗佐剂混合制得三联灭活疫苗。2根据权利要求1所述的一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤1培养猪肺炎支原体的培养基为以下配方牛心浸出液300份；双蒸水360份；HANKS溶液40份；025W/V酚红10份；马血清200份；5W/V水解乳蛋白100份；。
4、25W/V酵母浸出液20份；10万单位青霉素10份。3根据权利要求1所述的一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤1培养猪肺炎支原体的培养基制备方法如下取配方量的牛心浸出液、双蒸水混匀，将其PH值调至7276，灭菌，再加入无菌的配方量的HANKS溶液、酚红、马血清、水解乳蛋白、酵母浸出液、青霉素混匀。4根据权利要求1所述的一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤5具体包括以下流程取权利要求1步骤4所述的混合抗原溶液，向其中加入吐温80、左旋咪唑、黄芩多糖、壳多糖的其中一种完全溶解即为水相；取白油佐剂与上述水相以55454555V/V的比例混合乳化，乳化过程中或乳化前加入硫柳汞，即得到三联灭活疫。
5、苗。5根据权利要求4所述的一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于所述白油佐剂制备方法为取司本80与白油按369497V/V的比例混合，再向该混合物中加入1525V/V的硬脂酸铝，加热熔化混匀，高压灭菌。6根据权利要求4所述的一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于所述水相的制备具体包括以下流程向混合抗原溶液中加入28V/V的吐温80混匀至完全溶解即为水相。7根据权利要求4所述的一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于所述水相的制备具权利要求书CN104208667A2/2页3体包括以下流程向混合抗原溶液中加入左旋咪唑，至左旋咪唑终浓度200MG/ML，即为水相。8根据权利要求4所述的一种三联灭活疫苗制备。
6、方法，其特征在于所述水相的制备具体包括以下流程向混合抗原溶液中加入黄芩多糖，至黄岑多糖终浓度为335MG/ML，即为水相。9根据权利要求4所述的一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于所述水相的制备具体包括以下流程向混合抗原溶液中加入壳多糖，至终浓度为10MG/ML，即为水相。10根据权利要求1所述的一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤5具体包括以下流程取权利要求1步骤4所述的混合抗原溶液，以416V/V的比例向其中加入GEL01ST佐剂混匀，即得到三联灭活疫苗；权利要求书CN104208667A1/12页4一种三联灭活疫苗制备方法技术领域0001本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种三联灭活疫。
7、苗制备方法。背景技术0002副猪嗜血杆菌、猪链球菌和猪肺炎支原体是当今危害养猪业的重要病原，常作为猪瘟、猪繁殖与呼吸综合症、猪圆环病毒病及猪流感的并发或继发感染病原，严重危害我国乃至世界养猪业的发展。0003副猪嗜血杆菌HAEMOPHILUSPARASUISOFSWINE,HPS是副猪嗜血杆菌病的病原体，是猪上呼吸道的一种共栖菌，它可在特定条件侵入机体而引起以纤维素性多发性桨膜炎、关节炎、脑膜炎和高热为主要特征的全身性疾病。副猪嗜血杆菌病又称猪革拉泽氏病GLSSERSDISEASE，可以侵害2周龄至4月龄猪，主要在断奶前后和保育舍阶段发病，多发于58周龄，发病率达40，严重时高达50。副猪嗜血。
8、杆菌血清型较复杂，按热稳定可溶抗原和琼脂扩散试验AGPT血清分型方法将副猪嗜血杆菌分为15个血清型，但仍有20分离株型特异性抗原表达量不足而不能分型。我国主要流行血清型为4、5、12、13型VETMICROBIOL2005,1231236，其中血清型4、5型最为流行。由于抗生素等药物的滥用导致该菌的耐药性越来越强，采用疫苗免疫成为预防副猪嗜血杆菌病经济而有效的途径。在研制和开发副猪嗜血杆菌灭活苗时，显著增强体液免疫作用的佐剂对提高疫苗的效力十分重要。0004猪链球菌STREPTOCOCCUSSUIS,SS是猪链球菌病的病原，属革兰氏阳性兼性厌氧菌，猪链球菌病是一种人兽共患病。其临床表现不同症状。
9、败血症、脑膜炎、心内膜炎、肺炎、淋巴结脓肿及多发性关节炎等。可侵害不同品种、年龄、性别猪只，大多数在312周龄仔猪暴发流行，断奶及混群时易出现发病高峰，集约化猪场尤为严重。猪链球菌根据菌体荚膜抗原特性的不同，可以分为35个血清型134型及1/2型，其中2型流行最广，对猪的致病性最强，其次是1型。猪链球菌所致的猪链球菌病在猪群的流行情况、发病率及死亡率均有很大差别。发病率可以小于1直至大于50，但一般不超过5，卫生条件差及存在并发感染时发病率升高，流行一般超过数周。近年，猪链球菌2型发病率有上升趋势，引起人们的高度重视。0005猪支原体肺炎MYCOPLASMALPNEUMONIAOFSWINE,。
10、MPS是一种慢性接触性呼吸道传染病，也称地方流行性肺炎或喘气病。主要临床特征表现为咳嗽和喘气。不同季节不同日龄猪只均易感，多发于生长育肥阶段猪只，发病猪生长缓慢、饲料报酬低下，从而使饲养期延长。该病发病率高，死亡率低，且难以根除。猪肺炎支原体MYCOPLASMAHYOPNEUMONIAE,MPH是引起猪支原体肺炎的原发性病原，当猪肺炎支原体与多杀性巴士杆菌PASTEURELLAMULTOCIDA、猪链球菌STREPTOCOCCUSSUIS,SS、副猪嗜血杆菌HAEMOPHILUSPARASUISOFSWINE,HPS或猪胸膜肺炎放线杆菌ACTINOBACILLUSPLEUROPNEUMONIA。
11、OFPORCINE,APP等病原混合感染时，会引起猪地方流行性肺炎；当猪肺炎支原体与猪繁殖与呼吸综合征病毒PORCINEREPRODUCTIVEANDRESPIRATORY说明书CN104208667A2/12页5SYNDROME,PRRSV、猪圆环病毒2型PORCINECIRCOVIRUSTYPE2,PCV2等病原混合感染时，又会引起猪呼吸道疾病综合征PRDC的发生，PRDC不仅可以引起猪的呼吸系统疾病，同时也会导致猪的繁殖能力下降。猪肺炎支原体营养条件要求十分苛刻，一般培养基中难以生长，其鉴定方法也非常繁琐，且不易成功。目前，广泛使用的疫苗株为猪肺炎支原体J株，疫苗免疫是目前避免感染及有效。
12、防控的最有效办法。0006细胞免疫和体液免疫是机体抵抗感染的两大保护机制，淋巴细胞对猪肺炎支原体抗原的特异性应答及相应细胞因子的释放与抗猪肺炎支原体感染能力之间呈明显正相关，因此，猪支原体肺炎的预防中，细胞免疫应答起非常重要作用。在免疫猪支原体肺炎灭活疫苗后，能明显的从免疫动物血液中检测到特异性血清IGG抗体，但研究者一致认为全身体液免疫在猪支原体肺炎免疫过程中仅能提供有限的保护。而副猪嗜血杆菌和猪链球菌灭活疫苗中，促进体液免疫作用的佐剂对提高疫苗的效力十分重要，因此制备副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪支原体肺炎三联灭活疫苗，筛选佐剂时应同时兼顾其对细胞免疫和体液免疫的刺激能力。0007目前，市。
13、场上使用的疫苗只有单一的或二联的预防副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病或猪支原体肺炎的灭活苗或活疫苗，而这三种病中的一种或几种通常与猪瘟、猪蓝耳病、猪圆环病等并发或继发感染，或者这三种病的混合感染，市售商品疫苗需多次免疫，成本高，对猪的应激较大。另外，同时预防副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎的灭活疫苗，国内外还未见有报道。因此，需要发明一种新的能同时预防副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎的三联灭活疫苗及其制备方法以解决当前面临的问题。发明内容0008本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种三联灭活疫苗制备方法，以实现通过该方法制备的产品对副猪嗜血杆菌、猪链球菌和猪肺炎支原体均产生免疫作。
14、用，从而起到更加可靠的预防作用。0009为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案0010一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤00111分别培养副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体，制备得到活菌液；00122利用甲醛分别对步骤1制备得到的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体进行灭活；00133利用超滤方法对步骤2灭活后的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体进行浓缩，后经生理盐水重悬浮菌体，再分别调整菌体浓度至1071012CFU/ML；00144取步骤3调整浓度后的副猪嗜血杆菌4型菌液、副猪嗜血杆菌5型菌。
15、液、猪链球菌2型菌液、猪肺炎支原体菌液以12121212V/V的比例混匀得到混合抗原溶液；00155取步骤4得到的混合抗原溶液与疫苗佐剂混合制得三联灭活疫苗。0016优选的，步骤1培养猪肺炎支原体的培养基为以下配方牛心浸出液300份；双蒸水360份；HANKS溶液40份；025W/V酚红10份；马血清200份；5W/V水解乳蛋说明书CN104208667A3/12页6白100份；25W/V酵母浸出液20份；10万单位青霉素10份。0017优选的，步骤1培养猪肺炎支原体的培养基制备方法如下取配方量的牛心浸出液、双蒸水混匀，将其PH值调至7276，灭菌，再加入无菌的配方量的HANKS溶液、酚红、马。
16、血清、水解乳蛋白、酵母浸出液、青霉素混匀。0018优选的，步骤5具体包括以下流程取权利要求1步骤4所述的混合抗原溶液，向其中加入吐温80、左旋咪唑、黄芩多糖、壳多糖的其中一种完全溶解即为水相；取白油佐剂与上述水相以55454555V/V的比例混合乳化，乳化过程中或乳化前加入硫柳汞，即得到三联灭活疫苗。在此基础上可以进行一下优选优选的，所述白油佐剂制备方法为取司本80与白油按369497V/V的比例混合，再向该混合物中加入1525V/V的硬脂酸铝，加热熔化混匀，高压灭菌。优选的，所述水相的制备具体包括以下流程向混合抗原溶液中加入28V/V的吐温80混匀至完全溶解即为水相。优选的，所述水相的制备具。
17、体包括以下流程向混合抗原溶液中加入左旋咪唑，至左旋咪唑终浓度200MG/ML，即为水相。优选的，所述水相的制备具体包括以下流程向混合抗原溶液中加入黄芩多糖，至黄岑多糖终浓度为335MG/ML，即为水相。优选的，所述水相的制备具体包括以下流程向混合抗原溶液中加入壳多糖，至终浓度为10MG/ML，即为水相。0019优选的，步骤5具体包括以下流程取权利要求1步骤4所述的混合抗原溶液，以416V/V的比例向其中加入GEL01ST佐剂混匀，即得到三联灭活疫苗；0020副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪支原体肺炎三联灭活疫苗与市售的副猪嗜血杆菌灭活疫苗、猪链球菌病灭活疫苗及猪支原体肺炎灭活疫苗相比，相应病原的。
18、免疫保护力基本相当，但可以达到一针多防、降低成本、减少猪只应激的目的。具体实施方式0021实施例1一种三联灭活疫苗制备方法0022一种副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪支原体肺炎三联灭活疫苗的制备方法，其步骤如下00231生产菌种制备002411一级种子繁殖0025将副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型冻干菌种，分别划线接种于TSA/NAD平板上，37培养1824小时，挑取单菌落接种于TSB/NAD液体培养基中，37培养1216小时，为一级种子；猪肺炎支原体冻干菌种划线接种于固体培养基上，37培养7日，挑取单菌落接种斜面固体培养基上，37培养7日，为一级种子。002612二级种子繁殖0。
19、027将制备的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型一级种子按1的体积比接入TSB/NAD培养基中，37培养1216小时，按现行中国兽药典附录进行纯粹检验，合格后作为二级种子；将制备的猪肺炎支原体一级种子按体积比1接入到液体培养基中，37培养7日，按现行中国兽药典附录进行纯粹检验，合格后作为二级种子。00282抗原制备002921菌液制备0030将鉴定合格的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型二级种子按说明书CN104208667A4/12页71体积比接种到TSB/NAD培养基中，37培养18小时；将鉴定合格的猪肺炎支原体二级种子按1体积比接入到液体基础培养基中，37培养。
20、24小时。0031上述制得菌液分别进行纯粹检验及活菌计数，按现行中国兽药典附录进行检验，应纯粹。003222抗原灭活0033将检验合格的菌液，按菌液总量的03加入甲醛溶液，37灭活2448小时，期间每隔23小时搅拌一次，每次35分钟，灭活后取样，按现行中国兽药典附录进行灭活检验，应无细菌生长。003423抗原浓缩0035将检验合格的灭活抗原经中空纤维素超滤浓缩，根据灭活前活菌计数结果用生理盐水将灭活抗原浓度调整为101010CFU/ML或101010CCU/ML。取样做无菌检验，应无细菌生长。00363配苗003731副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎三联白油佐剂灭活疫苗配置0038将灭。
21、活的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型、猪肺炎支原体抗原浓缩重悬稀释液按1111体积比混匀作为水相，与白油佐剂按体积比11混合乳化，混合乳化前按体积比加入001的硫柳汞，制得副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎水包油白油佐剂疫苗。003932副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎三联左旋咪唑白油佐剂灭活疫苗配置0040将灭活的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型、猪肺炎支原体抗原浓缩重悬稀释液按1111体积比混匀作为水相，将左旋咪唑母液加入到抗原混合液中，使其最终免疫剂量100MG/头份，与白油佐剂按体积比11混合乳化，混合乳化前按体积比加入001的硫柳汞，制得。
22、副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎水包油型左旋咪唑白油佐剂疫苗。004133副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎三联黄芩多糖白油佐剂灭活疫苗配置0042将灭活的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型、猪肺炎支原体抗原浓缩重悬稀释液按1111体积比混匀作为水相，将黄芩多糖母液加入到抗原混合液中，使其最终免疫剂量1G/头份，与白油佐剂按体积比11混合乳化，混合乳化前按体积比加入001的硫柳汞，制得副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎水包油型黄芩多糖白油佐剂疫苗。004334副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎三联壳多糖白油佐剂灭活疫苗配置0044将灭活的副猪嗜血杆菌4型。
23、、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型、猪肺炎支原体抗原浓缩重悬稀释液按1111体积比混匀作为水相，将壳多糖母液加入到抗原混合液中，使其最终免疫剂量100MG/头份，与白油佐剂按体积比11混合乳化，混合乳化前按体积比加入001的硫柳汞，制得副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎水包油型壳多糖白油佐剂疫苗。说明书CN104208667A5/12页8004535副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎三联GEL佐剂灭活疫苗配置0046将灭活的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型、猪肺炎支原体抗原浓缩重悬稀释液按1111体积比混匀作为抗原混合液，按10体积比加入GEL01ST佐剂，大枪吹匀，。
24、制成水佐剂的副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎三联GEL佐剂灭活疫苗。004736无菌检验0048取上述配制疫苗按现行中国兽药典附录进行无菌检验，应无细菌生长。00494分装0050定量分装，加塞，密封，28保存。0051实施例2实施例1制备的疫苗安全性研究0052取实施例1中制备的疫苗各肌肉注射45周龄健康易感断奶仔猪，每头2ML含1头份，每种疫苗注射5头，对照组5头，2周后，以相同方法及相同剂量进行二免，观察2周，应无局部或全身不良反应且全部健活。结果见表1。0053表1安全性研究结果00540055安全性试验结果显示副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎三联白油佐剂灭活疫苗、副猪。
25、嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎三联左旋咪唑白油佐剂灭活疫苗、副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎三联黄芩多糖白油佐剂灭活疫苗、副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎三联壳多糖白油佐剂灭活疫苗、副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎三联GEL01ST佐剂灭活疫苗对仔猪安全。0056实施例3疫苗效力研究00571试验设计005811疫苗免疫说明书CN104208667A6/12页90059取实施例1制备的疫苗，各种疫苗肌肉注射45周龄健康易感断奶仔猪，每头2ML一头份，每组20头，首免3周后二免，免疫剂量同一免，同时每组疫苗设20头作为对照，不免疫。0060购买市售的副猪嗜血杆菌灭活。
26、疫苗4型、5型，购自中牧实业股份有限公司，批号为1209006；猪链球菌灭活疫苗2型，购自广东永顺生物制品有限责任公司，批号2012010；猪支原体肺炎灭活疫苗J株，购自西班牙海博莱公司，批号为31KB1。上述购买的疫苗分别按其注射方法及注射剂量注射45周龄健康易感断奶仔猪。0061表2疫苗免疫分组0062006312攻毒0064免疫后5周，副猪嗜血杆菌采用腹腔内注射攻毒，攻毒剂量为副猪嗜血杆菌4型11010CFU、副猪嗜血杆菌5型11010CFU。免疫后5周，猪链球菌2型采用静脉注射攻毒，攻毒剂量为1109CFU。免疫后10周，猪肺炎支原体采用气管注射攻毒，攻毒用强毒株CVCC345株购自中。
27、国兽医药品监察所，该菌株为中国兽医药品监察所报藏的猪支原体肺炎疫苗效力检验用毒株气管注射5ML/头100MID。攻毒分组如下表3。0065表3攻毒分组0066说明书CN104208667A7/12页100067006812效力检验结果0069副猪嗜血杆菌、猪链球菌攻毒后观察2周，记录免疫组及对照组临床症状及死亡头数。猪支原体肺炎攻毒后观察30日，记录免疫组及对照组临床症状及死亡头数。结果见下表。0070表4效力检验结果0071说明书CN104208667A108/12页110072效力检验结果显示在白油佐剂基础上添加免疫增强剂左旋咪唑、黄芩多糖、壳多糖，对于副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、。
28、猪链球菌病的保护力并无明显增加，均达80以上，而左旋咪唑与壳多糖却可以增加猪支原体肺炎的保护力，达80。SEPPIC佐剂GEL01ST的三联苗，副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌病保护力与其他佐剂相比无明显差异，均在80以上，但猪支原体肺炎的保护力却明显高于其他佐剂疫苗，可达100。为此副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪支原体肺炎三联灭活疫苗选用GEL01ST佐剂，免疫效果可达最佳。0073副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪支原体肺炎三联灭活疫苗与市售的副猪嗜血杆菌灭活疫苗、猪链球菌病灭活疫苗及猪支原体肺炎灭活疫苗相比，相应病原的免疫保护力基本相当，但可以达到一针多防、降低成本、减少猪只应激。
29、的目的。0074实施例40075一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤00761分别培养副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体，制备得到活菌液；00772利用甲醛分别对步骤1制备得到的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体进行灭活；00783利用超滤方法对步骤2灭活后的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体进行浓缩，后经生理盐水重悬浮菌体，再分别调整菌体浓度至1012CFU/ML；00794取步骤3调整浓度后的副猪嗜血杆菌4型菌液、副猪嗜血杆菌5型菌液、猪链球菌2型菌液、猪肺炎支原体菌液以1212V/V的比例混匀。
30、得到混合抗原溶液；说明书CN104208667A119/12页1200805取步骤4得到的混合抗原溶液与疫苗佐剂混合制得三联灭活疫苗。0081实施例50082一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤00831分别培养副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体，制备得到活菌液；00842利用甲醛分别对步骤1制备得到的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体进行灭活；00853利用超滤方法对步骤2灭活后的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体进行浓缩，后经生理盐水重悬浮菌体，再分别调整菌体浓度至1010CFU/ML；0086。
31、4取步骤3调整浓度后的副猪嗜血杆菌4型菌液、副猪嗜血杆菌5型菌液、猪链球菌2型菌液、猪肺炎支原体菌液以1111V/V的比例混匀得到混合抗原溶液；00875取步骤4得到的混合抗原溶液与疫苗佐剂混合制得三联灭活疫苗。0088其中步骤1培养猪肺炎支原体的培养基为以下配方0089牛心浸出液300份；0090双蒸水360份；0091HANKS溶液40份；0092025W/V酚红10份；0093马血清200份；00945W/V水解乳蛋白100份；009525W/V酵母浸出液20份；009610万单位青霉素10份。0097步骤1培养猪肺炎支原体的培养基制备方法如下取配方量的牛心浸出液、双蒸水混匀，将其PH值。
32、调至74，灭菌，再加入无菌的配方量的HANKS溶液、酚红、马血清、水解乳蛋白、酵母浸出液、青霉素混匀。0098步骤5具体包括以下流程0099取权利要求1步骤4所述的混合抗原溶液，向其中加入吐温80、左旋咪唑、黄芩多糖、壳多糖的其中一种完全溶解即为水相；0100取白油佐剂与上述水相以5050V/V的比例混合乳化，乳化过程中或乳化前加入硫柳汞，即得到三联灭活疫苗。0101所述白油佐剂制备方法为取司本80与白油按397V/V的比例混合，再向该混合物中加入2V/V的硬脂酸铝，加热熔化混匀，高压灭菌。0102水相的制备具体包括以下流程向混合抗原溶液中加入28V/V的吐温80混匀至完全溶解即为水相；或向混。
33、合抗原溶液中加入左旋咪唑，至左旋咪唑终浓度200MG/ML，即为水相；或向混合抗原溶液中加入黄芩多糖，至黄岑多糖终浓度为335MG/ML，即为水相；或向混合抗原溶液中加入壳多糖，至终浓度为10MG/ML，即为水相。0103步骤5具体包括以下流程0104取权利要求1步骤4所述的混合抗原溶液，以10V/V的比例向其中加入GEL01ST佐剂混匀，即得到三联灭活疫苗；说明书CN104208667A1210/12页130105实施例60106一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤01071分别培养副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体，制备得到活菌液；01082利用甲醛。
34、分别对步骤1制备得到的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体进行灭活；01093利用超滤方法对步骤2灭活后的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体进行浓缩，后经生理盐水重悬浮菌体，再分别调整菌体浓度至107CFU/ML；01104取步骤3调整浓度后的副猪嗜血杆菌4型菌液、副猪嗜血杆菌5型菌液、猪链球菌2型菌液、猪肺炎支原体菌液以1122V/V的比例混匀得到混合抗原溶液；01115取步骤4得到的混合抗原溶液与疫苗佐剂混合制得三联灭活疫苗。0112其中步骤1培养猪肺炎支原体的培养基为以下配方0113牛心浸出液300份；0114双蒸水360份；0115。
35、HANKS溶液40份；0116025W/V酚红10份；0117马血清200份；01185W/V水解乳蛋白100份；011925W/V酵母浸出液20份；012010万单位青霉素10份。0121步骤1培养猪肺炎支原体的培养基制备方法如下取配方量的牛心浸出液、双蒸水混匀，将其PH值调至72，灭菌，再加入无菌的配方量的HANKS溶液、酚红、马血清、水解乳蛋白、酵母浸出液、青霉素混匀。0122步骤5具体包括以下流程0123取权利要求1步骤4所述的混合抗原溶液，向其中加入吐温80、左旋咪唑、黄芩多糖、壳多糖的其中一种完全溶解即为水相；0124取白油佐剂与上述水相以5545V/V的比例混合乳化，乳化过程中或。
36、乳化前加入硫柳汞，即得到三联灭活疫苗。0125所述白油佐剂制备方法为取司本80与白油按595V/V的比例混合，再向该混合物中加入15V/V的硬脂酸铝，加热熔化混匀，高压灭菌。0126水相的制备具体包括以下流程向混合抗原溶液中加入4V/V的吐温80混匀至完全溶解即为水相；或向混合抗原溶液中加入左旋咪唑，至左旋咪唑终浓度200MG/ML，即为水相；或向混合抗原溶液中加入黄芩多糖，至黄岑多糖终浓度为335MG/ML，即为水相；或向混合抗原溶液中加入壳多糖，至终浓度为10MG/ML，即为水相。0127步骤5具体包括以下流程0128取权利要求1步骤4所述的混合抗原溶液，以10V/V的比例向其中加入GEL。
37、01ST佐剂混匀，即得到三联灭活疫苗；0129实施例7说明书CN104208667A1311/12页140130一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤01311分别培养副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体，制备得到活菌液；01322利用甲醛分别对步骤1制备得到的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体进行灭活；01333利用超滤方法对步骤2灭活后的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体进行浓缩，后经生理盐水重悬浮菌体，再分别调整菌体浓度至109CFU/ML；01344取步骤3调整浓度后的副猪嗜血杆菌4型菌液、副猪。
38、嗜血杆菌5型菌液、猪链球菌2型菌液、猪肺炎支原体菌液以2211V/V的比例混匀得到混合抗原溶液；01355取步骤4得到的混合抗原溶液与疫苗佐剂混合制得三联灭活疫苗。0136其中步骤1培养猪肺炎支原体的培养基为以下配方0137牛心浸出液300份；0138双蒸水360份；0139HANKS溶液40份；0140025W/V酚红10份；0141马血清200份；01425W/V水解乳蛋白100份；014325W/V酵母浸出液20份；014410万单位青霉素10份。0145步骤1培养猪肺炎支原体的培养基制备方法如下取配方量的牛心浸出液、双蒸水混匀，将其PH值调至76，灭菌，再加入无菌的配方量的HANKS溶。
39、液、酚红、马血清、水解乳蛋白、酵母浸出液、青霉素混匀。0146步骤5具体包括以下流程0147取权利要求1步骤4所述的混合抗原溶液，向其中加入吐温80、左旋咪唑、黄芩多糖、壳多糖的其中一种完全溶解即为水相；0148取白油佐剂与上述水相以4555V/V的比例混合乳化，乳化过程中或乳化前加入硫柳汞，即得到三联灭活疫苗。0149所述白油佐剂制备方法为取司本80与白油按694V/V的比例混合，再向该混合物中加入25V/V的硬脂酸铝，加热熔化混匀，高压灭菌。0150水相的制备具体包括以下流程向混合抗原溶液中加入8V/V的吐温80混匀至完全溶解即为水相；或向混合抗原溶液中加入左旋咪唑，至左旋咪唑终浓度200MG/ML，即为水相；或向混合抗原溶液中加入黄芩多糖，至黄岑多糖终浓度为335MG/ML，即为水相；或向混合抗原溶液中加入壳多糖，至终浓度为10MG/ML，即为水相。0151步骤5具体包括以下流程0152取权利要求1步骤4所述的混合抗原溶液，以10V/V的比例向其中加入GEL01ST佐剂混匀，即得到三联灭活疫苗；0153以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应说明书CN104208667A1412/12页15包含在本发明的保护范围之内。说明书CN104208667A15。