万古霉素菌株及其发酵产万古霉素的方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201210318843.7	申请日：	2012.09.03
公开号：	CN102899268A	公开日：	2013.01.30
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C12N 1/20申请公布日:20130130\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 1/20申请日:20120903\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N1/20; C12P21/02; B09C1/10; C12R1/01(2006.01)N	主分类号：	C12N1/20
申请人：	常州大学
发明人：	蔡志强; 朱孝霖; 杨广花; 赵希岳
地址：	213164 江苏省常州市武进区滆湖路1号
优先权：
专利代理机构：	南京经纬专利商标代理有限公司 32200	代理人：	楼高潮
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内容摘要

本发明万古霉素菌株及其发酵产万古霉素的方法，属于生物制药技术领域。建议的分类命名为拟无支酸菌Amycolatopsis？sp.保藏编号为CGMCC？No.5238。本发明还公开了利用所述的万古霉素菌株M3-1？Amycolatopsissp.发酵产万古霉素的方法，以及其在环境修复中的应用，用于生物修复嘧啶水杨酸类农药污染土壤。本发明从自然界中自主选育获得一株拟无枝酸菌Amycolatopsissp.万古霉素生产菌株M3-1，该菌株的生产能力比目前报道的菌株高1.27倍，生产性能稳定，并且该菌株还可生物修复被嘧啶水杨酸类农药污染的土壤，有效提高农产品产量，降低该农药在土壤的残留。

权利要求书

权利要求书万古霉素菌株M3‑1,建议的分类命名为拟无支酸菌Amycolatopsis  sp.保藏编号为CGMCC No. 5238。
利用权利要求1所述的万古霉素菌株M3‑1  Amycolatopsis sp.发酵产万古霉素的方法，其特征在于按照下述步骤进行：
将菌株M3‑1 Amycolatopsis sp.进行液体发酵，种子培养基为牛肉膏3~8g/L，蛋白胨8~15g/L，NaCl 3~5g/L，pH 6.5~7.2；培养条件为25~32℃，120～200rpm，培养24~72h；发酵培养基为：糊精50g~100g/L，马铃薯100g~200g/L，玉米浆15~50g/L，黄豆粉20~35g/L，氯化钠 1.0~2g/L，磷酸氢二钾 0.1~0.3g/L，pH 6.6~7.2；发酵条件为：温度为26℃~30℃，pH为6.5～8.0，转速80～200rpm，通气量2～8L/h，培养时间90~140h；发酵液中万古霉素产率可达2.8~4.9g/L。
权利要求1所述的万古霉素菌株M3‑1  Amycolatopsis sp.在环境修复中的应用，用于生物修复嘧啶水杨酸类农药污染土壤。

说明书

说明书万古霉素菌株及其发酵产万古霉素的方法
技术领域
本发明涉及一种微生物的筛选、分离，尤其是涉及拟无枝酸菌菌株M3‑1(Amycolatopsis sp. M3‑1)的发酵产万古霉素，属于生物制药技术领域。

背景技术
万古霉素（Vancomycin）是一种糖肽类抗生素，由放线菌发酵产生的最具有典型代表的一种糖肽类抗生素，1956年由Micormick等从印尼土壤中筛选得到一株东方方拟无枝酸菌，从其发酵液中首次分离提取，并鉴定为万古霉素。主要有于治疗革兰氏阳性菌引发的感染，特别是对内酰胺类抗生素引起的耐药金黄色葡萄球菌引发的感染具有很好的疗效，被医学专家称为“人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线”和“王牌抗生素”。万古霉素作用机制是抑制G+菌细胞壁中的磷脂和多肽的生成，从而抑制细菌的生长与繁殖。
近年来，由于内酰胺类抗生素的广泛使用，造成大量的内酰胺类抗生素抗性G+细菌感染，而目前万古霉素已经成为对产生耐药性细菌治疗的最后一道防线，1958年美国礼莱公司开发出第一个万古霉素药物并获FDA批准上市，但由于万平霉素有较强的肾、耳毒性，万古霉素并未广泛使用，但随着抗药性细菌以及超级细菌的出现，万古霉素已经得到广泛的临床应用，1999年全球万古霉素销售近30吨，居全球抗生素的第23位，国际市场需求量仍维持在年增长3~4%。
目前万古霉素的生产主要是通过培养、发酵东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)或地中海拟无枝酸菌（Amycolatopsis mediterranei）而获得，现阶段我国的万古霉素生产的厂家不多，产万古霉素菌株均购自美国，国内发酵水平在3‑6g/L，
发明内容
本发明为了克服上述不足，从常州市南郊的麦田中采集土样，进行微生物的筛选、培养、鉴定、获得万古霉素菌株M3‑1,建议的分类命名为拟无支酸菌Amycolatopsis  sp.该菌株已于2011年9月9日保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No. 5238。
该菌株M3‑1在发酵抗生素的应用，可应用本发明的菌株M3‑1发酵生产万古霉素。
利用上述万古霉素菌株M3‑1  Amycolatopsis sp.发酵产万古霉素的方法，按照下述步骤进行：
将菌株Amycolatopsis sp. M3‑1进行液体发酵，种子培养基为牛肉膏3~8g/L，蛋白胨8~15g/L，NaCl 3~5g/L，pH 6.5~7.2；培养条件为25~32℃，120～200rpm，培养24~72h；发酵培养基为：糊精50g~100g/L，马铃薯100g~200g/L，玉米浆15~50g/L，黄豆粉20~35g/L，氯化钠 1.0~2g/L，磷酸氢二钾 0.1~0.3g/L，pH 6.6~7.2；发酵条件为：温度为26℃~30℃，pH为6.5～8.0，转速80～200rpm，通气量2～8L/h，培养时间90~140h；发酵液中万古霉素产率可达2.8~4.9g/L。
该菌株M3‑1在环境修复中的应用，可应用本发明的菌株M3‑1生物修复嘧啶水杨酸类农药污染土壤。
    本发明的优点，从自然界中自主选育获得一株拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.万古霉素生产菌株M3‑1，该菌株的生产能力比目前报道的菌株高1.27倍，生产性能稳定，并且该菌株还可生物修复被嘧啶水杨酸类农药污染的土壤，有效提高农产品产量，降低该农药在土壤的残留。
具体实施方式
本发明从常州市南郊的麦田中采集土样，历时3年，进行微生物的筛选、培养、鉴定、发酵条件初步优化，最终获得万古霉素菌株M3‑1,建议的分类命名为拟无支酸菌Amycolatopsis  sp.该菌株已于2011年9月9日保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No. 5238。
本发明所述的产万古霉素菌株Amycolatopsis sp. M3‑1，好氧菌，在高氏一号或肉汤培养基上，菌落呈圆形馒头状，中间隆起且厚，边缘呈放射状，无内生孢子，孢子呈白色，无宏观可见气生菌丝，细胞成念珠状盘旋堆团，轻微搅动时断裂成短杆状小体，长（1.5~1.8）μm，宽（0.8~1.0）μm。该菌所用的培养基为：
（1）    可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂15～20g，水1000mL，pH7.0～7.2。
（2）    牛肉膏 0.5g，蛋白胨1.0g，NaCl 0.5g，琼脂 1.8~2.0g，水100mL。
菌株Amycolatopsis sp. M3‑1在高氏一号培养和肉汤培养上均可生长，菌落呈圆形馒头状，中间隆起且厚，边缘呈放射状，无内生孢子，孢子呈白色，无宏观可见气生菌丝，细胞成念珠状盘旋堆团，轻微搅动时断裂成短杆状小体，长（1.5~1.8）μm，宽（0.8~1.0）μm。
生理生化特征：革兰氏阳性，好氧，过氧化氢酶阳性，氧化酶试验阴性，柠檬酸盐试验阳性，明胶试验阳性，吲哚试验阳性，淀粉水解试验阳性，甲基红试验阴性，V‑P试验阴性。
该菌生长温度范围：15‑43，最适生长温度范围：25‑37，最适pH为6.0~8.0。
下面以具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例1
将菌株Amycolatopsis sp. M3‑1进行液体发酵培养培养，液体发酵种子培养基为牛肉膏3~8g/L，蛋白胨8~15g/L，NaCl 3~5g/L，pH 6.5~7.2；培养条件为25~32℃，120～200rpm，培养24~72h；发酵培养基为：糊精50g~100g/L，马铃薯100g~200g/L，玉米浆15~50g/L，黄豆粉20~35g/L，氯化钠 1.0~2g/L，磷酸氢二钾 0.1~0.3g/L，pH 6.6~7.2。发酵条件为：温度为26℃~30℃，pH为6.5～8.0，转速80～200rpm，通气量2～8L/h，培养时间90~140h；通过HPLC检测万古霉素产率可达2.8~4.9g/L。
实施例2
将菌株Amycolatopsis sp. M3‑1应用于污染丙酯草醚的土壤，将活化后的M3‑1以8%的接种量接种于供试土壤中，同时设定一组空白(灭菌土样不加菌)，每个处理设3个重复。丙酯草醚的加入量为100mg/kg，于35℃下通气培养，保持土壤含水量为60%WHC，分别于处理后的5d、10d、15d、20d、25d、30d、45d、60d、75d和90d采样分析。加入高效降解菌M3‑1的土样中，处理的前20d，丙酯草醚的去除效果明显，丙酯草醚的残留量急剧下降，而处理的20d~90d丙酯草醚的去除速率逐渐减慢。培养25d，丙酯草醚的残留量为38.4%，与空白对照，按照降解率公式计算，其降解率可达53.7%。表明M3‑1能快速适应土壤环境，发挥生物强化作用对污染的土壤进行修复，具有很好的应用前景。

资源描述

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1、(10)申请公布号 CN 102899268 A(43)申请公布日 2013.01.30CN102899268A*CN102899268A*(21)申请号 201210318843.7(22)申请日 2012.09.03CGMCC NO.5238 2011.09.09C12N 1/20(2006.01)C12P 21/02(2006.01)B09C 1/10(2006.01)C12R 1/01(2006.01)(71)申请人常州大学地址 213164 江苏省常州市武进区滆湖路1号(72)发明人蔡志强朱孝霖杨广花赵希岳(74)专利代理机构南京经纬专利商标代理有限公司 32200代理人楼高潮。

2、(54) 发明名称万古霉素菌株及其发酵产万古霉素的方法(57) 摘要本发明万古霉素菌株及其发酵产万古霉素的方法，属于生物制药技术领域。建议的分类命名为拟无支酸菌Amycolatopsis sp.保藏编号为CGMCC No.5238。本发明还公开了利用所述的万古霉素菌株M3-1 Amycolatopsissp.发酵产万古霉素的方法，以及其在环境修复中的应用，用于生物修复嘧啶水杨酸类农药污染土壤。本发明从自然界中自主选育获得一株拟无枝酸菌Amycolatopsissp.万古霉素生产菌株M3-1，该菌株的生产能力比目前报道的菌株高1.27倍，生产性能稳定，并且该菌株还可生物修复被嘧啶水杨酸类农药污染。

3、的土壤，有效提高农产品产量，降低该农药在土壤的残留。(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.权利要求书1页说明书3页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 3 页1/1页21.万古霉素菌株M3-1,建议的分类命名为拟无支酸菌Amycolatopsis sp.保藏编号为CGMCC No. 5238。2.利用权利要求1所述的万古霉素菌株M3-1 Amycolatopsis sp.发酵产万古霉素的方法，其特征在于按照下述步骤进行：将菌株M3-1 Amycolatopsis sp.进行液体发酵，种子培养基为牛肉膏38g/L，蛋白胨815g/L，NaCl 。

4、35g/L，pH 6.57.2；培养条件为2532，120200rpm，培养2472h；发酵培养基为：糊精50g100g/L，马铃薯100g200g/L，玉米浆1550g/L，黄豆粉2035g/L，氯化钠 1.02g/L，磷酸氢二钾 0.10.3g/L，pH 6.67.2；发酵条件为：温度为2630，pH为6.58.0，转速80200rpm，通气量28L/h，培养时间90140h；发酵液中万古霉素产率可达2.84.9g/L。3.权利要求1所述的万古霉素菌株M3-1 Amycolatopsis sp.在环境修复中的应用，用于生物修复嘧啶水杨酸类农药污染土壤。权利要求书CN 1028992。

5、68 A1/3页3万古霉素菌株及其发酵产万古霉素的方法技术领域0001 本发明涉及一种微生物的筛选、分离，尤其是涉及拟无枝酸菌菌株M3-1(Amycolatopsis sp. M3-1)的发酵产万古霉素，属于生物制药技术领域。0002 背景技术0003 万古霉素（Vancomycin）是一种糖肽类抗生素，由放线菌发酵产生的最具有典型代表的一种糖肽类抗生素，1956年由Micormick等从印尼土壤中筛选得到一株东方方拟无枝酸菌，从其发酵液中首次分离提取，并鉴定为万古霉素。主要有于治疗革兰氏阳性菌引发的感染，特别是对内酰胺类抗生素引起的耐药金黄色葡萄球菌引发的感染具有很好的疗效，被医学专家称为“。

6、人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线”和“王牌抗生素”。万古霉素作用机制是抑制G+菌细胞壁中的磷脂和多肽的生成，从而抑制细菌的生长与繁殖。0004 近年来，由于内酰胺类抗生素的广泛使用，造成大量的内酰胺类抗生素抗性G+细菌感染，而目前万古霉素已经成为对产生耐药性细菌治疗的最后一道防线，1958年美国礼莱公司开发出第一个万古霉素药物并获FDA批准上市，但由于万平霉素有较强的肾、耳毒性，万古霉素并未广泛使用，但随着抗药性细菌以及超级细菌的出现，万古霉素已经得到广泛的临床应用，1999年全球万古霉素销售近30吨，居全球抗生素的第23位，国际市场需求量仍维持在年增长34%。0005 目前万古霉素的生产。

7、主要是通过培养、发酵东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)或地中海拟无枝酸菌（Amycolatopsis mediterranei）而获得，现阶段我国的万古霉素生产的厂家不多，产万古霉素菌株均购自美国，国内发酵水平在3-6g/L，发明内容0006 本发明为了克服上述不足，从常州市南郊的麦田中采集土样，进行微生物的筛选、培养、鉴定、获得万古霉素菌株M3-1,建议的分类命名为拟无支酸菌Amycolatopsis sp.该菌株已于2011年9月9日保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），。

8、保藏编号为CGMCC No. 5238。0007 该菌株M3-1在发酵抗生素的应用，可应用本发明的菌株M3-1发酵生产万古霉素。0008 利用上述万古霉素菌株M3-1 Amycolatopsis sp.发酵产万古霉素的方法，按照下述步骤进行：将菌株Amycolatopsis sp. M3-1进行液体发酵，种子培养基为牛肉膏38g/L，蛋白胨815g/L，NaCl 35g/L，pH 6.57.2；培养条件为2532，120200rpm，培养2472h；发酵培养基为：糊精50g100g/L，马铃薯100g200g/L，玉米浆1550g/L，黄豆粉2035g/L，氯化钠 1.02g/L，磷酸氢二钾。

9、0.10.3g/L，pH 6.67.2；发酵条件为：温度为2630，pH为6.58.0，转速80200rpm，通气量28L/h，培养时间90140h；发酵液中万古霉素说明书CN 102899268 A2/3页4产率可达2.84.9g/L。0009 该菌株M3-1在环境修复中的应用，可应用本发明的菌株M3-1生物修复嘧啶水杨酸类农药污染土壤。0010 本发明的优点，从自然界中自主选育获得一株拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.万古霉素生产菌株M3-1，该菌株的生产能力比目前报道的菌株高1.27倍，生产性能稳定，并且该菌株还可生物修复被嘧啶水杨酸类农药污染的土壤，有效提高农产品产量，降。

10、低该农药在土壤的残留。具体实施方式0011 本发明从常州市南郊的麦田中采集土样，历时3年，进行微生物的筛选、培养、鉴定、发酵条件初步优化，最终获得万古霉素菌株M3-1,建议的分类命名为拟无支酸菌Amycolatopsis sp.该菌株已于2011年9月9日保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No. 5238。0012 本发明所述的产万古霉素菌株Amycolatopsis sp. M3-1，好氧菌，在高氏一号或肉汤培养基上，菌落呈圆形馒头状，中间隆起且厚，边缘呈放射状，无内生孢子，孢子。

11、呈白色，无宏观可见气生菌丝，细胞成念珠状盘旋堆团，轻微搅动时断裂成短杆状小体，长（1.51.8）m，宽（0.81.0）m。该菌所用的培养基为：（1）可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO43H2O 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，FeSO47H2O 0.01g，琼脂1520g，水1000mL，pH7.07.2。0013 （2）牛肉膏 0.5g，蛋白胨1.0g，NaCl 0.5g，琼脂 1.82.0g，水100mL。0014 菌株Amycolatopsis sp. M3-1在高氏一号培养和肉汤培养上均可生长，菌落呈圆形馒头状，中间隆起且厚，边缘呈放射状，无内生孢。

12、子，孢子呈白色，无宏观可见气生菌丝，细胞成念珠状盘旋堆团，轻微搅动时断裂成短杆状小体，长（1.51.8）m，宽（0.81.0）m。0015 生理生化特征：革兰氏阳性，好氧，过氧化氢酶阳性，氧化酶试验阴性，柠檬酸盐试验阳性，明胶试验阳性，吲哚试验阳性，淀粉水解试验阳性，甲基红试验阴性，V-P试验阴性。0016 该菌生长温度范围：15-43，最适生长温度范围：25-37，最适pH为6.08.0。0017 下面以具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。0018 实施例1将菌株Amycolatopsis sp. M3-1进行液体发酵培养培养，液体发酵种子培养基为牛肉膏38g/L，蛋白胨815g/L，。

13、NaCl 35g/L，pH 6.57.2；培养条件为2532，120200rpm，培养2472h；发酵培养基为：糊精50g100g/L，马铃薯100g200g/L，玉米浆1550g/L，黄豆粉2035g/L，氯化钠 1.02g/L，磷酸氢二钾 0.10.3g/L，pH 6.67.2。发酵条件为：温度为2630，pH为6.58.0，转速80200rpm，通气量28L/h，培养时间90140h；通过HPLC检测万古霉素产率可达2.84.9g/L。0019 实施例2将菌株Amycolatopsis sp. M3-1应用于污染丙酯草醚的土壤，将活化后的M3-1以8%的接种量接种于供试土壤中，同时设定一。

14、组空白(灭菌土样不加菌)，每个处理设3个重说明书CN 102899268 A3/3页5复。丙酯草醚的加入量为100mg/kg，于35下通气培养，保持土壤含水量为60%WHC，分别于处理后的5d、10d、15d、20d、25d、30d、45d、60d、75d和90d采样分析。加入高效降解菌M3-1的土样中，处理的前20d，丙酯草醚的去除效果明显，丙酯草醚的残留量急剧下降，而处理的20d90d丙酯草醚的去除速率逐渐减慢。培养25d，丙酯草醚的残留量为38.4%，与空白对照，按照降解率公式计算，其降解率可达53.7%。表明M3-1能快速适应土壤环境，发挥生物强化作用对污染的土壤进行修复，具有很好的应用前景。说明书CN 102899268 A。

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