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1、(10)申请公布号 CN 102827906 A(43)申请公布日 2012.12.19CN102827906A*CN102827906A*(21)申请号 201210196922.5(22)申请日 2012.06.15C12P 21/06(2006.01)C08B 37/08(2006.01)(71)申请人四川大学地址 610065 四川省成都市武侯区一环路南一段24号(72)发明人李德富 毕彩霞 穆畅道 李新莹王瑞瑞 葛黎明(54) 发明名称一种II型胶原和硫酸软骨素的综合提取工艺(57) 摘要本发明公开了一种II型胶原和硫酸软骨素的综合提取工艺。本方法以新鲜牛关节软骨为原料，经脱脂、脱钙。
2、后，分散于乙酸溶液，经过酶解、离心，所得上清液再经过盐析、透析和冷冻干燥后得II型胶原。离心所得沉淀溶于NaOH溶液，加胰蛋白酶，40酶解后经脱色、乙醇沉淀、透析和冷冻干燥后得硫酸软骨素。II型胶原是软骨基质的主要有机成分，在组织工程、食品等领域有着广泛应用。硫酸软骨素普遍存在于人和动物的软骨组织中，具有降血脂、抗肿瘤等多种功能，具有广阔的应用前景。本发明实现了牛软骨II型胶原和硫酸软骨素的综合利用，为废弃物资源化利用提供了一条新的思路。(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书3页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 3 页1/1页21.一种I。
3、I型胶原和硫酸软骨素的综合提取工艺，其特征是提取步骤如下：1）原料预处理取新鲜牛关节软骨，切成小块，放入质量分数为5%30%的NaCl溶液中，于2025下搅拌2448h，过滤，蒸馏水洗涤24次，然后放入0.51mol/L的乙酸溶液中，于2025下搅拌2448h，蒸馏水洗涤24次，粉碎；2）II型胶原的提取将上述粉碎物分散于0.5mol/L乙酸溶液中，加胃蛋白酶，其中胃蛋白酶与软骨的质量比按干重计为1：（5100），震荡摇匀，室温下酶解72100h，之后在室温下20004000r/min离心10min，得上清液A和沉淀B；取上清液A，加入NaCl溶液至NaCl的终浓度为0.72.0mol/L，静。
4、置过夜，离心后得白色絮状物；将上述白色絮状物装入透析袋，于蒸馏水中透析，每隔12小时换一次水，直至透析袋外蒸馏水的电导率不变为止，得II型胶原溶液，冷冻干燥后得II型胶原干品；3）硫酸软骨素的提取将沉淀B添加到5%10%NaOH溶液中，40下搅拌12h，调pH值至7.09.5，之后按沉淀质量的1/(50100)加入胰蛋白酶，40下搅拌酶解210h，得酶解液；向上述酶解液中加入活性炭脱色14h，过滤，离心，之后向离心所得上清液中加16倍体积的95%乙醇，静置沉淀612h，得沉淀物；将上述沉淀物装入透析袋内，于蒸馏水中透析，每隔12小时换一次水，直至透析袋外蒸馏水的电导率不变为止，得纯化后的硫酸软。
5、骨素溶液，冷冻干燥后得硫酸软骨素干品。2. 根据权利要求1所述的II型胶原和硫酸软骨素的综合提取工艺，其特征是步骤2）中粉碎物与乙酸溶液的质量比为1：（10150）。3. 根据权利要求1所述的II型胶原和硫酸软骨素的综合提取工艺，其特征是步骤3）中沉淀B与NaOH溶液的质量比为1：（215）。4. 根据权利要求1所述的II型胶原和硫酸软骨素的综合提取工艺，其特征是步骤3）中所添加活性炭的质量占滤液质量的1%10%。权 利 要 求 书CN 102827906 A1/3页3一种 II 型胶原和硫酸软骨素的综合提取工艺技术领域0001 本发明涉及一种从牛关节软骨中综合提取II型胶原蛋白和硫酸软骨素的。
6、工艺。背景技术0002 胶原蛋白是一类具有独特结构的蛋白质，广泛存在于动物组织中。II型胶原属于原纤维胶原蛋白，主要由3条相同的1(II)链以螺旋的方式构成软骨的基本结构，是软骨基质的主要有机成分，具有维持关节软骨形态结构和抗张强度的功能。II型胶原蛋白特有的结构和化学组成使其在生物医学材料、药物输送载体、组织工程、化妆品及食品等领域中得到了广泛应用。近年来的研究表明，具有完整三股螺旋结构的II型胶原还可以作为药物和保健品来防治类风湿性关节炎，因而研究和开发II型胶原具有重要的理论和实际意义。0003 硫酸软骨素属于糖胺聚糖，它是由D-葡糖醛酸和N-乙酰D-氨基半乳糖以1,3糖苷键结合的双糖为。
7、基本单位聚合而成的大分子多糖，广泛分布于人和动物组织中，是构成动物软骨、腱、皮肤等结合组织的重要组成部分。根据硫酸基团在N-乙酰D-氨基半乳糖上的位置不同，可将其分为硫酸软骨素A、硫酸软骨素C等。硫酸软骨素用途广泛，可用在改善风湿性关节炎和治疗头痛、冠心病、心绞痛等的药物中；可用于防治因链霉素引起的听觉障碍及肝炎的辅助治疗；因其具有降血脂、抗凝血活性，可用于高血脂、冠心病、动脉粥样硬化等心血管疾病的防治；硫酸软骨素还具有保水性、保胶性和高粘性，可与某些物质调制成化妆品用于保护皮肤的健美。此外，研究表明硫酸软骨素与铜等金属离子结合可用于治疗皮肤病；与硝酸铋或氢氧化铝反应得到的络合物可用于治疗消化。
8、性溃疡；与苯甲酸酯、利多卡因或布比卡因作用生成的衍生物可用作麻醉剂。0004 胶原的提取方法主要有酸法、碱法、中性盐法和酶法，工艺过程大致可归结为除杂、溶出、析出、纯化四个阶段。具体的操作方式和控制条件因原料的不同而有所差异。其中酶解提取法由于具有较高的效率而得到最广泛的应用。硫酸软骨素的生产工艺也有很多，主要有浓碱提取、稀碱浓盐提取、稀碱提取及碱解酶解提取法等，但都有其不完善的地方。浓碱提取工艺产品颜色较深，且废碱液对环境的危害较大；稀碱提取工艺蛋白质含量和氮含量较高，生产周期较长；稀碱浓盐提取工艺，产率和纯度都不高。其中碱解酶法生产的产品质量较高，且大大缩短了生产周期，但是最佳的工艺条件没。
9、有确定，需要进一步优化提取条件，提高产品质量，缩减生产成本。0005 目前，II型胶原和硫酸软骨素的提取、分离、纯化工艺已经比较成熟，但是国内外对这两种物质的提取大都是分开进行的，提取其中一种物质时，另一种物质会被变性处理或者丢弃，造成了极大的资源浪费。本专利将两种物质的提取分离方法结合起来，寻找到一种较温和的提取工艺，实现了II型胶原和硫酸软骨素的综合利用。发明内容0006 目前，国内外关于II型胶原和硫酸软骨素的提取大都是分开进行的，提取一种物质时，另一种物质被变性处理或者变性，因此造成了极大的资源浪费，针对这一问题，本专说 明 书CN 102827906 A2/3页4利提供了一种II型胶。
10、原和硫酸软骨素的综合提取工艺。0007 本发明通过以下技术方案实现，具体步骤如下：1）原料预处理取新鲜牛关节软骨，切成小块，放入质量分数为5%30%的NaCl溶液中，于2025下搅拌2448h，过滤，蒸馏水洗涤24次，然后放入0.51mol/L的乙酸溶液中，于2025下搅拌2448h，蒸馏水洗涤24次，粉碎；2）II型胶原的提取将上述粉碎物分散于0.5mol/L乙酸溶液中，加胃蛋白酶，其中胃蛋白酶与软骨的质量比按干重计为1：（5100），震荡摇匀，室温下酶解72100h，之后在室温下20004000r/min离心10min，得上清液A和沉淀B；取上清液A，加入NaCl溶液至NaCl的终浓度为0。
11、.72.0mol/L，静置过夜，离心后得白色絮状物；将上述白色絮状物装入透析袋，于蒸馏水中透析，每隔12小时换一次水，直至透析袋外蒸馏水的电导率不变为止，得II型胶原溶液，冷冻干燥后得II型胶原干品；3）硫酸软骨素的提取将沉淀B添加到5%10%NaOH溶液中，40下搅拌12h，调pH值至7.09.5，之后按沉淀质量的1/(50100)加入胰蛋白酶，40下搅拌酶解210h，得酶解液；向上述酶解液中加入活性炭脱色14h，过滤，离心，之后向离心所得上清液中加16倍体积的95%乙醇，静置沉淀612h，得沉淀物；将上述沉淀物装入透析袋内，于蒸馏水中透析，每隔12小时换一次水，直至透析袋外蒸馏水的电导率不。
12、变为止，得纯化后的硫酸软骨素溶液，冷冻干燥后得硫酸软骨素干品。0008 在上述方案中，步骤2）中粉碎物与乙酸溶液的质量比为1：（10150）。0009 在上述方案中，步骤3）中沉淀B与NaOH溶液的质量比为1：（215）。0010 在上述方案中，步骤3）中所添加活性炭的质量占滤液质量的1%10%。0011 本发明与已有技术相比，具有多方面的积极效果和优点，具体可归纳概括如下：（1）本发明以牛关节软骨为原料，采用比较温和的方法同时提取II型胶原和硫酸软骨素，保护了II型胶原和硫酸软骨素的生物活性；（2）本发明在原料预处理中，采用间歇式粉碎软骨，避免了II型胶原因连续粉碎致温度升高而变性；（3）本。
13、发明改进了以往分别提取II型胶原和硫酸软骨素而造成资源的极大浪费这一弊端，在保证两者不变性的基础上，将两者同时从牛关节软骨中提取出来，节约了资源；（4）本发明中所提取的II型胶原和硫酸软骨素的纯度较高，最终产品中II型胶原的含量达96%，硫酸软骨素的含量达92%。0012 具体实施方案：下面给出本发明的三个实施例，通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，实施例只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。0013 本发明通过以下技术方案实现，除特别说明外，所涉及的份数均为重量份数，百分说 明。
14、 书CN 102827906 A3/3页5比均为重量百分数。0014 实施例1：取新鲜牛关节软骨，切成小块，放入500mL的5%NaCl溶液中，于20下搅拌48h，过滤，蒸馏水洗涤2次，然后放入500mL的0.5mol/L乙酸溶液中，于20下搅拌48h，蒸馏水洗涤2次，粉碎机粉碎。称取预处理好的粉碎物20g，将其分散于400mL的0.5mol/L乙酸溶液中，加入0.4g的胃蛋白酶，室温下搅拌酶解98h，酶解结束后，3000r/min离心10min，得上清液A和沉淀B。取上清液A，加NaCl溶液至终浓度为0.9mol/L，静置过夜12h进行盐析，然后离心得白色絮状物，将上述白色絮状物装入透析袋，。
15、用蒸馏水透析3天，进行脱盐，得纯化后的II型胶原溶液，上述纯化后的II型胶原溶液真空冷冻干燥24h，得II型胶原干品。将沉淀B 添加到200mL的5%NaOH溶液中，于40下搅拌2h，调pH值至8.0，加入0.4g胰蛋白酶，40下酶解10h，添加5%活性炭脱色4h，过滤，离心。取离心后的上清液，以1：1的体积比加入95%乙醇，静置沉淀12h，得沉淀物。沉淀物用蒸馏水透析3天，然后真空冷冻干燥24h，得硫酸软骨素干品。0015 实施例2：取新鲜牛关节软骨，切成小块，放入400mL的7.5%NaCl溶液中，于25下搅拌36h，过滤，蒸馏水洗涤2次，然后放入400mL的0.75 mol/L乙酸溶液中。
16、，于25下搅拌36h，蒸馏水洗涤2次，粉碎机粉碎。称取预处理好的粉碎物30g，将其分散于1500mL的0.5mol/L乙酸溶液中，加入1.0g的胃蛋白酶，室温下搅拌酶解86h，酶解结束后，3000r/min离心10min，得上清液A和沉淀B。取上清液A，加NaCl溶液至终浓度为1.2mol/L，静置过夜12h进行盐析，然后离心得白色絮状物，将上述白色絮状物装入透析袋，用蒸馏水透析4天，进行脱盐，得纯化后的II型胶原溶液，上述纯化后的II型胶原溶液真空冷冻干燥24h，得II型胶原干品。将沉淀B添加到 180mL的8%NaOH溶液中，于40下搅拌1.5h，调pH值至8.5，加入0.5g胰蛋白酶，4。
17、0下酶解8h，添加7.5%活性炭脱色2h，过滤，离心。取离心后的上清液，以1：3的体积比加入95%乙醇，静置沉淀12h，得沉淀物。沉淀物用蒸馏水透析4天，然后真空冷冻干燥24h，得硫酸软骨素干品。0016 实施例3：取新鲜牛关节软骨，切成小块，放入300mL的10%NaCl溶液中，于25下搅拌24h，过滤，蒸馏水洗涤2次，然后放入300mL的0.5mol/L乙酸溶液中，于25下搅拌24h，蒸馏水洗涤2次，粉碎机粉碎。称取预处理好的粉碎物40g，将其分散于4000mL的0.5mol/L乙酸溶液中，加入4.0g的胃蛋白酶，室温下搅拌酶解72h，酶解结束后，3000r/min离心10min，得上清液A和沉淀B。取上清液A，加NaCl溶液至终浓度为1.5mol/L，静置过夜12h进行盐析，然后离心得白色絮状物，将上述白色絮状物装入透析袋，用蒸馏水透析5天，进行脱盐，得纯化后的II型胶原溶液，上述纯化后的II型胶原溶液真空冷冻干燥24h，得II型胶原干品。将沉淀溶于150mL的10%NaOH溶液中，于40下搅拌1h，调pH值至9.0，加入0.5g胰蛋白酶，40下酶解6h，添加10%活性炭脱色1h，过滤，离心。取离心后的上清液，以1：6的体积比加入95%乙醇，静置沉淀12h，得沉淀物。沉淀物用蒸馏水透析5天，然后真空冷冻干燥24h，得硫酸软骨素干品。说 明 书CN 102827906 A。