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1、10申请公布号CN104313065A43申请公布日20150128CN104313065A21申请号201410518170922申请日20141001C12P7/62200601C12R1/86520060171申请人青岛科技大学地址266061山东省青岛市崂山区松岭路99号72发明人张媛媛梁方方刘均洪54发明名称一种生产手性苯基丙酸甲酯的方法57摘要一种生产手性苯基丙酸甲酯的方法。用酿酒酵母细胞生物还原制备2S,3S3羟基2苯基丙酸甲酯，反应罐中加入磷酸盐缓冲液，底物2苯甲酰2丙烯酸甲酯浓度为8090G/L，加入湿酵母细胞进行生物还原反应，得到产物，产品收率高，对映体过量率高，具有很好的。
2、应用前景。51INTCL权利要求书1页说明书4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页10申请公布号CN104313065ACN104313065A1/1页21一种酿酒酵母细胞生物还原制备2S,3S3羟基2苯基丙酸甲酯的方法，其特征在于反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0607，PH为68，底物2苯甲酰2丙烯酸甲酯浓度为8090G/L，葡萄糖含量为1015G/L，木糖810G/L，吐温80含量为1520G/L，121高压灭菌30分钟；冷却至2829时，剧烈搅拌，使反应液乳化，加入湿酵母细胞使浓度为1013G/L，通气比为01015V/（V分钟），进行生物还原。
3、反应，反应时间为6070小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物2S,3S3羟基2苯基丙酸甲酯，反应转化率9496，产品收率9294，对映体过量率9798。2权利要求1所述的方法，其特征在于湿酵母细胞制备过程如下酿酒酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0607，121高压灭菌30分钟，冷却至2526，将酿酒酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为810，通气比为051V/（V分钟），2526培养3640小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。3权利要求1所述的方法，其特征在于培养液成份为蛋白胨152G/L，酵母浸。
4、膏810G/L，葡萄糖1822G/L，麦芽浸膏2530G，硫酸铵02025G/L，硫酸镁0304G/L，磷酸二氧钾1823G/L；固体培养基成份在液体培养基中加入152的琼脂粉。权利要求书CN104313065A1/4页3一种生产手性苯基丙酸甲酯的方法技术领域0001本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到酿酒酵母细胞生物还原制备手性医药中间体2S,3S3羟基2苯基丙酸甲酯的技术。背景技术0002羟基手性酯是合成手性药物、精细化学品、农药品和其他特殊材料的重要中间体。生物催化羰基化合物的不对称还原具有环境友好、条件温和、选择性高等优点,作为绿色高效制备羟基手性酯的优先途径,被越来越多地应用于生产。
5、一些高附加值的羟基手性酯。生物催化制备羟基手性酯具有很好的应用前景。0003生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点,是可持续发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中,水解酶能够催化动力学拆分外消旋体得到手性产品,在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来,氧化还原酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前,采用水解酶动力学拆分法、生物还原法和生物氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为421。0004生物还原法相对于动力学拆分法而言,最大的优势在于理论收率可达100,原子经济性好。然。
6、而生物还原反应需要辅酶或辅因子的参与,一定程度上限制了其应用。由于辅酶依赖性的缘故,生物还原反应中多釆用整细胞作为催化剂,实现体内辅酶循环再生的同时免去了酶的分离纯化步骤。00052S,3S3羟基2苯基丙酸甲酯是合成手性药物、精细化学品、农药品的重要手性砌块，由于有2个手性中心，使得化学合成较为困难，成本高。本发明将采用生物催化制备2S,3S3羟基2苯基丙酸甲酯。发明内容0006本发明采用细胞催化制备2S,3S3羟基2苯基丙酸甲酯，反应式如下底物2苯甲酰2丙烯酸甲酯（1）经酿酒酵母催化还原，得到产物2S,3S3羟基2苯基丙酸甲酯（2）。有多种微生物可以催化还原，经过大量实验筛选，最终确定采用酿。
7、酒酵母作为催化剂，因为其催化还原1的效果最好，反应收率、对映体过量率（EE）均很高。0007许多酿酒酵母都可以进行生物催化还原，然而，其效果不同，相差很大，经实验，本说明书CN104313065A2/4页4发明选用酿酒酵母菌株为ATCC201388D5。0008培养介质1、培养液成份蛋白胨152G/L，酵母浸膏810G/L，葡萄糖1822G/L，麦芽浸膏2530G，硫酸铵02025G/L，硫酸镁0304G/L，磷酸二氧钾1823G/L。00092、固体培养基成份在液体培养基中加入152的琼脂粉。0010酵母细胞制备。酿酒酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为060。
8、7，121高压灭菌30分钟，冷却至2526，将酿酒酵母ATCC201388D5种子液接种至发酵罐，接种比例为810，通气比为051V/（V分钟），即每分钟通气量为051倍发酵液体积，2526培养3640小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。0011反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0607，PH为68，底物2苯甲酰2丙烯酸甲酯浓度为8090G/L，葡萄糖含量为1015G/L，木糖810G/L，吐温80含量为1520G/L，121高压灭菌30分钟。冷却至2829时，剧烈搅拌，使反应液乳化，加入湿酵母细胞使浓度为1013G/L，通气比为0115V/（V分钟），即每分钟通。
9、气量为01015倍反应液体积，进行生物还原反应，反应时间为6070小时。反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物2S,3S3羟基2苯基丙酸甲酯，反应转化率9496，产品收率9294，对映体过量率（EE）9798。0012本发明所开展工作包括菌株选择（从近百个菌株中选择）、催化还原条件优化（反应温度、通气量、PH）、反应介质选择和浓度优化（底物浓度、葡萄糖含量、木糖含量、表面活性剂种类（20多种选1）及浓度、其它多种成份选择排除），还曾进行了水有机溶剂2相体系试验。由于试验量很大，尽管采用了响应面优化设计试验，大幅度减少了试验量，试验量仍然很大，全部试验进行2年多才完成。
10、，达成目前的技术方案。对于光活性产物而言，当反应转化率9496，产品收率9294时，对映体过量率（EE）仍然高达9798，是非常不易的，我们的工作取得了显著进步。0013实施例1培养液培养液成份为蛋白胨15G/L，酵母浸膏8G/L，葡萄糖18G/L，麦芽浸膏25G，硫酸铵02G/L，硫酸镁03G/L，磷酸二氧钾18G/L；固体培养基成份在液体培养基中加入152的琼脂粉。0014湿酵母细胞制备过程如下酿酒酵母ATCC201388D5经斜面、摇瓶培养，得到种子液。10L发酵罐加入培养液，装料系数为06，121高压灭菌30分钟，冷却至25，将酿酒酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为8，通气比为05V/。
11、（V分钟），即每分钟通气量为05倍发酵液体积。2526培养36小时，用离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。001515L反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为06，PH为68，底物2苯甲酰2丙烯酸甲酯浓度为80G/L，葡萄糖含量为10G/L，木糖810G/L，吐温80含量为15G/L，121高压灭菌30分钟；冷却至28时，剧烈搅拌，使反应液乳化，加入湿酵母细胞使浓度为10G/L，通气比为01V/（V分钟），即每分钟通气量为01倍反应液体积，进行生物还原反应，反应时间为60小时；反应结束后，滤出细胞，反应液用04倍反应液体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，蒸出乙酸乙酯，得到产物2S,。
12、3S3羟基2苯基丙酸甲酯，反应转化说明书CN104313065A3/4页5率94，产品收率92，对映体过量率（EE）98。0016实施例2培养液培养液成份为蛋白胨2G/L，酵母浸膏10G/L，葡萄糖22G/L，麦芽浸膏30G，硫酸铵025G/L，硫酸镁04G/L，磷酸二氧钾23G/L；固体培养基成份在液体培养基中加入152的琼脂粉。0017湿酵母细胞制备过程如下酿酒酵母ATCC201388D5经斜面、摇瓶、种子罐培养，得到种子液。50L发酵罐加入培养液，装料系数为07，121高压灭菌30分钟，冷却至26，将酿酒酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为10，通气比为1V/（V分钟），即每分钟通气量为1。
13、倍发酵液体积。2526培养40小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。0018100L反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为07，PH为68，底物2苯甲酰2丙烯酸甲酯浓度为90G/L，葡萄糖含量为15G/L，木糖810G/L，吐温80含量为20G/L，121高压灭菌30分钟；冷却至29时，剧烈搅拌，使反应液乳化，加入湿酵母细胞使浓度为13G/L，通气比为015V/（V分钟），即每分钟通气量为015倍反应液体积，进行生物还原反应，反应时间为70小时；反应结束后，用过滤式离心机滤出细胞，反应液用04倍反应液体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，蒸出乙酸乙酯，得到产物2S,3S3。
14、羟基2苯基丙酸甲酯，反应转化率96，产品收率94，对映体过量率（EE）97。0019实施例3培养液培养液成份为蛋白胨18G/L，酵母浸膏9G/L，葡萄糖20G/L，麦芽浸膏28G，硫酸铵022G/L，硫酸镁035G/L，磷酸二氧钾2G/L；固体培养基成份在液体培养基中加入152的琼脂粉。0020湿酵母细胞制备过程如下酿酒酵母ATCC201388D5经斜面、摇瓶、种子罐培养，得到种子液。500L发酵罐加入培养液，装料系数为065，121高压灭菌30分钟，冷却至255，将酿酒酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为9，通气比为075V/（V分钟），即每分钟通气量为075倍发酵液体积。255培养38小时，。
15、用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。00211000L反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为065，PH为68，底物2苯甲酰2丙烯酸甲酯浓度为85G/L，葡萄糖含量为1015G/L，木糖810G/L，吐温80含量为18G/L，121高压灭菌30分钟；冷却至285时，剧烈搅拌，使反应液乳化，加入湿酵母细胞使浓度为12G/L，通气比为012V/（V分钟），即每分钟通气量为012倍反应液体积，进行生物还原反应，反应时间为65小时；反应结束后，用过滤式离心机滤出细胞，反应液用04倍反应液体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，蒸出乙酸乙酯，得到产物2S,3S3羟基2苯基丙酸甲酯，反应转。
16、化率95，产品收率93，对映体过量率（EE）98。0022实施例4培养液培养液成份为蛋白胨17G/L，酵母浸膏10G/L，葡萄糖21G/L，麦芽浸膏29G，硫酸铵022G/L，硫酸镁037G/L，磷酸二氧钾21G/L；固体培养基成份在液体培养基中加入152的琼脂粉。0023湿酵母细胞制备过程如下酿酒酵母ATCC201388D5经斜面、摇瓶、种子罐培养，说明书CN104313065A4/4页6得到种子液。2000L发酵罐加入培养液，装料系数为065，121高压灭菌30分钟，冷却至26，将酿酒酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为10，通气比为08V/（V分钟），即每分钟通气量为08倍发酵液体积。26。
17、培养40小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。002410000L反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为065，PH为68，底物2苯甲酰2丙烯酸甲酯浓度为90G/L，葡萄糖含量为15G/L，木糖810G/L，吐温80含量为20G/L，121高压灭菌30分钟；冷却至29时，剧烈搅拌，使反应液乳化，加入湿酵母细胞使浓度为13G/L，通气比为015V/（V分钟），即每分钟通气量为015倍反应液体积，进行生物还原反应，反应时间为70小时；反应结束后，用过滤式离心机滤出细胞，用逆流萃取机萃取反应液，萃取剂为乙酸乙酯萃取，蒸出乙酸乙酯，得到产物2S,3S3羟基2苯基丙酸甲酯，反应转化率96，产品收率94，对映体过量率（EE）975。说明书CN104313065A。