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1、10申请公布号CN104313037A43申请公布日20150128CN104313037A21申请号201410494375822申请日20140924C12N15/40200601C12N15/70200601C07K14/08200601G01N33/56920060171申请人杭州诺威泰克生物技术有限公司地址311188浙江省杭州市钱江经济开发区兴国路519号5号楼318室72发明人吴晓杰74专利代理机构杭州裕阳专利事务所普通合伙33221代理人冯燕青54发明名称一种用于检测猪瘟病毒的重组抗原的制备方法57摘要本发明公开了一种用于检测猪瘟病毒的重组抗原的制备方法，一种用于检测猪瘟病毒的。
2、重组抗原的制备方法，包括如下步骤基因合成，构建重组表达载体，含有猪瘟病毒E2重组蛋白的表达，将重组表达质粒转化至大肠杆菌中，进行诱导表达，诱导之后，收集菌体；含有猪瘟病毒E2重组蛋白的纯化及复性。本发明提供的用于检测猪瘟病毒的重组抗原的制备方法，对猪瘟病毒主要抗原表位所在的E2全片段进行重组表达,这样就保留了全部E2的抗原决定簇位点,进而有效的避免了假阴性即漏检现象；具有生产周期短,产量高,成本低的优点。51INTCL权利要求书2页说明书17页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书17页附图1页10申请公布号CN104313037ACN104313037A。
3、1/2页21一种用于检测猪瘟病毒的重组抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤步骤A，基因合成，设计引物进行PCR反应，得到猪瘟病毒的E2基因序列如SEQIDNO1所示；步骤B，构建重组表达载体，步骤A中的基因序列测序成功后，将该基因序列用限制性内切酶进行双酶切之后，插入到用相同两个酶切处理的质粒表达载体中；步骤C，合有猪瘟病毒E2重组蛋白的表达，将步骤B中的重组表达质粒转化至大肠杆菌中，进行诱导表达，诱导之后，收集菌体；步骤D，合有猪瘟病毒E2重组蛋白的纯化及复性，将步骤C收集的菌体破碎提取重组蛋白，然后进行纯化及复性，得到重组蛋白氨基酸序列如SEQIDNO28所示。2根据权利要求1所述的用。
4、于检测猪瘟病毒的重组抗原的制备方法，其特征在于，步骤A中，设计引物如下CSFV1UATGCAGCTAGCCTGCAAGGAAGATTACAGGTACGCAATATCATCAACCAATGAGATACSFV1DATTCTTTCCAGGTGGTGGTGAGACCTCCGGCCCCGAGTAGCCCTATCTCATTGGTTGACSFV2UCCACCTGGAAAGAATACAACCACGATTTGCAACTGAATGACGGGACCGTTAAGGCCATTCSFV2DTGACCACATTAAGTGCTGTGACTTTAAAGGAACCTGCCACGCAAATGGCCTTAACGGTCSFV3UCAC。
5、TTAATGTGGTCAGTAGGAGGTATTTGGCATCATTGCATAAGGAGGCTTCACTCACTCSFV3DGAGGCTTCACTCACTTCCGTGACATTTGAGCTCCTGTTCGACGGGACCAACCCATCAACCSFV4UCAAATGGGCACAGCCCGAACCCGAAGTCATCTCCCATTTCCTCAGTTGATGGGTTGGTCCSFV4DCAAGGTTGTGTTGTACTTTCCCTTGACAACAGGACTCGTATCAAATGGGCACAGCCCSFV5UTACAACACAACCTTGTTGAACGGTAGTGCTTACTATCTTGTCTGTC。
6、CAATAGGGTGGACCSFV5DTTCTCAGAGTTGTTGGGCTCACTGCTGTGCACTCTATAACACCCGTCCACCCTATTGGACSFV6UCAACAACTCTGAGAACAGAAGTGGTAAAGACCTTCAGGAGGGACAAGCCCTTTCCGCACCSFV6DAATAAATCTTCATTTTCCACTGTTGTGGTCACACAATCCATTCTGTGCGGAAAGGGCTTCSFV7UAATGAAGATTTATTCTACTGTAAGTTGGGGGGCAACTGGACATGTGTGAAAGGTGAACCCSFV7DCACACCATCTGCATTGTTTTA。
7、CTAGCCCCCCCGTGTAGACCACTGGTTCACCTTTCACACSFV8UAATGCAGATGGTGTGGCTTTGACTTCAATGAGCCTGACGGACTCCCACACTACCCCATACSFV8DTCCACTATTCTGTAACCTGTCTCATTTGCCAAAATGCACTTACCTATGGGGTAGTGTGGCSFV9UTTACAGAATAGTGGATTCAACAGACTGTAACAGAGATGGTGTCGTAATCAGCACAGAGGCSFV9DATGCACCTTGACAGTTGTGTTACCGATCAAGCACTCATGACTCCCCTCTGTGCTGATTACS。
8、FV10UACTGTCAAGGTGCATGCATCAGATGAAAGACTGGGCCCCATGCCATGCAGACCTAAAGCSFV10DTGTACAGGAAGTTTTCCTTACAGGTCCTGCACTAGAGACGATCTCTTTAGGTCTGCATGCSFV11UAAAACTTCCTGTACATTCAACTACGCAAAAACTTTGAAGAACAAGTACTATGAGCCCAGCSFV11DACTGATACTCGCCCTTAAGCATATATTGCTGGAAGTAGCTGTCCCTGGGCTCATAGTACCSFV12UAAGGGCGAGTATCAGTACTGGTTTGACCTGGA。
9、CGTGACTGACCGCCACTCAGATTACTTCSFV12DTTCCTCCTAACAGTGCTACCACCACCAAGACAACAAATTCTGCGAAGTAATCTGAGTGGCSFV13UCACTGTTAGGAGGAAGATATGTCCTGTGGCTAATAGTGACCTACATAGTTTTAACAGACSFV13DACCAGCGGCGAGTTGTTCTGTTAAAACTA，将引物CSFV1U，CSFV1，D，CSFV2U，CSFV2D，CSFV3U，CSFV3D，CSFV4U，CSFV4D混合，进行PCR反应，所得产物命名为CSFV1；权利要求书CN104313037A2/2页3。
10、将引物CSFV5U，CSFV5D，CSFV6U，CSFV6D，CSFV7U，CSFV7D，CSFV8U，CSFV8D混合，进行PCR反应，所得产物命名为CSFV2；将引物CSFV9U，CSFV9D，CSFV10U，CSFV10D，CSFV11U，CSFV11D，CSFV12U，CSFV12D，CSFV13U，CSFV13D混合，进行PCR反应，所得产物命名为CSFV3；然后将上述三个产物CSFV1，CSFV2，CSFV3混合作为模板进行PCR反应，得到猪瘟病毒的E2基因序列如SEQIDNO1所示。3根据权利要求1所述的用于检测猪瘟病毒的重组抗原的制备方法，其特征在于，步骤C中将重组表达质粒转化。
11、至大肠杆菌BL21中，利用合硫酸卡那霉素的培养基进行筛选，挑取单克隆菌落后，用合有相同浓度的硫酸卡那霉素培养基37度培养至所需浓度，用IPTG进行诱导表达，诱导之后，低温离心收集菌体。4根据权利要求4所述的用于检测猪瘟病毒的重组抗原的制备方法，其特征在于，所述硫酸卡那霉素的浓度为100UG/ML。5根据权利要求4所述的用于检测猪瘟病毒的重组抗原的制备方法，其特征在于，诱导条件为37度，转速250RPM，5H，诱导的IPTG浓度为01MM。6根据权利要求1所述的用于检测猪瘟病毒的重组抗原的制备方法，其特征在于，步骤D中菌体采用超声破碎，破碎条件为200W，超声6S，间隔3S超声一次，共180次。。
12、7根据权利要求1所述的用于检测猪瘟病毒的重组抗原的制备方法，其特征在于，步骤D中重组蛋白的纯化方法为离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析中的一种。8根据权利要求1所述的用于检测猪瘟病毒的重组抗原的制备方法，其特征在于，步骤D中重组蛋白的纯化方法为亲和层析。9一种如权利要求1所述的重组蛋白在制备猪瘟病毒检测试剂中的应用。10一种检测猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求1所述的重组蛋白。权利要求书CN104313037A1/17页4一种用于检测猪瘟病毒的重组抗原的制备方法技术领域0001本发明属于生物技术及诊断研究领域，特别涉及一种用于检测猪瘟病毒的重组抗原的制备方法。背景技术0。
13、002猪瘟是由猪瘟病毒CLASSICALSWINEFEVERVIRUS，CSFV引起的一种传染性很强、致死率极高的热性传染病。能够引起热性全身性败血症、母猪流产、胎儿畸形等多种临床表现，从而给养猪业带来严重的危害，世界兽医局将其列为A类16种法定传染病之一。时至今日，猪瘟仍然是我国养猪业的第一大传染病。随着诊断技术和防疫的进步，世界上猪瘟的发生已经呈减少的趋势，猪瘟疫苗的使用时间及使用效果也影响的猪瘟病毒的危害性，因此检验疫苗的效果和决定疫苗使用的时间必将成为有效控制猪瘟病毒蔓延的有效措施之一。0003体外诊断核心原料的开发则是开发相应诊断试剂的先决条件，只有开发出具有高活性，高性能的抗原抗体。
14、，体外诊断试剂产品才能成为现实，因此，针对猪瘟病毒抗原开发出能够用以生产诊断试剂的原料迫在眉捷，从某种程度上说，原料的开发也必将成为降低猪瘟病毒感染首要解决的问题。0004目前大多生产原料公司在猪瘟病毒抗体诊断产品有选取猪瘟病毒E2的部分片段或者对选取的片段进行重组等，准确率不高，尤其以假阴现象较多。发明内容0005本发明针对上述缺点，提供了一种可用于检测猪瘟病毒的重组抗原的制备方法，目的是针对猪瘟病毒E2整体进行重组表达，以期用此抗原作为检测猪瘟病毒抗体的核心原料，避免假阴性的漏检现象。0006为实现上述目的，本发明采取下述技术方案来实现0007本发明提供一种用于检测猪瘟病毒的重组抗原的制备。
15、方法，包括如下步骤0008步骤A，基因合成，设计引物进行PCR反应，得到猪瘟病毒的E2基因序列如SEQIDNO1所示；0009步骤B，构建重组表达载体，步骤A中的基因序列测序成功后，将该基因序列用限制性内切酶进行双酶切之后，插入到用相同两个酶切处理的质粒表达载体中；0010步骤C，合有猪瘟病毒E2重组蛋白的表达，将步骤B中的重组表达质粒转化至大肠杆菌中，进行诱导表达，诱导之后，收集菌体；0011步骤D，合有猪瘟病毒E2重组蛋白的纯化及复性，将步骤C收集的菌体破碎提取重组蛋白，然后进行纯化及复性，得到重组蛋白氨基酸序列如SEQIDNO28所示。0012进一步，步骤A中，设计引物如下0013CSF。
16、V1U0014ATGCAGCTAGCCTGCAAGGAAGATTACAGGTACGCAATATCATCAACCAATGAGATA说明书CN104313037A2/17页50015CSFV1D0016ATTCTTTCCAGGTGGTGGTGAGACCTCCGGCCCCGAGTAGCCCTATCTCATTGGTTGA0017CSFV2U0018CCACCTGGAAAGAATACAACCACGATTTGCAACTGAATGACGGGACCGTTAAGGCCATT0019CSFV2D0020TGACCACATTAAGTGCTGTGACTTTAAAGGAACCTGCCACGCAAATGGCCTTAACG。
17、GT0021CSFV3U0022CACTTAATGTGGTCAGTAGGAGGTATTTGGCATCATTGCATAAGGAGGCTTCACTCACT0023CSFV3D0024GAGGCTTCACTCACTTCCGTGACATTTGAGCTCCTGTTCGACGGGACCAACCCATCAAC0025CSFV4U0026CAAATGGGCACAGCCCGAACCCGAAGTCATCTCCCATTTCCTCAGTTGATGGGTTGGTC0027CSFV4D0028CAAGGTTGTGTTGTACTTTCCCTTGACAACAGGACTCGTATCAAATGGGCACAGCC0029CSFV5。
18、U0030TACAACACAACCTTGTTGAACGGTAGTGCTTACTATCTTGTCTGTCCAATAGGGTGGAC0031CSFV5D0032TTCTCAGAGTTGTTGGGCTCACTGCTGTGCACTCTATAACACCCGTCCACCCTATTGGA0033CSFV6U0034CAACAACTCTGAGAACAGAAGTGGTAAAGACCTTCAGGAGGGACAAGCCCTTTCCGCAC0035CSFV6D0036AATAAATCTTCATTTTCCACTGTTGTGGTCACACAATCCATTCTGTGCGGAAAGGGCTT0037CSFV7U0038AAT。
19、GAAGATTTATTCTACTGTAAGTTGGGGGGCAACTGGACATGTGTGAAAGGTGAACC0039CSFV7D0040CACACCATCTGCATTGTTTTACTAGCCCCCCCGTGTAGACCACTGGTTCACCTTTCACA0041CSFV8U0042AATGCAGATGGTGTGGCTTTGACTTCAATGAGCCTGACGGACTCCCACACTACCCCATA0043CSFV8D0044TCCACTATTCTGTAACCTGTCTCATTTGCCAAAATGCACTTACCTATGGGGTAGTGTGG0045CSFV9U0046TTACAGAATAG。
20、TGGATTCAACAGACTGTAACAGAGATGGTGTCGTAATCAGCACAGAGG0047CSFV9D0048ATGCACCTTGACAGTTGTGTTACCGATCAAGCACTCATGACTCCCCTCTGTGCTGATTA0049CSFV10U0050ACTGTCAAGGTGCATGCATCAGATGAAAGACTGGGCCCCATGCCATGCAGACCTAAAG0051CSFV10D0052TGTACAGGAAGTTTTCCTTACAGGTCCTGCACTAGAGACGATCTCTTTAGGTCTGCATG0053CSFV11U说明书CN104313037A3/17页6。
21、0054AAAACTTCCTGTACATTCAACTACGCAAAAACTTTGAAGAACAAGTACTATGAGCCCAG0055CSFV11D0056ACTGATACTCGCCCTTAAGCATATATTGCTGGAAGTAGCTGTCCCTGGGCTCATAGTAC0057CSFV12U0058AAGGGCGAGTATCAGTACTGGTTTGACCTGGACGTGACTGACCGCCACTCAGATTACTT0059CSFV12D0060TTCCTCCTAACAGTGCTACCACCACCAAGACAACAAATTCTGCGAAGTAATCTGAGTGG0061CSFV13U0062。
22、CACTGTTAGGAGGAAGATATGTCCTGTGGCTAATAGTGACCTACATAGTTTTAACAGA0063CSFV13DACCAGCGGCGAGTTGTTCTGTTAAAACTA，0064将引物0065CSFV1U，CSFV1D，CSFV2U，CSFV2D，CSFV3U，CSFV3D，CSFV4U，CSFV4D混合，进行PCR反应，所得产物命名为CSFV1；0066将引物0067CSFV5U，CSFV5D，CSFV6U，CSFV6D，CSFV7U，CSFV7D，CSFV8U，CSFV8D混合，进行PCR反应，所得产物命名为CSFV2；0068将引物0069CSFV9U，CSF。
23、V9D，CSFV10U，CSFV10D，CSFV11U，CSFV11D，CSFV12U，CSFV12D，CSFV13U，CSFV13D混合，进行PCR反应，所得产物命名为CSFV3；然后将上述三个产物CSFV1，CSFV2，CSFV3混合作为模板进行PCR反应，得到猪瘟病毒的E2基因序列如SEQIDNO1所示。0070进一步，步骤C中将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21中，利用合硫酸卡那霉素的培养基进行筛选，挑取单克隆菌落后，用合有相同浓度的硫酸卡那霉素培养基37度培养至所需浓度，用IPTG进行诱导表达，诱导之后，低温离心收集菌体。0071进一步，所述硫酸卡那霉素的浓度为100UG/ML。00。
24、72进一步，诱导条件为37度，转速250RPM，5H，诱导的IPTG浓度为01MM。0073进一步，步骤D中菌体采用超声破碎，破碎条件为200W，超声6S，间隔3S超声一次，共180次。0074进一步，步骤D中重组蛋白的纯化方法为离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析中的一种。0075优选的，步骤D中重组蛋白的纯化方法为亲和层析。0076本发明还提供一种前述的重组蛋白在制备猪瘟病毒检测试剂中的应用0077此外，本发明还提供一种检测猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含前述的重组蛋白。0078本发明的有益效果与现有技术相比，本发明提供的用于检测猪瘟病毒的重组抗原的制备方法对猪瘟病毒主要抗原。
25、表位所在的E2全片段进行重组表达，这样就保留了全部E2的抗原决定簇位点，进而有效的避免了假阴性即漏检现象。0079进一步，本发明的表达系统为大肠杆菌表达系统，它具有周期短，费用低，表达量大等特点，使得本发明的制备方法具有生产周期短，产量高，成本低的优点。说明书CN104313037A4/17页70080进一步，本发明选择比较温和的培养和诱导条件，其表达时的诱导温度在25度，诱导转速为250RPM，诱导的IPTG浓度为01MM，可以使得重组蛋白有了更加缓慢的表达，有充分的时间进行空间构象的形成，更好的保持重组蛋白的活性位点。0081进一步，本发明可以采用超声的方式破碎细菌。在破碎菌体的时候，将破。
26、碎条件定为200W，超声6S，间隔3S超声一次，共180次，条件温和，避免了剧烈的破碎。0082进一步，本发明优选亲和层析，因为本发明重组蛋白中加入了6XHIS标签，一步纯化能够达到较高的纯度。附图说明0083图1是本发明实施例中大肠杆菌中重组质粒的诱导表达示意图。0084图2是本发明实施例中重组蛋白的纯化示意图。具体实施方式0085下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。0086实施例1猪瘟病毒E2基因的合成0087设计引物如下0088CSFV1U0089ATGCAGCTAGCCTGCAAGGAAGATTACAGGTACGCAATATCATCAACCAATGAGATA0090CSFV。
27、1D0091ATTCTTTCCAGGTGGTGGTGAGACCTCCGGCCCCGAGTAGCCCTATCTCATTGGTTGA0092CSFV2U0093CCACCTGGAAAGAATACAACCACGATTTGCAACTGAATGACGGGACCGTTAAGGCCATT0094CSFV2D0095TGACCACATTAAGTGCTGTGACTTTAAAGGAACCTGCCACGCAAATGGCCTTAACGGT0096CSFV3U0097CACTTAATGTGGTCAGTAGGAGGTATTTGGCATCATTGCATAAGGAGGCTTCACTCACT0098CSFV3D0099GAGG。
28、CTTCACTCACTTCCGTGACATTTGAGCTCCTGTTCGACGGGACCAACCCATCAAC0100CSFV4U0101CAAATGGGCACAGCCCGAACCCGAAGTCATCTCCCATTTCCTCAGTTGATGGGTTGGTC0102CSFV4D0103CAAGGTTGTGTTGTACTTTCCCTTGACAACAGGACTCGTATCAAATGGGCACAGCC0104CSFV5U0105TACAACACAACCTTGTTGAACGGTAGTGCTTACTATCTTGTCTGTCCAATAGGGTGGAC0106CSFV5D0107TTCTCAGAGTTGTTG。
29、GGCTCACTGCTGTGCACTCTATAACACCCGTCCACCCTATTGGA0108CSFV6U0109CAACAACTCTGAGAACAGAAGTGGTAAAGACCTTCAGGAGGGACAAGCCCTTTCCGCAC0110CSFV6D说明书CN104313037A5/17页80111AATAAATCTTCATTTTCCACTGTTGTGGTCACACAATCCATTCTGTGCGGAAAGGGCTT0112CSFV7U0113AATGAAGATTTATTCTACTGTAAGTTGGGGGGCAACTGGACATGTGTGAAAGGTGAACC0114CSFV7D0115CA。
30、CACCATCTGCATTGTTTTACTAGCCCCCCCGTGTAGACCACTGGTTCACCTTTCACA0116CSFV8U0117AATGCAGATGGTGTGGCTTTGACTTCAATGAGCCTGACGGACTCCCACACTACCCCATA0118CSFV8D0119TCCACTATTCTGTAACCTGTCTCATTTGCCAAAATGCACTTACCTATGGGGTAGTGTGG0120CSFV9U0121TTACAGAATAGTGGATTCAACAGACTGTAACAGAGATGGTGTCGTAATCAGCACAGAGG0122CSFV9D0123ATGCACCTTG。
31、ACAGTTGTGTTACCGATCAAGCACTCATGACTCCCCTCTGTGCTGATTA0124CSFV10U0125ACTGTCAAGGTGCATGCATCAGATGAAAGACTGGGCCCCATGCCATGCAGACCTAAAG0126CSFV10D0127TGTACAGGAAGTTTTCCTTACAGGTCCTGCACTAGAGACGATCTCTTTAGGTCTGCATG0128CSFV11U0129AAAACTTCCTGTACATTCAACTACGCAAAAACTTTGAAGAACAAGTACTATGAGCCCAG0130CSFV11D0131ACTGATACTCGCCCT。
32、TAAGCATATATTGCTGGAAGTAGCTGTCCCTGGGCTCATAGTAC0132CSFV12U0133AAGGGCGAGTATCAGTACTGGTTTGACCTGGACGTGACTGACCGCCACTCAGATTACTT0134CSFV12D0135TTCCTCCTAACAGTGCTACCACCACCAAGACAACAAATTCTGCGAAGTAATCTGAGTGG0136CSFV13U0137CACTGTTAGGAGGAAGATATGTCCTGTGGCTAATAGTGACCTACATAGTTTTAACAGA0138CSFV13DACCAGCGGCGAGTTGTTCTGTTAA。
33、AACTA0139实验方法如下0140将引物0141CSFV1U，CSFV1D，CSFV2U，CSFV2D，CSFV3U，CSFV3D，CSFV4U，CSFV4D混合，进行PCR反应，所得产物命名为CSFV1；将引物0142CSFV5U，CSFV5D，CSFV6U，CSFV6D，CSFV7U，CSFV7D，CSFV8U，CSFV8D混合，进行PCR反应，所得产物命名为CSFV2；将引物0143CSFV9U，CSFV9D，CSFV10U，CSFV10D，CSFV11U，CSFV11D，CSFV12U，CSFV12D，CSFV13U，CSFV13D混合，进行PCR反应，所得产物命名为CSFV3；然。
34、后将上述三个产物即CSFV1，CSFV2，CSFV3混合作为模板进行PCR反应即得到猪瘟病毒的E2基因序列。0144上述四个PCR本发明的聚合酶为TOYOBO公司产品，货号02510D1反应条件如说明书CN104313037A6/17页9下94度，2分钟X1个循环，98度，15秒，55度，30秒，68度，15秒X30个循环，72度，7分钟X1个循环。0145实施例2构建重组表达载体，0146测序证明序列正确后，将实施例1中PCR产物用NDEI和XHOI限制性内切酶本发明所采用的各种分子生物学用酶均购自NEB公司进行双酶切之后，插入到用相同两个酶切处理的PET30ANOVAGEN产品，货号699。
35、093载体中。0147实施例3合有猪瘟病毒E2重组蛋白的表达0148将猪瘟病毒重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21中，涂布于合100UG/ML硫酸卡那霉素上海生工生物工程服务有限公司，货号KB0286的LB平板上，37度过夜培养，挑取单克隆菌落，用合有相同浓度的硫酸卡那霉素的300MLLB培养基37度培养至OD600达06左右，用终浓度为01MM的IPTG生工，货号IB0168进行诱导表达，诱导条件为37度，转速250RPM，5H。诱导之后，将培养液4度5000RPM离心20MIN收集菌体。0149图1是本发明实施例中大肠杆菌中重组质粒的诱导表达示意图。其中右边为PET30ACSFVE2未诱导，。
36、左边为PET30ACSFVE2诱导之后，如图1所示，带有重组表达载体的菌株经过诱导之后产生大量目的蛋白，即重组CSFVE2蛋白。0150实施例4合有猪瘟病毒E2重组蛋白的纯化及复性0151将菌体用50ML包涵体抽提液20MMTRISHCL，05MUREAPH75，05MNACL，2TRITONX100重悬，然后超声破碎，条件为超声3S，间隔6S，共180次，12000RPM，4度离心收集包涵体沉淀。0152用上样缓冲液BINDINGBUFFER50MMTRIS，8MUREA，05MNACL，20MM咪唑PH8050ML破碎包涵体，上柱纯化，用洗脱缓冲液ELUTIONBUFFER50MMTRIS。
37、，8MUREA，05MNACL，300MM咪唑PH80洗脱目的蛋白。图2是本发明实施例中重组蛋白的纯化示意图，其中1为重组E2菌体破碎后上样，2为穿透未结合NI柱组分，3为洗脱样品纯化后E2重组蛋白。0153将纯化后的重组蛋白用透析缓冲液1MM氧化型谷胱甘肽GSSH，2MM还原型谷胱甘肽GSH，2MMEDTA，20MMTRIS，PH85透析，每隔48H换一次透析液。0154取出透析后的蛋白液，经据乙醇20000进行浓缩，于20度保存备用。0155本发明虽然已以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以利用上述揭示的方法和技术内容对本发明。
38、技术方案做出可能的变动和修改，因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化及修饰均属于本发明技术方案的保护范围。0156说明书CN104313037A7/17页100157说明书CN104313037A108/17页110158说明书CN104313037A119/17页120159说明书CN104313037A1210/17页130160说明书CN104313037A1311/17页140161说明书CN104313037A1412/17页150162说明书CN104313037A1513/17页160163说明书CN104313037A1614/17页170164说明书CN104313037A1715/17页180165说明书CN104313037A1816/17页190166说明书CN104313037A1917/17页20说明书CN104313037A201/1页21图1图2说明书附图CN104313037A21。