一种提取β-1，3-葡聚糖的方法 【技术领域】
本发明涉及酵母多糖的提取方法，特别是涉及一种提取β-1，3-葡聚糖的方法。
背景技术
β-1，3-葡聚糖普遍存在于多种细菌、真菌、植物和酵母细胞壁中。近来发现真菌细胞壁中β-1，3-葡聚糖作为免疫佐剂、抗癌药等使用时，对机体免疫系统表现出非特异性免疫调节作用。在机体感染疾病时，β-1，3-葡聚糖通过增强机体免疫功能，表现出较强的保护作用。有研究发现，酵母β-1，3-葡聚糖能提高小鼠对细菌、真菌、病毒和寄生虫的抵抗能力(Reynold J A，Kastello M D，Harrington D G，et al.Glucan-induced enhancement of host resistance to selected infections diseases.Infect Immun，1980，30：51~57；Di Luzio N R.Immunopharmacology of glucan：abroad spectrum enhancer of host defense mechanisms.Thends Pharmacol Sci，1983，4：344~347；Chihar G.Immunopharmacology of lentinan as the glucan.Immunol Immunopharmacol，1984，4：85~96；Buddle B M，Pul ford H D，Ralston M.Protect effect of glucan against experimentally induced staphylococcalmastitis in ewes.Vet Microbiol，1988，16：67~76；Benkova M，Boroskova Z，SoltysJ，et al.Effect of glucan preparation on immunocompetent cells and phagocyticability of blood leucocytes in experimental ascariosis of pigs.Vet Parasitol，1992，41：157~166.)。
酵母细胞壁中有3种高分子多糖聚合物，占细胞壁干重40％，β-1，3-葡聚糖占多糖的50～60％(Jesus Ortuno，Alberto Cuesta，Alejandro Rodriguez，M.AngelesEsteban，and Jose Meseguer.Oral administration of yeast，Saccharomycescerevisiae，enhances the cellular innate immune response of giltheadseabream(Sparus aurata L.).Vet.Immunol.Immunopathol.2002，85：41-50)，β-1，3-葡聚糖的含量约为细胞壁干重的22％左右，表明酵母细胞壁是较好的提取材料。我国的酵母年产量很高，1980年产量为10,000吨(以干物质计)，20年来酵母产量增长近10倍。酵母细胞壁是食品和啤酒生产的主要副产物，目前尚未有效利用。
Manners等(Manners，D.J.，A.J.Masson，J.A.Patterson，H.Bjorndal，andB.Lindberg.1973.The structure of aβ-1，6-glucan from yeast cellwalls.Biochem.J.1973，135：31-36.)、Fleet(Fleet G.H.，and D.J.Manners.1976.Isolation and composition of an alkali-soluble glucan from the cell wallsof Saccharomyces cerevisiae.J.Gen.Microbiol.1976，94：180-192.)根据酵母细胞壁化学成分和相似相溶原理，采用碱、酸处理的化学方法从酵母中提取β-1，3-葡聚糖，但工艺耗时长，得率低，仅为2.4％。Suphantharika等(Suphantharika，M.，P.Khunrae，P.Thanardkit，and C.Verduyn.2003.Preparation of spent brewer’syeast β-glucans with a potential application as an immunostimulant for blacktiger shrimp，Penaeus momodon.Bioresource Technology.2003，88：55-60.)采用碱提取一步法提取β-1，3-葡聚糖，此工艺比较简单，提取物得率可高达19～22％，产物中蛋白质含量也较低，但所得β-1，3-葡聚糖纯度低，仅为51％。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种工艺较简单、产率较高的提取β-1，3-葡聚糖的方法。
本发明所提供的提取β-1，3-葡聚糖地方法，包括如下步骤：
1)碱处理：向酵母中加入NaOH，使溶液中NaOH浓度为2-3％，升温到85-95℃，反应2-3-h，过滤收集沉淀物；
2)酸处理：向沉淀物中加入酸溶液，调节pH到4.5，升温到70-80℃，反应1-2h，过滤收集沉淀物；
3)有机溶剂浸提：将沉淀物洗涤后用有机溶剂浸提，冷冻干燥得到β-1，3-葡聚糖。
在提取过程中，常用的酸有盐酸、硫酸等；常用的抽提有机溶剂有异丙醇和丙酮等。
提取过程的优选条件为：步骤1)所述NaOH浓度为3％；温度为90℃；反应时间为2h。步骤2)反应温度为75℃；反应时间为1h。产物纯度和总糖得率最高，分别可以达到91.7％和17.31％。
本发明的工艺流程如图1所示，所获得的β-1，3-葡聚糖分子量比较高，在水中不溶。在静脉注射或腹腔注射使用时，需要降低其分子量，使其能溶解于水。降解过程包括甲酸水解、超滤、退火过程等过程，其工艺流程如图2所示。
其中，所述甲酸水解温度为75-80℃；水解时间为1h。所述超滤为以截留分子量为100KD的超滤膜和以截留分子量为10KD的超滤膜的两次超滤。所述退火温度为70℃；退火时间为20min。
本发明所提供的提取β-1，3-葡聚糖的方法制备工艺简单，工艺参数易于操作控制，产物β-1，3-葡聚糖的得率和纯度都比较高。所得到的β-1，3-葡聚糖能够显著提高肉仔鸡的生长和免疫功能，可广泛用于畜禽养殖业，调节畜禽的免疫机能。
【附图说明】
图1为提取β-1，3-葡聚糖的工艺流程图
图2为降解β-1，3-葡聚糖的工艺流程图
【具体实施方式】
实施例1、β-1，3-葡聚糖的制备
取1kg啤酒干酵母加入5L水，混合均匀后，加入NaOH，使NaOH终浓度为3％，加热到90℃，搅拌反应2h后过滤，水洗涤，保留沉淀物；向沉淀物中加水1L，用盐酸调节pH到4.5，加热到75℃，搅拌反应1h，过滤、洗涤得到沉淀。将沉淀用有机溶剂异丙醇浸提4次，丙酮浸提2次，将浸提物冷冻干燥，得到173gβ-1，3-葡聚糖，得率为17.31％。
β-1，3-葡聚糖的化学结构鉴定采用苯酚-硫酸法，3，5-二硝基水杨酸法显色反应及红外光谱法，结果表明其为D-葡萄糖聚合成的多糖，红外光谱提示多糖糖苷键是β-型，连接方式为1→3连接。
采用薄层层析(TLC)来鉴定所得产物的纯度，层析结果仅有1个斑点，其Rf值与D-葡萄糖相同，表明产物的单糖组成仅有葡萄糖，产物纯度为91.17％。
通过测定β-葡聚糖聚合度(DPn)的方法测定产物分子量，其方法是用硼氢化钠还原葡聚糖，将其末端醛糖基还原为糖醇基。还原产物完全酸水解，此末端糖醇基即生成为山梨糖醇，葡聚糖末端外的葡萄糖残基水解产物为葡萄糖。因为山梨糖醇在山梨糖醇脱氢酶催化时存在以下可逆反应：山梨糖醇+NAD+D-果糖+NADH+H+。当pH9～10，并存在过量的NAD+时，此反应中山梨糖醇的氧化情况可通过测定NAD+的还原情况定量测定。在340nm处采用连续监测法测定10mins，每隔1min读数1次，求出平均每分钟吸光度的变化值(ΔA/min)。因为NADH在340nm处的摩尔吸光系数是6.22×106cm2/mol，测定时反应液的总体积是3mL，山梨糖醇含量计算公式为ΔA/min×3/6.22(μmol)。用葡萄糖氧化酶法测定还原产物中葡萄糖含量(μmol)。聚合度DPn＝(D-葡萄糖含量/D-山梨糖醇含量)+1(Manners.D.J.，A.J.Masson andR.J.Sturgeon.An enzyme method for the determination of the degree ofpolymerization of glucans.Carbohyd.Res.，1971，17：109-114)。所得β-1，3-葡聚糖平均分子量为820000。
实施例2、β-1，3-葡聚糖的制备
取10kg啤酒干酵母加入50L水，混合均匀后，加入NaOH，使NaOH终浓度为2％，加热到85℃，搅拌反应3h后过滤，水洗涤，保留沉淀物；向沉淀物中加水5L，用硫酸调节pH到4.5，加热到75℃，搅拌反应1h，过滤、洗涤得到沉淀。将沉淀用有机溶剂异丙醇浸提4次，丙酮浸提2次，得到1628g β-1，3-葡聚糖，得率为16.28％。产品纯度为91.89％，平均分子量为885000。
实施例3、β-1，3-葡聚糖作为饲料添加剂的应用
以基础日粮为对照组，在肉仔鸡日粮中添加12.5，25.0mg·kg-1β-1，3-葡聚糖，试验测定了肉仔鸡的生产性能，免疫器官重量，淋巴细胞转换率，绵羊红细胞(SRBC)和新城疫疫苗(NDV)抗体水平。
结果是，β-葡聚糖能提高21日龄肉鸡法氏囊相对重量达2.98(P＜0.05)，42日龄外周血淋巴细胞(PBL)对脂多糖(LPS)的反应达3.40(P＜0.05)。添加β-葡聚糖，使SRBC抗体水平和IgG含量在长时间内维持较高水平，一免11d后差异显著，分别达到5.8和4.2个滴度(P＜0.05)。β-葡聚糖提高了肉仔鸡新城疫疫苗(NDV)的抗体水平，同时还增强了肉仔鸡对NDV的免疫应答，二免9d后达4.3个抗体滴度，差异显著(P＜0.05)。
以上试验结果表明，β-1，3-葡聚糖能提高肉仔鸡的体液免疫和细胞免疫功能。
实施例4、β-1，3-葡聚糖作为饲料添加剂的应用
以基础日粮和林肯霉素为两个对照，在肉仔鸡日粮中添加12.5，25，50，100mg·kg-1β-1，3-葡聚糖，测定指标包括生产性能，免疫器官重量，淋巴细胞的增殖反应、吞噬中性红能力，血清中抗SRBC、BSA、BA和NDV抗体水平。
结果表明，与基础对照相比，肉仔鸡摄食添加β-1，3-葡聚糖配合饲料后，出栏重提高15％，饲料转化效率提高3％，肉仔鸡法氏囊相对重量提高到3.04，B淋巴细胞刺激指数增加至4.41，绵羊红细胞(SRBC)抗体提高1个滴度、牛血清白蛋白(BSA)抗体为0.414(吸光值)，新城疫疫苗(NDV)抗体提高1个滴度。与抗生素相比，β-1，3-葡聚糖能使肉仔鸡出栏重提高6％，饲料转化效率提高3％，法氏囊相对重量提高26％，吞噬细胞吞噬能力显著提高至0.226(吸光值)。BA抗体水平提高1个滴度，BSA抗体水平提高37％，新城疫疫苗抗体提高1个滴度。
以上试验结果表明，β-1，3-葡聚糖能提高肉仔鸡生产性能和免疫功能。
实施例5、β-1，3-葡聚糖作为免疫佐剂的应用
β-1，3-葡聚糖作为免疫佐剂应用时，需要降低其分子量，成为可溶性的β-1，3-葡聚糖。降解步骤可按如下过程进行：甲酸水解(甲酸与高分子β-1，3-葡聚糖稀释比例为1g∶15ml，降解温度为75-80℃，降解时间为1h)→加热，挥发除去甲酸→调节pH至11～12→用100KDa超滤膜超滤收集超滤液，除去分子量大于100000的β-1，3-葡聚糖→用10KDa超滤膜超滤所得超滤液收集浓缩液，除去分子量小于10000的水溶性β-1，3-葡聚糖→将所得超滤浓缩液调节pH至7，加热到70℃，退火20mins即可。
采用实施例1的方法对产品进行化学鉴定，所得水溶性β-1，3-葡聚糖分子量为10KDa-100KDa，并能保持β-1，3-葡聚糖的构型，含量达10mg/mL。
本发明通过不同途径，在肉仔鸡体内使用小分子水溶性β-葡聚糖，研究其对肉仔鸡体液免疫功能的影响。试验采用4×3因子安排的完全随机设计(4个β-葡聚糖使用剂量，3种β-葡聚糖使用途径)，研究不同剂量的水溶性β-葡聚糖通过不同使用途径(静脉注射途径，肌肉途径以及与新城疫疫苗免疫的相同途径)时，测定肉仔鸡体内新城疫抗体水平的变化。采用单因子完全随机设计，研究肌肉注射BSA(浓度为5mg/mL)同时注射不同剂量水溶性β-葡聚糖后，测定肉仔鸡BSA抗体总量。
从试验结果得知，水溶性β-1，3-葡聚糖与使用途径存在显著的交互效应。通过佐剂途径与新城疫疫苗同时使用，能提高新城疫抗体1个滴度；肌肉注射BSA同时注射水溶性β-1，3-葡聚糖，能显著提高肉仔鸡抗BSA抗体水平(吸光值提高50％)。
结果表明，水溶性β-1，3-葡聚糖可作为佐剂使用，增强特异性抗体水平。