一种猪促卵胞激素Α亚基的编码基因FSHΑ及其筛选方法.pdf

本发明涉及一种猪促卵胞激素α-亚基的编码基因FSHα，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明通过构建二花脸猪基因组BAC文库，获得猪促卵胞激素α-亚基的编码基因FSHα全基因序列，并构建BAC真核表达载体，利用本发明所提供的方法构建的转基因猪可以进一步应用于与猪生殖及其产仔数的功能相关的研究，提高饲养动物产仔数。

权利要求书
1.  一种猪促卵胞激素α-亚基的编码基因FSHα，其特征在于， 所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.  权利要求1所述的基因FSHα的筛选方法，其特征在于，所 述方法包括以下步骤：
(1)构建二花脸猪基因组BAC文库：采二花脸公猪静脉血制备 核DNA，酶切后获得核DNA片段；将所述核DNA片段与载体连接后 电击转化感受态菌获得二花脸猪基因组BAC文库；
(2)利用筛选引物对二花脸猪基因组BAC文库超级池进行PCR 扩增，筛选出阳性克隆作为BAC文库二级池；再次利用所述筛选引 物对BAC文库二级池进行PCR扩增，筛选出含有SEQ ID NO:1所示 的核苷酸序列的BAC克隆；
其中所述筛选引物为：
pFSHα249-UP:GCCCAGAATGCAAGCTAAAG
pFSHα249-DOWN:GATGTGCTCTGGGGACATTT。

3.  根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述PCR扩增 的反应体系为：


4.  根据权利要求2或3所述的筛选方法，其特征在于，所述PCR 反应的程序为94℃5min；94℃30sec，62℃30sec，72℃120sec， 30个循环；72℃7min。

5.  含有权利要求1所述基因FSHα的重组表达载体。

6.  含有权利要求1所述基因FSHα的工程菌。

7.  一种构建猪促卵胞激素α-亚基表达量增强的转基因克隆猪的 方法，其特征在于，所述方法包括在转基因克隆猪体内表达猪促卵胞 激素α-亚基的编码基因FSHα。

说明书一种猪促卵胞激素α-亚基的编码基因FSHα及其筛选方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体的涉及一种猪促卵胞激素α-亚基 的编码基因FSHα及其筛选方法。
背景技术
促卵泡激素，亦称为卵泡刺激素(Follicle-Stimulating Hormone， FSH)，因最早发现其对雌性动物卵泡成熟的刺激作用而得名。促卵 泡激素是动物垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌的一种糖蛋白类促性 腺激素，与促黄体激素、促甲状腺激素、及胎盘产生的绒毛膜促性腺 激素共同组成一个糖蛋白激素家族。它们的功能各异，结构却极为相 似，都是由α-亚基和β-亚基所组成。在同一物种内α-亚基是确定的， 它们的α-亚基可以互换，而β-亚基不能互换，β-亚基具有激素各自的 特异性，又具有种间特异性，是激素生物活性和免疫活性的决定因素。 α-亚基和β-亚基单独都不具有生物活性，只有当两者结合在一起引起 立体结构上的变化，才具有生物活性。一般认为，α-亚基负责信号传 导作用，β-亚基是功能亚基，参与受体结合。后经研究发现，α-亚基 和β-亚基均参加受体结合和信号传导作用。它对雌性动物卵泡生长 发育尤其对窦状卵泡发育成熟起着至关重要的作用。促卵泡激素可在 绝经期女性的尿液中提取得到，也可以通过基因工程的方法重组表达 得到。临床主要用于对不孕症患者的治疗，用以刺激卵泡的发育成熟， 同时也用于体外人工受精和体内人工受精的相关治疗中。
太湖猪高产仔数的物质基础是高的排卵率和良好的子宫容量。而 在卵泡发育和排卵过程中，FSH和LH是两种起直接作用的糖蛋白激 素，其中FSH应用于超排的研究已证明高浓度的FSH可以促进更多的 卵泡成熟，在LH协同作用下，实现超排。近年来，在鼠、羊、牛等 许多动物中，对抑制素免疫所引起的排卵率的变化最终也归因于FSH 浓度的上升。研究发现首次发情周期内，太湖猪循环血液中FSH浓 度显著高于其它猪种。因此，FSH被当作控制太湖猪高排卵率的候 选基因。陈杰等采用PCR-SSCP作为遗传标记，对二花脸猪FSHβ-亚 基基因位点和产仔数性状的关系进行了研究，他们发现该标记位点与 二花脸猪的产仔数性状显著相关，PCR-SSCP标记基因型的不同可以 导致猪的产仔数有显著差异。
我国是世界第一养猪大国，无论从经济方面考虑还是从环境方面 考虑，在保证需求的同时，减少母猪的饲养量，提高母猪的繁殖性能， 具有重要的理论和实践意义。如何提高母猪繁殖能力一直是困扰畜牧 工作者的一个难题。母猪的年生产力主要由产仔数、仔猪存活率及产 仔间隔所决定。但繁殖性状的遗传力低、性状表现晚、而且是限性遗 传，受环境因素影响很大，所以在过去，通过常规育种手段进行选育 取得了一些进展，但进展缓慢，至今停滞不前，达到所谓的“选择高 原”。据报道，法国用30多年的时间来改良猪产仔数性状，但进展甚 微；丹麦将产仔数提高1头用了50多年。
因此，有必要利用最新的分子生物学技术，从基因水平着手，获 得繁殖力高的转基因猪。以后在猪中与生殖及其产仔数的功能研究和 未来转基因育种打下重要基础。
发明内容
本发明的目的在于通过构建二花脸猪基因组BAC文库，筛选获得 猪促卵胞激素α-亚基的编码基因FSHα，从而将该基因应用于转基因 克隆猪的构建提高母猪产仔数。
本发明提供了一种猪促卵胞激素α-亚基的编码基因FSHα，所述 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供了一种基因FSHα的筛选方法，所述方法包括以下步 骤：
(1)构建二花脸猪基因组BAC文库：采二花脸公猪静脉血制备 核DNA，酶切后获得核DNA片段；将所述核DNA片段与载体连接后 点击转化感受态菌获得二花脸猪基因组BAC文库；
(2)从所述BAC文库中筛选获得包含SEQ ID NO:1所示的核 苷酸序列的BAC克隆；
利用筛选引物对二花脸猪基因组BAC文库超级池进行PCR扩 增，筛选出阳性克隆作为BAC文库二级池；再次利用所述筛选引物 对BAC文库二级池进行PCR扩增，筛选出含有SEQ ID NO:1所示的 核苷酸序列的BAC克隆；
其中所述筛选引物为：
pFSHα249-UP:GCCCAGAATGCAAGCTAAAG(SEQ ID NO：2 所示的序列)。
pFSHα249-DOWN:GATGTGCTCTGGGGACATTT(SEQ ID NO： 3所示的序列)。
可选的，所述PCR扩增的反应体系为：

可选的，所述PCR反应的程序为：94℃5min；94℃30sec，62℃ 30sec，72℃120sec，30个循环；72℃7min。
本发明还提供了所述基因FSHα的重组表达载体。
可选的，所述重组表达载体为pFSHα-loxp-neo-loxp。
可选的，所述重组表达载体为BAC412H8-loxp-neo-loxp。其构建 方法为：利用缺陷型λ原噬菌体Red系统介导的同源重组实现对BAC DNA的修饰与改造，在BAC412H8的5′侧翼区和3′侧翼区嵌入 loxp-neo-loxp，最终构建成本发明所提供的重组表达载体 BAC412H8-loxp-neo-loxp。其中BAC412H8为含有SEQ ID NO:1所示 的核苷酸序列的BAC克隆，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供了含有所述基因的工程菌，包括宿主细胞和转入宿 主细胞的目的基因，所述目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所 示。
可选的，所述基因工程菌内含有本发明所提供的重组表达载体。
本发明还提供了一种构建猪促卵胞激素α-亚基表达量增强的转 基因克隆猪的方法。
本发明通过构建二花脸猪基因组BAC文库，获得猪促卵胞激素 α-亚基的编码基因FSHα全基因序列，并构建了含有基因FSHα的真 核表达载体，利用本发明所提供的方法构建的转基因猪可以进一步应 用于与猪生殖及其产仔数的功能相关的研究，提高饲养动物产仔数。
附图说明
图1BAC文库中含有FSHα基因的BAC的结构图。
图2为BAC基因修饰原理图。
图3为转基因阳性猪鉴定结果；
其中，1-9为猪基因组DNA
P是BAC阳性对照，H2O为水阴性对照。
具体实施方式
下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1 构建二花脸猪基因组BAC文库：
1.1实验材料
二花脸公猪静脉血采自江苏常熟良种畜禽场。pBeloBACll载体由 法国农科院提供。限制性内切酶和LDNA连接酶购自NewEngland  Biolabs，龙虾碱性磷酸酶(SAP)购自USB公司，电击感受态细胞 DHIOB购自Gibico，QiagenMaxi plasmid extraction Kit购自基因公司。
1.2方法
1.2.1高分子量DNA的提取
核DNA的制备,一般是在液氮中将组织研磨成粉末,而且在整个研 磨过程中均使组织浸在液氮中。为了防止核DNA降解，一般采用两 种低熔点琼脂糖包埋核DNA的方法，一是将核DNA包埋在低熔点 琼脂糖中形成栓塞(plugs)，二是将核DNA包埋在低熔点琼脂糖和 矿物油混合物中形成微粒(microbead)。通过比较试验，plugs在 制备方法、保护核DNA、操作上具有明显优点。然后对核DNA进行 酶切,最终目的是通过酶切产生大小比较集中的片段,一般通过两次脉 冲场电泳进行片段选择。
1.2.2载体制备和去磷酸化处理
pBeloBACll用Qiagen Maxi plasmid extraction Kit提取，CsCl— EtBr梯度离心纯化。分别以HindⅢ和BamH I酶切，去磷酸化处理后电 洗脱回收。
1.2.3插入片段处理及连接转化基因组DNA分别以Hind III和 BamH I部分酶切，多向脉冲凝胶电泳(PFGE)分离电洗脱回收 150—250kb片段。将片段与载体用T4DNA连接酶120C连接2Ah，透析 后以18kV/cm，100伏特的条件电击转化。复活后在转化菌液中加甘 油至10％，-80℃冻存直至分装单克隆和提取PCR筛选所用的DNA。
1.2.4PCR筛选系统的建立从-80℃取出冻存的转化菌液，融 化后铺在含IPTG和X—981的LB平板上，37℃培养24h。挑取单个白 斑接种于加有含10％甘油和12.5％的氯霉索的2×YT培养基的96 深孔板中，过夜摇菌培养。使用MPII机械手对文库进行菌液的分装和 集合。
1.2.5文库的初步鉴定随机挑选文库中的克隆，碱裂解法小 提BAC DNA，Not I酶切后跑多向脉冲凝胶电泳，EtBr染色后紫外 凝胶成像仪下检测。
共得到182 207个BAC克隆克隆的生长效率为99％(182 207/184  320)。从文库中随机挑选了250个克隆小体进行平均插入片段大小的 计算，得到平均插入为128kb，因此根据平均插入片段计算的文库的 基因组覆盖率应为7.7倍(128kb×182 207/3 000 000kb)。载体中没有 插入片段的克隆(5个)的比例(空斑率)为2％。这个比率符合正常 的BAC载体的空斑率。根据基因组覆盖率与筛选文库得到目的克隆的 几率的关系公式(P(x)＝(Cx/x！)e-c)计算，在此文库中筛到目 的基因的几率为99.96％。
实施例2 BAC文库的筛选
克隆保存在384孔板中，为了方便保存和筛选，每20块384 孔板组成一个超级池，整个文库共含有24超级池。本申请所述 的BAC文库的筛选是一种针对这个BAC文库，基于PCR扩增 的两步-3D筛选系统。两步指筛选过程必须经过对超级池和二级 池的pooling DNA进行PCR扩增。通过对24个超级池的DNA 样品的第一步PCR结果，确定阳性克隆所在的超级池号，再针 对阳性超级池所对应的二级池的46个行池、列池、板池的DNA 样品进行第二步PCR，从阳性结果确定阳性克隆的位置。3D是 指在阳性超级池中，必须经过三维(行、列、板)鉴定才能确定 阳性克隆的具体所在位置。
1、BAC文库超级池的筛选
利用特异性引物(pFSHα249-UP和pFSHα249-DOWN)对猪超级 池进行PCR扩增，得到了多个信号。超级池中24个样品中S12和S21 扩展到了目的序列，引物序列如下：
pFSHα249-UP:GCCCAGAATGCAAGCTAAAG
pFSHα249-DOWN:GATGTGCTCTGGGGACATTT
所述PCR扩增的反应体系为：

PCR反应的程序为PCR反应程序为94℃5min；94℃30sec，62℃ 30sec，72℃120sec，30个循环；72℃7min。
2、BAC文库二级池的筛选
对FSHα超级池阳性信号S12和S21对应的二级池分别进行进一步 的PCR筛选(方法同超级池筛选)，筛选得到BAC231M12，BAC412H8。
实施例3 BAC文库中含有FSHα基因的BAC的基因组成分析
得到BAC231M12，BAC412H8后，首先利用通用引物T7/SP6对 pBeloBAC11载体上插入片段的末端序列进行测序，测序结果在NCBI 上进行序列比对。结果表明，包含FSHα亚基基因的BAC克隆 BAC231M12和BAC412H8的两末端序列都与网上已经公布的BAC克 隆CU302429保守区比对上，且两BAC克隆在其内部，但是 BAC231M12比BAC412H8两侧翼序列要大得多，为了避免其它基因 的存在，选择BAC412H8作为后续研究对象；根据以上推测的侧翼序 列大小和网上已经公布的猪基因组序列信息，对BAC412H8和 BAC183011进行BLAST分析，发现FSHα亚基基因上游30kb和下游50 kb。
实施例4 BAC文库中含有FSHα基因的BAC的结构
将BAC412H8送到上海美吉进行高通量测序，根据测序结果，确 定了BAC412H8的大小为90194bp，猪FSHα亚基基因实际长度为16, 151bp，比网上报道4057bp(中间存在gap)要长得多，5′端调控区长 度为29,695bp，3′端调控区长度为46,374bp；基于以上数据，构建 了BAC412H8结构示意图1，详细序列信息如SEQ ID NO:4所示。
实施例5 BAC文库中含有FSHα基因的BAC的基因修饰
BAC412H8必须插入可用于转基因细胞筛选的标记基因 NeoR/KanR，才能够方便地进行转染后阳性细胞的筛选和鉴定，进而 用于转基因克隆猪的研制。由于BAC片段较大，含有很多限制性酶切 位点，在BAC中插入筛选标记基因NeoR/KanR，普通限制性酶切连接 的方法根本不可能实现，因此利用缺陷型λ原噬菌体Red系统介导的 同源重组实现对BAC DNA的修饰与改造，在BAC412H8的5′侧翼区 和3′侧翼区插入loxp-neo-loxp，最终构建成载体 BAC412H8-loxp-neo-loxp见图2。步骤如下：(1)制备SW102电转感 受态，然后将BAC412H8电击转移到SW102感受态中中，利用氯霉 素抗性平板筛选鉴定阳性菌株后，再次将其制备成感受态含有 BAC412H8的SW102电转感受态。(2)制备含loxp-neo-loxp的同源 重组打靶载体。首先通过化学合成的方法得到扩增loxp-neo-loxp基 因的同源臂扩增引物， (BAC412H8的同源左臂引物序列为如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序 列；同源右臂引物序列为如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列)然后 以PL452质粒为模板，用同源臂引物和LA Taq聚合酶扩增 loxp-neo-loxp基因，用Dpn1酶切PCR产物中的PL452质粒后， 凝胶回收目的条带，即得到同源重组打靶载体，测定浓度后备用。(3) 制备BAC412H8-loxp-neo-loxp-SW102载体。将同源重打靶载体分别 电击转移到相应的感受态BAC412H8-SW102中，使其在细菌内部实现 同源重组，插入转基因细胞筛选标记基因NeoR/KanR，然后通过卡那 霉素抗性平板筛选阳性菌株并通过PCR检测选出打靶正确的阳性 克隆。
实施例6 含有BAC的转基因细胞系鉴定
1、大白胎儿成纤维细胞建立
1)取妊娠30d的长白猪，处死后取输卵管子宫、包扎出口、2h 内运回实验室。
从子宫内取出胎儿，用含抗生素的DPBS清洗胎儿，转移到超 净工作台内，用眼科剪去除胎儿头部、四肢、内脏、用DPBS冲洗。
2)在直径100mm细胞培养皿内用眼科剪将剩余部分尽量剪碎。
3)加入少许血清，将1ml枪头尖端用剪刀剪断，留下直径约为 40mm以上部分，接上1ml枪，将组织块转移到3个T25细胞培养 瓶的底壁，用弯头吸管将组织块均匀铺开。
4)将铺有组织块的一面向上，各加入5ml细胞培养液，放入 CO2培养箱，39℃、5％CO2、100％湿度培养。
5)待培养6-8h后，将铺有组织块的一面翻转，使细胞培养液 浸没组织块。
6)培养5天左右观察组织块周围是否有细胞爬出。
7)待细胞生长至80％汇合时，进行传代培养或进行冷冻保存。
2、载体电转
用QIAGEN试剂盒提取纯化BAC412H8-loxp-neo-loxp，经NotI 酶切后，二倍乙醇沉淀，用枪头挑取白色絮状沉淀(不离心，去除大 部分BAC载体骨架)，70％乙醇洗2次，加入适量ddH2O溶解，使 其浓度达到1μg/μL左右，OD值大约为1.85。取线性化的 BAC412H8-loxp-neo-loxp3μg，大约5×106个大白猪胎儿成纤维细胞 (100μL)，混匀，启动T-016程序进行转染。转染后，用G418筛选， 获得细胞克隆点并用两对引物进行PCR鉴定，其中，第一对引物为 (FSHα453bp引物)：上游引物如SEQ ID NO：7所示，下游引物如 SEQ ID NO：8所示，第二对引物为(neoR knar 1900bp引物)：上游 引物如SEQ ID NO：9所示，下游引物如SEQ ID NO:10所示。如果两 对引物分别扩展出453bp和1900bp的片段即为阳性克隆。总共获得13 个阳性细胞克隆点。
实施例7 含有BAC的转基猪鉴定
1、猪卵母细胞体外成熟
从屠宰场取卵巢，放入28℃-35℃，含青霉素和硫酸链霉素的生 理盐水中，2h内运回实验室用配有18号针头的20mL注射器抽吸卵 巢上3-6mm的卵泡。将抽取液放于50mL离心管中，37℃水浴静置 15min去上清，加入PVA-TL-HEPES重悬沉淀，再静置15min，重 复一次，将重悬液放入直径60mm的塑料培养皿中,在体式显微镜下, 用口吸管挑选卵丘包裹2层以上，致密，而且胞质均匀的卵丘细胞- 卵母细胞复合体(Cumulus-Oocyte-complexes，COCs)，用成熟培养 液洗涤3遍转入在培养箱中至少已经平衡4h的培养液滴内(每 100μL液滴放25枚)。每一直径35mm的塑料培养皿中做4个液滴， 用胚胎级矿物油覆盖。将COCs先在成熟培养液中培养20±2h，然 后转移到无hCG以及eCG的成熟液中继续培养20±2h。
2、体细胞准备
利用血清饥饿法，将实例4中获得的阳性细胞待其生长至80％ 汇合时，进行血清饥饿处理，即把培养液中的FBS(Gibco,Life  Technologies)浓度从20％降至0.5％继续培养2-5d，按常规方法消 化，离心洗涤，最后加1mL显微操作液重悬细胞沉淀备用。
3、受体卵母细胞去核及供体细胞核移植
利用盲吸法进行成熟卵母细胞去核，即成熟40-44h猪卵母细胞， 脱卵丘后选择胞质均匀，卵周隙清晰，胞膜完整的卵母细胞放入无 Ca2+、Mg2+、HEPES缓冲NCSU-23备用转移到显微操作液滴内：核 移植前1h做好，直径60mm细胞培养皿盖中央(液滴50-80μl,2-3 mm宽,8-10mm长，石蜡油覆盖)，作用15-30min，把供体细胞以 及成熟卵母细胞同时转入其中于39％、5％CO2、100％湿度平衡 15min，安装显微固定管以及去核/注射针，调节好操作系统位置， 在装配有显微操作仪及恒温台的倒置显微镜下，40×用固定管(内径 25-35μm，外径100-120μm)吸持卵母细胞用内径15-25μm的去核/ 注射针拨动卵母细胞，使第一极体处于钟表1点钟位置200×下，从 钟表3点处将去核/注射针刺过透明带，吸出第一极体及其附近少许 细胞质退出去核/注射针，将第一极体以及少许胞质吐出挑选直径 15-20μm，折光性强，圆形，光滑的体细胞，200×下用去核/注射针 吸取一个供体细胞，从去核进针处将体细胞注射到透明带下的卵周 隙内用注射针点压透明带，使供体细胞与受体卵胞质的细胞膜彼此 紧密接触每批25-30个卵母细胞，构建完成后，结束后将供体细胞- 卵胞质构成的细胞对(重构卵)转移到NCSU-23+4mg/ml BSA中， 39℃、5％CO2、100％湿度培养箱中修复1-2h。
4、融合与激活
将恢复好的重构卵分批转移到融合液中平衡3min，用融合/激 活液洗涤3遍后，每批5个放入已经铺满融合液的融合槽内，用拉 制的且尖端很细的实心玻璃针拨动重组卵，使供体细胞-受体卵细胞 膜接触面与电极平行用ECM2001融合仪施加一个30μs，2.0kv/cm 的直流电脉冲诱导融合同时激活，用NCSU-23％+4mg/ml BSA洗涤 5遍，立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中、39℃、5％CO2、100％ 湿度培养0.5h～1h后取出，在体视显微镜下判定融合。
5、胚胎培养
在开始显微操作前至少4h预先做好培养液滴，在超净台内取 35mm细菌培养皿，做6-8个30μL大的液滴，小心加入2.5-3ml矿 物油覆盖，做好标记后放入CO2培养箱内平衡将上述融合的重构胚 用胚胎培养液洗涤5遍后转入，每个30μL的液滴培养8-10个重构 胚，培养48h和168h时记录卵裂和囊胚形成结果。
6、胚胎移植
用公猪试情或者观察压背反应，挑选自然发情母猪，一般在构 建克隆胚的当天将在CO2培养箱中培养12-30h的1-2细胞克隆胚取 出，装入2.5ml细管内。用灭菌的锡箔纸包装好，做好标记，放到 恒温运输箱中运到猪移植地点，用40-60ml(1mg/100kg体重)生理 盐水溶解1-1.5mg硫喷妥钠和地西泮，耳静脉注射20ml，待受体猪 初步麻倒后，将其抬到手术架上仰卧(青年后备母猪)或者侧卧(经 产母猪)保定对后备母猪：在腹部下面第1对和第2对乳头之间， 腹中线局部15×10cm2面积内清洁刮毛后先碘酒消毒，后酒精棉脱碘 (对经产母猪：在腹部肷窝部15×10cm2的范围内清洁，刮毛碘酒 消毒后酒精脱碘)在准备动刀切开腹中线之前，把前面余下的麻醉 药再酌情注射20-30ml，沿腹中线切开一个长约8-10cm的口，打开 腹腔，探进去一只手，取出卵巢后用润湿的灭菌脱脂纱布盖上(而 对经产母猪:沿侧腹部做一个与腹中线面垂直的长约10cm的切口) 在手术人员即将取出卵巢，调整好输卵管伞之际，将装在吸管内的 胚胎取出放在热台上，体视显微镜下将胚胎装入移植管内，手术人 员和胚胎移植人员相互协调，将移植管从输卵管伞部探入输卵管至 少5cm大致到了壶腹-峡部结合处，一边推动注射器，以便外撤移植 管移植后体视镜下观察胚胎是否仍滞留在移植管内，确认没有后， 开始卵巢回位，术口缝合胚胎移植后第10d肌肉注射800IU hCG， 13d注射500IU PMSG。
7、囊胚细胞计数
8、F0代猪组织基因组DNA的提取：
将猪场出生的公猪(来源于实例3中的阳性细胞克隆)取少量尾巴 组织块，剪碎或细胞沉淀放入1.5ml离心管中，加700μl DNA抽提缓冲 液，20μl蛋白酶K(20mg/ml)，混匀56℃水浴消化18h以上，直至组织 块或细胞沉淀完全消失，间歇摇动以获得更好的效果，加入700μl Tris- 饱和酚，温和摇动12min，12000rpm离心12min。将上层液相转移至 另一新的离心管中，重复上一步骤，将上层液相转移至另一新的离心 管中，加入700μl酚:仿(1:1)，温和摇动12min，12000rpm离心12min。 将上层液相转移至另一新的离心管中，加入700μl氯仿，温和摇动12 min，12000rpm离心12min。将上层液相转移至另一新的离心管中， 加2倍体积无水乙醇，颠倒混匀后，12000rpm离心10min。弃上清， 用70％乙醇洗沉淀和管壁，倾弃乙醇，沥尽残液，室温下敞口放置 20～30min，使乙醇完全挥发，加适量(约100μl)TE缓冲液，于56℃ 水浴中溶解DNA，0.7％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA浓度，测量 260/280nm波长下检测基因组DNA的浓度和纯度，将其调整至适当浓 度，-20℃保存，同时进行PCR鉴定转基因阳性猪。其中，第一对引 物为(FSHα453bp引物)：上游引物如SEQ ID NO：7所示，下游引 物如SEQ ID NO：8所示，第二对引物为(neoR knar 1900bp引物)： 上游引物如SEQ ID NO：9所示，下游引物如SEQ ID NO:10所示。进 行琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA，假如扩出用2对引物进行检测， 如果分别扩增出453bp和1900bp的片段即为阳性克隆。如图3所示1、 2、3、6、7、9为阳性转BAC猪。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了 详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这 对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神 的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。