说明书一种盐酸克伦特罗分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法
技术领域
本发明涉及一种仿生抗体的制备方法，尤其涉及一种共价型盐酸克伦特罗分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法。
背景技术
盐酸克伦特罗（Clenbuterol，CLB）是一种肾上腺类神经兴奋剂，临床上曾用于防治支气管哮喘、慢性支气管炎等病症。CLB是“瘦肉精”的一种，生物利用率高，能够改变动物体内的代谢途径，促进肌肉和骨骼中蛋白质的合成，加快生长速度，改善胴体品质，增加瘦肉率。但是，CLB易于在动物体内蓄积，在肺、肝、肾等脏器及肌肉和脂肪组织中的残留量较大，残留时间较长，且可通过食物链在人体内蓄积，对机体产生毒副作用，主要表现为心律失常、肌肉震颤、头晕、乏力等，严重的可危及生命。我国和欧盟等多数国家都严禁CLB在畜禽养殖中应用。
分子印迹聚合物仿生抗体是通过分子印迹技术（MIT）制备的对目标分子有特异选择性的高分子聚合物，是目前代替生物抗体最理想的材料之一。分子印迹聚合物仿生抗体具有专一识别性、理化稳定性、应用广泛性，在仿生免疫分析、样品前处理、生物传感器及色谱固定相中具有良好的应用前景。
目前，以CLB为目标物的分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法有沉淀聚合方法（Rongning Liang，Qi Gao，Wei Qin. Chin J Anal Chem, 2012, 40(3): 354-358）、溶胶-凝胶聚合方法（Wei Du，Chunmei Lei，Siruo Zhang，et al. J Pharmaceutical Biomed, 2014, 91:160-168）、本体聚合方法 （Anders Blomgren， Christine Berggren，Anna Holmberg，et al. J Chromatogr A，2002,975:157-164）等，这些制备方法都是以非共价聚合方式制备仿生抗体，虽然具有较高的吸附容量和吸附速率，但在应用过程中存在模板分子渗漏及特异性不高的问题。为了克服模板分子的渗漏问题，利用假模板分子代替CLB制备分子印迹聚合物仿生抗体已被成功制备（Fengxia Qiao，Jingjing Du. J Chromatogr B，2013,923-924:136-140；Hongyuan Yan，Suting Liu，Mengmeng Gao，et al. J Chromatogr A，2013,1294:11-16），但是该方法又降低了仿生抗体的特异性，这可能会增加仿生抗体免疫分析检测过程中假阳性现象的发生。
发明内容
发明目的
针对现有技术的上述不足，本发明提出了一种新的CLB分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法，旨在解决现有CLB分子印迹聚合物仿生抗体的特异性低及模板分子渗漏问题。
技术方案
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种盐酸克伦特罗分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法,其特征在于：步骤如下：
（1）制备盐酸克伦特罗（CLB）衍生物：
将盐酸克伦特罗溶于二氯甲烷溶剂中，加入三乙胺后滴加甲基丙烯酰氯于二氯甲烷溶液中，混合物室温反应过夜。反应结束后，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤反应溶液，分出有机相，水相用二氯甲烷洗涤2次，合并有机相后用无水硫酸钠干燥，然后用旋转蒸发仪减压除去有机溶剂，残余物以石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为淋洗液用硅胶柱提纯得到CLB衍生物；
（2）制备CLB分子印迹聚合物仿生抗体：
取步骤（1）制备的盐酸克伦特罗衍生物溶于甲醇和乙酸乙酯混合溶液中，磁力搅拌至全部溶解，然后依次加入交联剂和引发剂，待固体全部溶解后吹氮气4~6 min除氧，然后将反应容器密封置于65~75 oC水浴中聚合45~50 h。聚合反应结束后，用研钵将聚合物仿生抗体研至颗粒状，然后置于真空干燥箱中干燥过夜。干燥的聚合物仿生抗体用用盐酸与甲醇的混合溶液（10:1，V:V）超声洗脱72 h，然后再用甲醇-冰乙酸混合溶液索氏提取盐酸克伦特罗分子，直至无盐酸克伦特罗检出为止。洗脱完毕后的聚合物仿生抗体在真空干燥箱中干燥后备用。
步骤（1）中盐酸克伦特罗与二氯甲烷的摩尔体积比为10 mmol:50~55 mL；盐酸克伦特罗与三乙胺的摩尔比为1:3.5~4；盐酸克伦特罗与甲基丙烯酰氯的摩尔比为1:2~2.5。
步骤（1）中淋洗液石油醚与乙酸乙酯的体积比为3:1。
步骤（1）中硅胶柱中所用硅胶直径为200~300目。
步骤（2）中盐酸克伦特罗衍生物和交联剂的摩尔比为1:2；甲醇与冰乙酸的体积比为9:1~2；干燥箱的温度为45~50 oC；盐酸溶液的摩尔浓度为3 mol/L；
步骤（2）中聚合物仿生抗体与盐酸-甲醇混合溶液的质量体积比为1g:200mL。
步骤（2）中的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯。
步骤（2）中的引发剂为偶氮二异丁腈，用量为30~50 mg。
优点及效果
本发明具有如下优点及有益效果：
本发明以化学合成的CLB衍生物为功能单体，采用共价聚合技术制备CLB分子印迹聚合物仿生抗体，避免了非共价法制备CLB分子印迹聚合物仿生抗体时模板分子与功能单体比例不确定问题，提高了CLB分子印迹聚合物仿生抗体的特异性；通过盐酸水解仿生抗体中的化学键，洗脱CLB分子后，仿生抗体中保留了与CLB分子空间结构高度互补的孔穴结构和结合位点，吸附时CLB分子又可通过氢键等非共价键结合到仿生抗体中的孔穴结构中，保证了仿生抗体的传质速度。另外，该方法制备的仿生抗体中的CLB需要通过强酸溶液才能释放出来，实际应用过程不会出现强酸环境，所以避免了CLB分子的渗漏问题。
附图说明
图1为 CLB衍生物核磁图。分析结果如下：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.13 (s, 2H), 6.19 – 6.09 (m, 1H), 5.80 (dd, J = 9.9, 3.9 Hz, 1H), 5.64-5.66 (m, 1H), 5.28 – 5.15 (m, 1H), 5.13 – 4.93 (m, 1H), 4.52 (s, 2H), 4.11 – 3.91 (m, 1H), 3.63 (dd, J = 15.7, 3.9 Hz, 1H), 2.02 – 1.89 (m, 6H), 1.51 (s, 9H)。结果表明CLB衍生物成功制备。
图2为CLB分子印迹聚合物仿生抗体（MIP）扫描电镜图。由图可见，CLB分子印迹聚合物仿生抗体的孔穴结构均匀且直径较小。
图3为CLB非印迹聚合物仿生抗体（NIP）扫描电镜图。由图可见，非印迹仿生抗体的孔穴较大且呈不规则状。
图4为CLB分子印迹聚合物仿生抗体吸附动力学（A）及拟二级动力学方程（B），由图可知，CLB分子印迹聚合物仿生抗体在20min内可达到吸附平衡，吸附过程符合拟二级动力学模型。
图5为CLB分子印迹聚合物仿生抗体（MIP）和非印迹聚合物仿生抗体（NIP）等温吸附曲线。
图6为CLB分子印迹聚合物仿生抗体和非印迹聚合物仿生抗体吸附CLB和其它四种结构类似物（特布他林、异丙肾上腺素、氨溴索、沙丁胺醇）的选择性吸附实验结果。结果表明，合成的CLB分子印迹聚合物仿生抗体对目标分子CLB有较好的选择识别能力。
具体实施方式
下面参照附图对本发明进行详细的说明：
本发明是一种高特异性CLB分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法，依次以化学合成方法将甲基丙烯酰氯与CLB分子反应后作为功能单体，以偶氮二异丁腈为引发剂，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂制备CLB分子印迹聚合物仿生抗体。本发明中，目标物CLB与功能单体通过共价键结合，降低了CLB分子印迹聚合物仿生抗体中非特异性位点的数量，提高了该仿生抗体的特异性。另外，该方法制备的仿生抗体中CLB分子的洗脱是通过强酸（HCl）及甲醇-冰乙酸混合溶剂实现的，在实际过程中不会出现模板分子渗漏问题，同时CLB分子印迹聚合物仿生抗体对目标物CLB的吸附是通过氢键等非共价键方式结合的，保证了仿生抗体对CLB分子的吸附速率。
本发明这种CLB分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法,其步骤如下：
（1）制备CLB衍生物：
将盐酸克伦特罗溶于二氯甲烷溶剂中，加入三乙胺后滴加甲基丙烯酰氯于二氯甲烷溶液中，混合物室温反应过夜。反应结束后，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤反应溶液，分出有机相，水相用二氯甲烷洗涤2次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，用旋转蒸发仪减压除去有机溶剂，残余物以石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为淋洗液用硅胶柱提纯得到CLB衍生物。
（2）制备CLB分子印迹聚合物仿生抗体：
取步骤（1）制备的盐酸克伦特罗衍生物溶于甲醇和乙酸乙酯混合溶液中，磁力搅拌至全部溶解，然后依次加入交联剂和引发剂，待固体全部溶解后吹氮气4~6 min除氧，然后将反应容器密封置于65~75℃水浴中聚合45~50 h。聚合反应结束后，用研钵将聚合物仿生抗体研至颗粒状，然后置于真空干燥箱中干燥过夜。干燥的聚合物仿生抗体用盐酸与甲醇的混合溶液（10:1，V:V，即盐酸与甲醇的体积比为10:1）超声洗脱72 h，然后再用甲醇-冰乙酸混合溶液索氏提取盐酸克伦特罗分子，直至无盐酸克伦特罗检出为止。洗脱完毕后的聚合物仿生抗体在真空干燥箱中干燥后备用。
上述步骤（1）中盐酸克伦特罗与二氯甲烷的摩尔体积比为10 mmol:50~55 mL；盐酸克伦特罗与三乙胺的摩尔比为1:3.5~4；盐酸克伦特罗与甲基丙烯酰氯的摩尔比为1:2~2.5。
上述步骤（1）中淋洗液石油醚与乙酸乙酯的体积比为3:1。
上述步骤（1）中硅胶柱中所用硅胶直径为200~300目。
上述步骤（2）中盐酸克伦特罗衍生物和交联剂的摩尔比为1:2；甲醇与冰乙酸的体积比为9:1~2；干燥箱的温度为45~50℃；盐酸溶液的摩尔浓度为3 mol/L。
上述步骤（2）中聚合物仿生抗体与盐酸-甲醇混合溶液的质量体积比为1g:200mL。
上述步骤（2）中交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯。
上述步骤（2）中的引发剂为偶氮二异丁腈，用量为30~50 mg。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：
一种CLB分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法,其步骤如下：
（1）制备CLB衍生物：
取10 mmol 盐酸克伦特罗溶于50mL二氯甲烷中，向溶液中加入40 mmol三乙胺后，滴加20 mmol甲基丙烯酰氯，室温反应过夜。反应结束后，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，分出有机相后，水相用二氯甲烷重复洗2次后，合并分离出的所有有机相，用无水硫酸钠干燥后，用旋转蒸发仪减压去除有机溶剂，残余物以石油醚-乙酸乙酯（3:1，V:V）为淋洗液用硅胶柱（硅胶直径为200~300目）提纯后得到产物CLB衍生物。
（2）制备CLB分子印迹聚合物仿生抗体：
取1 mmol 步骤（1）制备的CLB衍生物置于圆底烧瓶中，然后加入5ml甲醇-乙酸乙酯混合溶液（3:2，V:V）中，待全部溶解后，加入2 mmol交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯、30mg 引发剂偶氮二异丁腈，待固体全部溶解后，氮吹5min除氧，然后密封圆底烧瓶，将其置于70 oC水浴条件下聚合48 h。聚合反应结束后，用研钵将聚合物仿生抗体研至颗粒状，然后置于真空干燥箱中45 oC干燥过夜。将干燥后的1g聚合物仿生抗体用200 mL盐酸（3 mol/L）与甲醇的混合溶液（10:1，V:V）超声洗脱72 h，然后再用甲醇-冰乙酸混合溶液（9:1，V:V）索氏提取盐酸克伦特罗分子，直至无盐酸克伦特罗检出为止。洗脱完毕后的聚合物仿生抗体在真空干燥箱中干燥后备用。
实施例2：
一种CLB分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法,其步骤如下：
（1）制备CLB衍生物：
取10 mmol 盐酸克伦特罗溶于55mL二氯甲烷中，向溶液中加入35 mmol三乙胺后，滴加25 mmol甲基丙烯酰氯，室温反应过夜。反应结束后，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，分出有机相后，水相用二氯甲烷重复洗2次后，合并分离出的所有有机相，用无水硫酸钠干燥后，用旋转蒸发仪减压去除有机溶剂，残余物以石油醚-乙酸乙酯（3:1，V:V）为淋洗液用硅胶柱（硅胶直径为200~300目）提纯后得到产物CLB衍生物。
（2）制备CLB分子印迹聚合物仿生抗体：
取1 mmol 步骤（1）制备的CLB衍生物置于圆底烧瓶中，然后加入5ml甲醇-乙酸乙酯混合溶液（3:2，V:V）中，待全部溶解后，加入2 mmol交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯、50mg 引发剂偶氮二异丁腈，待固体全部溶解后，氮吹4min除氧，然后密封圆底烧瓶，将其置于75 oC水浴条件下聚合45 h。聚合反应结束后，用研钵将聚合物仿生抗体研至颗粒状，然后置于真空干燥箱中50 oC干燥过夜。将干燥后的1g聚合物仿生抗体用200 mL盐酸（3 mol/L）与甲醇的混合溶液（10:1，V:V）超声洗脱72 h，然后再用甲醇-冰乙酸混合溶液（9:2，V:V）索氏提取盐酸克伦特罗分子，直至无盐酸克伦特罗检出为止。洗脱完毕后的聚合物仿生抗体在真空干燥箱中干燥后备用。
实施例3：
一种CLB分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法,其步骤如下：
（1）制备CLB衍生物：
取10 mmol 盐酸克伦特罗溶于52mL二氯甲烷中，向溶液中加入38 mmol三乙胺后，滴加22 mmol甲基丙烯酰氯，室温反应过夜。反应结束后，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，分出有机相后，水相用二氯甲烷重复洗2次后，合并分离出的所有有机相，用无水硫酸钠干燥后，用旋转蒸发仪减压去除有机溶剂，残余物以石油醚-乙酸乙酯（3:1，V:V）为淋洗液用硅胶柱（硅胶直径为200~300目）提纯后得到产物CLB衍生物。
（2）制备CLB分子印迹聚合物仿生抗体：
取1 mmol 步骤（1）制备的CLB衍生物置于圆底烧瓶中，然后加入5ml甲醇-乙酸乙酯混合溶液（3:2，V:V）中，待全部溶解后，加入2 mmol交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯、40mg 引发剂偶氮二异丁腈，待固体全部溶解后，氮吹6min除氧，然后密封圆底烧瓶，将其置于65 oC水浴条件下聚合50 h。聚合反应结束后，用研钵将聚合物仿生抗体研至颗粒状，然后置于真空干燥箱中48 oC干燥过夜。将干燥后的1g聚合物仿生抗体用200 mL盐酸（3 mol/L）与甲醇的混合溶液（10:1，V:V）超声洗脱72 h，然后再用甲醇-冰乙酸混合溶液（9:1.5，V:V）索氏提取盐酸克伦特罗分子，直至无盐酸克伦特罗检出为止。洗脱完毕后的聚合物仿生抗体在真空干燥箱中干燥后备用。
实施例4：CLB非印迹聚合物仿生抗体的制备： 实施条件与实施例1相同，不同的是将添加的CLB衍生物替换为等物质的量的甲基丙烯酸。
实验例1：
将6份30mg CLB分子印迹聚合物仿生抗体分别加入含有5mL 浓度为25mg/L的CLB甲醇溶液中，然后室温下把该6份混合物在水平振荡器上以300rpm转速下振荡5、10、20、40、60、80min。振荡时间结束后，用直径为0.22μm的微孔滤膜过滤，未吸附的CLB分子浓度用高效液相色谱测定，根据结果计算吸附容量。结果如图3所示，可知制备的CLB分子印迹聚合物仿生抗体对目标物具有较快的吸附速率，在实验浓度下能20min内达到吸附平衡。
根据准二级动力学方程 对图3中的吸附动力学曲线进行拟合，其中qt表示CLB分子印迹聚合物仿生抗体在不同时间的吸附量，qe为二级动力学方程的理论吸附量，k为一级动力学反应速率常数，t为时间。拟合结果如图3所示，图3为CLB分子印迹聚合物仿生抗体吸附动力学数据准二级动力学方程拟合方程，通过Origin 8.0分析软件拟合由实例1制备的CLB分子印迹聚合物仿生抗体的准二级动力学拟合曲线方程的相关系数（R2）为0.9636，由公式计算的平衡时吸附量为1.65 mg/g，与实验所得平衡时吸附量相近，说明由实例1制备的CLB分子印迹聚合物仿生抗体对CLB的吸附符合准二级动力学模型。
实验例2：
取5 mL初始浓度分别为10、20、40、60、80、100、120、140、160 mg/L的莱克多巴胺溶液于25 mL容量瓶中，然后分别加入30 mg由实施例1制备的CLB分子印迹聚合物仿生抗体和非印迹仿生抗体，室温下在水平振荡仪以300 rmp转速下吸附60 min。时间结束后，用直径为0.22μm的微孔滤膜过滤，未吸附的CLB分子浓度用高效液相色谱测定，根据结果计算吸附容量。结果如图4所示，图4为CLB分子印迹聚合物仿生抗体与非印迹聚合物仿生抗体的等温吸附曲线，由图4可知，CLB分子印迹聚合物仿生抗体与非印迹聚合物仿生抗体的吸附容量随着初始浓度的增加而增加，浓度为160 mg/L时，CLB分子印迹聚合物仿生抗体的最大吸附容量为7.34 mg/g，CLB非印迹聚合物仿生抗体的最大吸附容量为1.99 mg/g。CLB分子印迹聚合物仿生抗体对CLB的吸附容量显著高于与非印迹聚合物仿生抗体对CLB的吸附容量，说明合成的CLB分子印迹聚合物仿生抗体的吸附性能良好，特异性强。
实验例3：
为了考察CLB分子印迹聚合物仿生抗体对目标物CLB的特异性吸附，选择CLB的四种结构类似物：特布他林、异丙肾上腺素、氨溴索、沙丁胺醇为CLB的竞争物。具体操作如下：
准确称取CLB分子印迹聚合物仿生抗体与非印迹聚合物仿生抗体 30 mg于50 mL容量瓶中，加入5 mL 25 mg L-1的特布他林、异丙肾上腺素、氨溴索、沙丁胺醇的溶液，水平振荡仪以300 rmp转速下吸附60min。振荡时间结束后，用直径0.22μm的微孔滤膜过滤后未吸附的CLB分子浓度用高效液相色谱测定，根据结果计算吸附容量。结果如图5所示，由图5可知，CLB分子印迹聚合物仿生抗体对目标物CLB具有最大的吸附容量（1.035 mg g-1），分别是特布他林、异丙肾上腺素、氨溴索、沙丁胺醇吸附容量的2.66、5.14、1.74、2.84倍，识别性能显著。