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1、(10)申请公布号 CN 103193748 A(43)申请公布日 2013.07.10CN103193748A*CN103193748A*(21)申请号 201310106920.7(22)申请日 2013.03.29C07D 311/30(2006.01)C07D 311/40(2006.01)(71)申请人厦门大学地址 361005 福建省厦门市思明南路422号(72)发明人王秀敏 连惠龙 杨钦磊 陈庆刘泽华 邱彦(74)专利代理机构厦门南强之路专利事务所(普通合伙) 35200代理人刘勇(54) 发明名称从野菊花中分离制备刺槐素单体的方法(57) 摘要从野菊花中分离制备刺槐素单体的方法。
2、，涉及野菊花的加工方法。提供一种分离效率高、回收率高的采用高速逆流色谱法从野菊花中分离制备刺槐素单体的方法。1）制备构成固定相、流动相的溶剂体系，所述溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成；2）先使高速逆流色谱仪填充固定相，然后调节流动相流速及主机转速，再泵入流动相并平衡；3）由进样阀进样；4）收集目标组分，经减压蒸干后重结晶，即得刺槐素单体。(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书4页 附图3页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书4页 附图3页(10)申请公布号 CN 103193748 ACN 103193748 A1/1页21.从野菊花中分。
3、离制备刺槐素的方法，其特征在于，采用野菊花总黄酮水解产物为原料，采用高速逆流色谱仪为分离设备，包括以下步骤：1）制备构成固定相、流动相的溶剂体系，所述溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成；2）先使高速逆流色谱仪填充固定相，然后调节流动相流速及主机转速，再泵入流动相并平衡；3）由进样阀进样；4）收集目标组分，经减压蒸干后重结晶，即得刺槐素单体。2.如权利要求1所述的从野菊花中分离制备刺槐素的方法，其特征在于，在步骤1）中，所述溶剂体系按体积比，正己烷乙酸乙酯甲醇水为(1.01.4)(0.61.0)11。3.如权利要求1所述的从野菊花中分离制备刺槐素的方法，其特征在于，在步骤1）中，以溶剂体系。
4、的上相为固定相，溶剂体系的下相为流动相。4.如权利要求1所述的从野菊花中分离制备刺槐素的方法，其特征在于，在步骤2）中，所述主机转速为900rpm。5.如权利要求1所述的从野菊花中分离制备刺槐素的方法，其特征在于，在步骤2）中，所述流动相的流速为2.99ml/min。6.如权利要求1所述的从野菊花中分离制备刺槐素的方法，其特征在于，在步骤4）中，所述收集目标组分根据检测器图谱或薄层色谱检测方法或高效液相色谱收集目标组分。权 利 要 求 书CN 103193748 A1/4页3从野菊花中分离制备刺槐素单体的方法技术领域0001 本发明涉及野菊花的加工方法，尤其是涉及一种采用高速逆流色谱法从野菊花。
5、中分离制备刺槐素单体的方法。背景技术0002 野菊花为菊科植物野菊（Chrysanthemum indicum L.）的干燥头状花序。在我国盛产于吉林、辽宁、河北、山西等地。我国对野菊花的研究历史悠久，中国药典（2010版）中记载野菊花具有清热解毒、泻火平肝的功效。现代药理证明：野菊花具有广谱抗菌、降压、增加冠脉血流量、抗病毒、清除氧自由基等作用（张捷，谭生建，姜韧，等，野菊花的研究进展，中国新医药，2004，3（1）：8-10）。野菊花中主要含有挥发油、刺槐苷（acaciin）、蒙花苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素和刺槐素(acacetin)等成分（毕跃峰，潘成学，王普菊，等.野菊花化学成分的研。
6、究，中国药学杂志，2009，44（12）：8794-897），刺槐素具有抗炎、抗过氧化、抑菌、促进白血球吞噬等作用（吴钉红，杨立伟，苏薇薇，野菊花化学成分及药理研究进展，中药材，2004，27（2）：142-144），刺槐素可以抑制多种肿瘤细胞的生长，具有良好的抗肿瘤应用前景（陈妙汝，杨佩玉，许志宏等，刺槐素抑制人类肿瘤细胞生长的体外试验，J Int Chin West Med，2007，9（2）：15-20）。0003 刺槐素在自然界中存在量极低，且多与糖结合，以苷的形式存在，因此大量研究人员一直在探索刺槐素的理想分离纯化方法。除野菊花中含有刺槐素外，飞机草及大蓟中也都含有刺槐素。目前有关文。
7、献报道中，刺槐素的提取方法主要为柱层析法，如硅胶柱层析法、凝胶柱层析法、聚酰胺柱层析法等。柱层析法的不足之处是：分离周期长，回收率低，成本较高，分离效果很不理想。0004 经文献检索，刺槐素的提取方法已有一些文献报道（丁智慧，张学镅，刘吉开，等，飞机草中的化学成分，天然产物研究与开发，2001，13（5）：22-24；郑晗，万春鹏，张的凤，等，大蓟炭化学成分的研究，江西中医学院学报，2009，21（2）：83-85；朱性海，王秀敏，连惠龙，等，水解法提取纯化刺槐素的工艺研究，中国生化药物杂志，2012，3（33）：275-277），同时有3篇与刺槐素提取方法有关的中国专利：一种柳穿鱼黄酮及其总。
8、黄酮的制备方法和用途，申请号：200910010324.2；野菊花类黄酮类色素的提取和制备方法，申请号：201010515860.0；一种从菊花中提取刺槐素的方法，申请号：201110409452.1；但上述专利所用提取的方法主要以柱层析为主。0005 高速逆流色谱（High-speed Counter-current Chromatography，HSCCC）是一种新型的、连续高效的液-液分配色谱技术，不需任何固态载体，避免固相载体表面与样品发生反应而导致样品的污染、失活、变性和不可逆吸附等不良影响。同时它也具有适用范围广、快速、进样量大、费用低、回收率高等优点。因此，高速逆流色谱法已越来越。
9、多地被应用于生物、医药、环保等领域各种物质的制备分离和纯化。0006 但现有方法中，尚未见采用高速逆流色谱法用于野菊花中刺槐素单体分离的有关技术报道。说 明 书CN 103193748 A2/4页4发明内容0007 本发明的目的在于提供一种分离效率高、回收率高的采用高速逆流色谱法从野菊花中分离制备刺槐素单体的方法。0008 本发明所述从野菊花中分离制备刺槐素单体的方法，采用野菊花总黄酮水解产物为原料，采用高速逆流色谱仪为分离设备，包括以下步骤：0009 1）制备构成固定相、流动相的溶剂体系，所述溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成；0010 2）先使高速逆流色谱仪填充固定相，然后调节流动相。
10、流速及主机转速，再泵入流动相并平衡；0011 3）由进样阀进样；0012 4）收集目标组分，经减压蒸干后重结晶，即得刺槐素单体。0013 在步骤1）中，所述溶剂体系按体积比，正己烷乙酸乙酯甲醇水可为(1.01.4)(0.61.0)11；以溶剂体系的上相为固定相，溶剂体系的下相为流动相。0014 在步骤2）中，所述高速逆流色谱仪可选用分析型、半制备型或制备型等不同类型的高速逆流色谱仪；所述主机转速最好为900rpm；所述流动相的流速最好为2.99ml/min。0015 在步骤4）中，所述收集目标组分可根据检测器图谱或薄层色谱检测方法或高效液相色谱收集目标组分；经测定所得刺槐素单体纯度在99%以上。
11、。0016 与现有技术比较，本发明的有益效果如下：0017 分离出的刺槐素通过高效液相色谱仪测定其纯度，通过紫外（Ultraviolet，UV）全波普扫描图谱、核磁共振图谱（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）、质谱（Mass Spectrum，MS）等方法验证其结构，结果体现所得产物为纯度99%以上的刺槐素单体。0018 本发明具有下述突出优点：0019 1）高效、便捷，操作简单，分离周期短。传统分离制备方法操作繁琐，分离一般要1个月甚至更长时间，周期长；高速逆流色谱法只需2天即可从野菊花总黄酮水解产物中分离刺槐素单体，大大缩短了分离周期。0020 2）反应条件容易。
12、控制，重复可控性好。传统的柱层析法常采用梯度洗脱，洗脱液浓度、洗脱速度不易精确控制，重复性差；而本发明的参数可控，重复性好。0021 3）制备量大。根据所需的目标样品量，可选择不同类型的高速逆流色谱仪进行分离。0022 4）低成本，样品损耗少，得率高，分离效果好。传统的柱层析法所用固定相是固体，易出现样品的吸附、分离纯度不高等现象；而高速逆流色谱法所用的固定相是液体，不存在吸附现象，因而分离得率高，分离效果好，经重结晶后纯度可达99%以上。0023 5）目标化合物稳定性好。由于分离过程不加入酸碱，而且在常温下进行，目标化合物不发生变化，最大程度地保持了化合物的稳定性。0024 6）分离得到的刺。
13、槐素单体，具有多种药理活性，如抗炎、抗过氧化、抑菌、促进白血球吞噬、抗肿瘤等作用，具有开发为新药的潜在应用。本发明提供了实现刺槐素单体药用的产业化制备基础。0025 由此可见，本发明可通过调整溶剂体系，采用高速逆流色谱法一步分离野菊花中说 明 书CN 103193748 A3/4页5刺槐素单体，较传统分离方法操作简便，分离周期短，可控性好，制备量大，样品损耗少，拥有用于自动化制备野菊花中刺槐素单体应用的前景，分离得到的刺槐素单体，具有多种药理活性，有潜力开发为一种新药，而本发明则成为制备野菊花中刺槐素单体药用的产业化制备基础。附图说明0026 图1为本发明实施例1所得产物的逆流色谱图。在图1中。
14、，横坐标为出峰时间（min），纵坐标为响应值(mV)；箭头所指为刺槐素单体。0027 图2为本发明实施例2所得产物的逆流色谱图。在图2中，横坐标为出峰时间（min），纵坐标为响应值(mV)；箭头所指为刺槐素单体。0028 图3为本发明实施例3所得产物的逆流色谱图。在图3中，横坐标为出峰时间（min），纵坐标为响应值(mV)；箭头所指为刺槐素单体。具体实施方式0029 以下各实施例均通过现有技术，先从野菊花中制备出野菊花总黄酮水解产物，然后均以野菊花总黄酮水解产物为分离制备刺槐素的原料，均采用高速逆流色谱仪为分离设备。0030 实施例10031 本实施例的溶剂体系，按体积比，正己烷乙酸乙酯甲醇水。
15、为6455。0032 从野菊花中分离制备刺槐素的方法包括以下步骤：0033 a、样品：取粉碎至粗粉的野菊花1Kg，加入3倍量80%的乙醇室温浸泡3次，每次1周，浸提液经抽滤得清液，清液减压回收乙醇后，过大孔树脂（AB-8），乙醇梯度洗脱，合并含有刺槐素的洗脱液，减压回收乙醇得水溶液；向水溶液中加入2.5倍量、3mol/L的盐酸，在100温度条件下，进一步进行酸水解，得到壁上黑色固体水解产物，用氯仿对水解产物进行超声提取，提取液减压回收氯仿即得野菊花总黄酮水解产物。0034 b、仪器：TBE-300A高速逆流色谱仪，上海同田生物技术有限公司产品。0035 采用柱容积为300ml的高速逆流色谱仪（。
16、TBE-300A）进行分离。选取正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水作为溶剂体系，按6455体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，充分摇匀后，静置过夜，分层。分离两相溶剂系统，选定上相为固定相，下相为流动相。将固定相、流动相在超声清洗器中脱气30min。0036 C、称取120mg野菊花总黄酮水解产物，以10ml流动相超声溶解，过滤取滤液作为进样样品备用。0037 进样前，将固定相以9.99ml/min的流速泵入高速逆流色谱的色谱柱。待泵满整个柱子后，开启高速逆流色谱仪主机，设定仪器旋转方向为正转，缓慢将转速升至900rpm，将流动相按设定的流速2.99ml/min泵入色谱仪中，直至建立动态平衡。003。
17、8 由进样阀进样；通过与仪器信号采集系统相连的计算机色谱工作站采集数据，然后根据检测图谱，接收目标成分，分离得到刺槐素8mg，经过HPLC检测，纯度在99%以上。0039 实施例20040 本实施例的溶剂体系，按体积比，正己烷乙酸乙酯甲醇水为7355。说 明 书CN 103193748 A4/4页60041 从野菊花中分离制备刺槐素的方法包括以下步骤：0042 a、样品：取粉碎至粗粉的野菊花1Kg，加入3倍量80%的乙醇室温浸泡3次，每次1周，浸提液经抽滤得清液，清液减压回收乙醇后，过大孔树脂（AB-8），乙醇梯度洗脱，合并含有刺槐素的洗脱液，减压回收乙醇得水溶液；向水溶液中加入2.5倍量、3。
18、mol/L的盐酸，在100温度条件下，进一步进行酸水解，得到壁上黑色固体水解产物，用氯仿对水解产物进行超声提取，提取液减压回收氯仿即得野菊花总黄酮水解产物。0043 b、仪器：TBE-300A高速逆流色谱仪，上海同田生物技术有限公司0044 采用柱容积为300ml的高速逆流色谱仪（TBE-300A）进行分离。选取正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水作为溶剂体系，按7355体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，充分摇匀后，静置过夜，分层。分离两相溶剂系统，选定上相为固定相，下相为流动相。将固定相、流动相在超声清洗器中脱气30min。0045 C、称取220mg野菊花总黄酮水解产物，以10ml流动相超声溶解。
19、，过滤取滤液作为进样样品备用。0046 进样前，将固定相以9.99ml/min的流速泵入高速逆流色谱的色谱柱。待泵满整个柱子后，开启高速逆流色谱仪主机，设定仪器旋转方向为正转，缓慢将转速升至900rpm，将流动相按设定的流速2.99ml/min泵入色谱仪中，直至建立动态平衡。0047 由进样阀进样；通过与仪器信号采集系统相连的计算机色谱工作站采集数据，然后根据检测图谱，接收目标成分，分离得到刺槐素13mg，经过HPLC检测，纯度在99%以上。0048 实施例30049 本实施例的溶剂体系，按体积比，正己烷乙酸乙酯甲醇水为1111。0050 从野菊花中分离制备刺槐素的方法包括以下步骤：0051 。
20、a、样品：取粉碎至粗粉的野菊花1Kg，加入3倍量80%的乙醇室温浸泡3次，每次1周，浸提液经抽滤得清液，清液减压回收乙醇后，过大孔树脂（AB-8），乙醇梯度洗脱，合并含有刺槐素的洗脱液，减压回收乙醇得水溶液；向水溶液中加入2.5倍量、3mol/L的盐酸，在100温度条件下，进一步进行酸水解，得到壁上黑色固体水解产物，用氯仿对水解产物进行超声提取，提取液减压回收氯仿即得野菊花总黄酮水解产物。0052 b、仪器：TBE-300A高速逆流色谱仪，上海同田生物技术有限公司0053 采用柱容积为300ml的高速逆流色谱仪（TBE-300A）进行分离。选取正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水作为溶剂体系，按1111。
21、体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，充分摇匀后，静置过夜，分层。分离两相溶剂系统，选定上相为固定相，下相为流动相。将固定相、流动相在超声清洗器中脱气30min。0054 C、称取140mg野菊花总黄酮水解产物，以10ml流动相超声溶解，过滤取滤液作为进样样品备用。0055 进样前，将固定相以9.99ml/min的流速泵入高速逆流色谱的色谱柱。待泵满整个柱子后，开启高速逆流色谱仪主机，设定仪器旋转方向为正转，缓慢将转速升至900rpm，将流动相按设定的流速2.99ml/min泵入色谱仪中，直至建立动态平衡。0056 由进样阀进样；通过与仪器信号采集系统相连的计算机色谱工作站采集数据，然后根据检测图谱，接收目标成分，分离得到刺槐素10mg，经过HPLC检测，纯度在99%以上。说 明 书CN 103193748 A1/3页7图1说 明 书 附 图CN 103193748 A2/3页8图2说 明 书 附 图CN 103193748 A3/3页9图3说 明 书 附 图CN 103193748 A。