一种检测恩诺沙星免疫亲和凝胶检测柱及其制备方法技术领域
本发明属于小分子化合物免疫化学和残留分析技术领域，涉及免疫化学、
酶学与分析化学技术等，尤其是涉及一种恩诺沙星免疫亲和凝胶可视化检测
柱的制备。
背景技术
恩诺沙星(Enrofloxacin)，又名乙基环丙沙星，是世界上第一个动物专
用的喹诺酮类药物，具有抗菌谱广、抗菌能力强、无交叉耐药性、体内分布
广等特点，可广泛用于预防和治疗动物细菌性疾病和支原体感染方面的治疗，
成为畜禽业和水产养殖业中最重要的抗菌类药物之一，被大量用于动物疾病
治疗、预防和促生长。近年来，恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星在临床上应
用所产生的不良反应和耐药性报道越来越多。恩诺沙星可引起神经中毒、肾
功能损伤、过敏反应、幼畜关节炎等毒副作用,其在动物性食品中的残留直接
威胁到人类身体健康。为保障人民健康及扩大与世界各国食品贸易往来,必须
建立灵敏度高、特异性强、简单快速的测定方法对恩诺沙星残留进行监控。
目前，恩诺沙星残留的检测方法主要有微生物法、高效液相色谱法
(HPLC)、薄层层析(TLC)法、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、高效
毛细管电泳法(HPCE)、免疫分析法(IAS)等。其中高效液相色谱法是广
泛应用的确证方法，方法准确性高，但是前处理方法繁琐，需要昂贵的仪器
以及专业的人员操作，检测费用昂贵，不适合进行现场快速检测。因此，积
极发展一种灵敏度高、快速、简便的药物残留检测手段势在必行。免疫检测
方法，可有效避免样品处理，仪器等因素的制约，而且方法的特异性强，灵
敏度高，甚至可以制成试纸用于现场快速检测。然而试纸条检测也易受样品
基质的影响，在不同食品样品检测中受到一定限制。本发明阐述的凝胶柱免
疫检测产品为某些颜色较深及基质影响较大的样品中的恩诺沙星残留检测
分析提供一种行之有效的可视化定性半定量快速简单的检测方法，为食品安
全的有力监管提供可靠的技术保障。
发明内容
本发明提出一种可以定性半定量的检测食品中的恩诺沙星的简单、省时、
灵敏的可视化免疫亲和凝胶检测柱的制备。只要样品中含有酶标记抗原，凝
胶检测柱的质控层就会出现蓝色，它可以确保检测柱可以正常检测，达到质
控的作用。以凝胶检测柱的质控层为基准，通过检测层颜色深浅变化达到定
性或半定量检测食品样品中的恩诺沙星的目的。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
封闭胶的制备
(1)溶胀：称取1.00g溴化氰活化琼脂糖凝胶，加入到80mL的配制好的HCl
溶液中，搅拌溶胀10min(溶胀后胶的终体积约为3.5mL)。
(2)淋洗：将溶胀好的琼脂糖凝胶转移到在具砂板层析柱中，再加入200mL
HCl淋洗，然后用偶联缓冲液冲洗柱子，调节柱子pH至中性。
(3)封闭：加入9mL甘氨酸封闭液，密封柱子，室温下震荡反应2h。
(4)清洗：首先加入10mL的偶联缓冲液淋洗一次，然后用10mL的醋酸钠
缓冲溶液和10mL的偶联缓冲液分别冲洗3遍。
(5)贮存：待清洗液抽空，制备好的封闭胶用PBS悬起，约10mLPBS(含有
0.3ml/L的抑菌素)，放置于4℃保存待用。
恩诺沙星抗体胶和HRP抗体胶的制备
(1)溶胀：准确称取0.50g溴化氰活化琼脂糖凝胶，加入到40mL的配制好
的HCL溶液中，搅拌溶胀10min(溶胀后胶的终体积约为1.8mL)。
(2)淋洗：将溶胀好的琼脂糖凝胶转移到在具砂板层析柱中，再加入200mL
HCL淋洗，然后用偶联缓冲液冲洗柱子，调节柱子pH至中性，将淋洗液全
部淋完。
(3)偶联抗体：取1.00mg/mL抗体，用1mL的偶联缓冲液稀释，然后加入到
在具砂板层析柱中，密封柱子，室温下震荡反应2h。
(4)封闭：加入10mL的偶联缓冲液淋洗柱子，然后加入10mL的封闭液，再
次密封柱子，室温震荡反应2h。
(5)清洗：首先加入10mL的偶联缓冲液淋洗一次，然后用10mL的醋酸钠
缓冲溶液和10mL的偶联缓冲液分别冲洗3遍；
(6)贮存：待清洗液抽空，制备好的抗体胶用PBS悬起，约5mLPBS(含有
0.3ml/L的抑菌素)，放置于4℃保存待用。
HRP抗体胶和恩诺沙星抗体胶的制备过程相同，只是偶联不同的抗体。
将所述封闭胶和抗体胶(HRP抗体胶)按一定比例混合制备凝胶检测柱
的质控层和检测层，即：
(1)质控层是由HRP抗体胶与封闭胶以一定比例混合好后，取200μL混合胶
加入到1mL的SPE塑料柱中，用注射器活塞将PBS压出；
(2)检测层是由优化好的抗体胶与封闭胶以一定的比例混合好后，取200μL
加入其中，用注射器活塞将PBS压出；
进一步的，所述质控层和检测层，制备检测柱，即：
(1)检测柱由下到上，分别是对照层和检测层，对照层和检测层之间隔开一个
3mm的空气层，可以防止加入底物显色后试剂和颜色从对照层迁移到检测
层中。
(2)首先将聚乙烯垫片加入1mL的塑料柱中，然后加入对照层混合胶，加入
第二层聚乙烯垫片，在对照层上方约3mm处加入第三层聚乙烯垫片，然后
加入其检测层的混合胶，最后在顶部加入第四层垫片。
本发明创造所述的免疫检测柱相对于现有技术具有以下优势：
(1)本发明提供的恩诺沙星免疫亲和凝胶检测柱，可专一识别恩诺沙星，具有
非常高的选择性。
(2)本发明恩诺沙星免疫亲和凝胶检测柱是一种可视化的定性半定量检测产
品。对目标待测物的检测，检测柱会以检测层颜色的有无给出检测结果，即
以是/否的可视定性信号给予应答，操作方便，结果判断简单。
(3)本发明制得的恩诺沙星免疫亲和凝胶检测柱既可以使之与净化柱串联，消
除样品基质影响；又可容纳较大体积的清洗缓冲液和样品溶液，提高了方法
灵敏度。检测产品不需要任何复杂的前处理，及大型仪器的辅助，具有很好
的易用性和准确性，满足现场快速检测的要求。
附图说明
构成本发明创造的一部分的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，
本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发
明创造的不当限定。在附图中：
图1为本发明创造实施例所述的凝胶检测柱的组装示意图；
1-注射器，2-转接头，3-进样口，4-聚乙烯垫片，5-检测层，6-空气层，7-质
控层，8-出口。
图2本发明创造实施例所述的恩诺沙星凝胶检测柱检测限的判定(恩诺沙星
浓度从左到右为0、1、2、5、10μg/L)；
图3为本发明创造实施例所述的恩诺沙星凝胶检测柱特异性的判定(与喹诺
酮类兽药的交叉反应结果)，从左至右依次为：1、PBS；2、恩诺沙星；3、依
诺沙星；4、氟甲奎；5、达诺沙星；6、麻保沙星；7、司帕沙星；8、加替沙星；9、
氟罗沙星；10、罗美沙星；11、二氟沙星；12、沙拉沙星；13、环丙沙星；14、诺
氟沙星；15、氧氟沙星；2浓度为5μg/L、3-15浓度为500μg/L；
图4本发明创造实施例所述的恩诺沙星凝胶检测柱特异性的判定(与其它兽
药的交叉反应结果)，从左至右依次为：1、PBS；2、恩诺沙星；3、磺胺；4、
四环素；5、沙丁胺醇；6、呋喃它酮；7、氯霉素；8、甲硝唑；2浓度为5μg/L、
3-8浓度为500μg/L；
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是
限定性的，不能以下述实施来限定本发明的保护范围。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明创造。
实施例1
1、恩诺沙星抗血清的纯化
采用ProteinA－Sepharose4B作亲合层析介质纯化恩诺沙星抗血清，
可一次性获得接近纯度较高的特异性抗体。具体操作步骤为(1)平衡：用平衡
缓冲液(0.2mol/L的磷酸缓冲液)冲洗管路，平衡柱子，至基线平稳。(2)上
样：用平衡缓冲液将恩诺沙星特异性抗血清等体积稀释后上柱。(3)洗杂：用
平衡缓冲液洗杂至杂蛋白的紫外吸收峰出现后继续冲洗至基线平稳。(4)洗脱
收集：用0.1mol/LpH2.7的甘氨酸缓冲液洗脱特异性IgG抗体。当紫外吸
收曲线呈上升趋势，收集特异性抗体。并迅速用Tris-HCl中和抗体至中性。
(5)封柱：抗体收集完成后迅速用醋酸缓冲液酸化纯化柱后，用平衡缓冲液中
和纯化柱，最后用20％乙醇饱和封柱。将纯化收集的抗体，用pH7.4的磷
酸缓冲液4℃透析三天后取出，测定抗体蛋白浓度，添加0.1％(w/v)的叠氮
钠，4℃储存备用。利用该抗体与活化琼脂糖凝胶结合制备恩诺沙星抗体胶。
2、恩诺沙星酶标抗原ENR-HRP的制备
精确称取恩诺沙星8mg溶于350μLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加
入6.32mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和11.35mgN,N-二环已基碳二亚胺
(DCC)，在室温下避光搅拌使其反应4-6h，在反应过程中有混浊物产生，反
应结束后将反应溶液离心(5℃，10000g，5min)除去沉淀，并在冰浴条件
下将上层活化酯溶液缓慢加入到3mL溶有10.00mgHRP的碳酸氢钠溶液
(130mmol/L，pH8.1)中，置于4℃下搅拌反应过夜，然后将反应液移入
透析袋，在4℃下、用磷酸盐缓冲液(pH7.4，0.01mol/mL)透析，最后精
确量取蛋白质偶联物溶液的体积，测定浓度，加入10％硫柳汞溶液(W/V)，
于4℃下保存备用。利用该酶标抗原与恩诺沙星竞争性结合抗体，产生颜色
深浅变化，鉴定待测物恩诺沙星。
3、恩诺沙星检测柱的制备和组装方法
(1)制备封闭胶、恩诺沙星抗体胶和HRP抗体胶
制备封闭胶，首先称取1.00g溴化氰活化琼脂糖凝胶，加入到80mL的
配制好的HCl溶液中，搅拌溶胀10min(溶胀后胶的终体积约为3.5mL)。将
溶胀好的琼脂糖凝胶转移到在具砂板层析柱中，再加入200mLHCl淋洗，
然后用偶联缓冲液冲洗柱子，调节柱子pH至中性。加入9mL甘氨酸封闭
液，密封柱子，室温下震荡反应2h。之后先加入10mL的偶联缓冲液淋洗
一次，然后用10mL的醋酸钠缓冲溶液和10mL的偶联缓冲液分别冲洗3
遍。待清洗液抽空，制备好的封闭胶用PBS悬起，约10mLPBS(含有0.3ml/L
的抑菌素)，放置于4℃保存待用。
恩诺沙星抗体胶和HRP抗体胶的制备方法同封闭胶，差别仅在于在封
闭之前0.5mg/mL的恩诺沙星特异性抗体和1mg/mL的HRP特异性抗体被加
入到凝胶当中，室温偶联2h。
(2)制备免疫亲和凝胶检测柱质控层与检测层
质控层是由HRP抗体胶与封闭胶以一定比例混合好后，取200μL混
合胶加入到1mL的SPE塑料柱中，用注射器活塞将PBS压出得到；检测
层是由优化好的抗体胶与封闭胶以一定的比例混合好后，取200μL加入其
中，用注射器活塞将PBS压出得到；
(3)组装恩诺沙星免疫亲和凝胶检测柱
检测柱由下到上，分别是质控层和检测层，质控层和检测层之间隔开一
个3mm的空气层，可以防止加入底物显色后试剂和颜色从质控层迁移到检
测层中。首先将聚乙烯垫片加入1mL的塑料柱中，然后加入质控层混合胶，
加入第二层聚乙烯垫片，在质控层上方约3mm处加入第三层聚乙烯垫片，
然后加入其检测层的混合胶，最后在顶部加入第四层垫片。
实施例2
恩诺沙星凝胶检测柱使用方法
1、检测步骤
(1)加样：用PBS溶液将按一定比例稀释的酶标抗原与恩诺沙星样品溶
液预混合至1mL，通过进样口通过柱子，控制流速在1min流完。
(2)洗柱：用PBST1mL由进样口加入冲洗柱子，淋洗7遍即共7mL，再用
PBS2mL冲洗去除未与抗体结合的抗原与残留的Tween20。
(3)显色：从顶端加入300μL底物液，反应30s后，用注射器活塞注入空气，
将底物液完全排出，继续显色4min后，观察结果。
2、结果判定
目测凝胶柱的质控层和检测层颜色。质控层呈明显蓝色，说明检测柱可
以正常使用。使用检测柱检测不同浓度的恩诺沙星(0、1、2、5、10μg/L)，
当目测检测层颜色完全消色时待测物的最低浓度作为检测柱的检出限。由图
2结果表明，当恩诺沙星浓度低于2μg/L时，检测层显色结果与空白对照目
测比较无差别；当恩诺沙星浓度为2μg/L时，检测层显色结果与空白对照目
测比较有区别，颜色变浅；当恩诺沙星浓度继续增大，检测层蓝色逐渐变浅；
恩诺沙星浓度为5μg/L时，检测层蓝色消失。由此判定方法的检测限为5μg/L。
3、特异性判定
选择了13种喹诺酮类药物和6种其它种类兽药，使用恩诺沙星凝胶检
测柱检测，5μg/L恩诺沙星使得检测柱的检测层蓝色消失。对于其它13种
喹诺酮类药物和6种兽药，当其浓度达到500μg/L时，检测柱检测层仍会
出现明显的蓝色，进而说明使用此凝胶检测柱检测样品中恩诺沙星的含量具
有高度的特异性，如图3和图4所示。
实施例3
本发明的应用效果举例
1、样品处理方法
牛奶基质：牛奶样品属于液体样品，可以采用直接稀释法消除基质影响，取
1mL牛奶于试管中，用PBST溶液直接稀释10倍,然后取1mL的稀释液
与酶标混合后，加入免疫亲和凝胶检测柱柱进行检测。
组织基质：1g组织切碎置于50mL离心管中，加0.4mLNaOH(0.1M)，
1.6mL乙腈，高速漩涡混匀2min，离心(15℃，5000r/min，10min)，PBST
溶液稀释10倍，取1mL的稀释液与酶标混合后，加入免疫亲和凝胶检测
柱进行检测。
2、有效性实验
向阴性组织样品中添加恩诺沙星使样品中恩诺沙星最终浓度为10μg/kg、
20μg/kg、100μg/kg的，牛奶样品中添加恩诺沙星使样品中恩诺沙星最终浓
度分别为：10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg。当组织样品中恩诺沙星浓度为100
μg/kg，牛奶样品中恩诺沙星浓度为50μg/kg时，检测柱检测层颜色完全消失，
所以牛肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、虾肉、鱿鱼、比目鱼、猪肝8种动物组织中
恩诺沙星检测限为100μg/kg。牛奶中恩诺沙星检测限为50μg/kg。
实验表明本发明的凝胶检测柱准确性好、灵敏度高、特异性好，而且样
品前处理方法简单，整个检测过程不超过10min，可作为是恩诺沙星残留快
速检测的有效筛检新工具。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，
凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，
均应包含在本发明创造的保护范围之内。