说明书亲和力成熟的CRIg变体
本申请是申请日为2009年05月06日、中国申请号为200980116490.9、发明名称为“亲和力成熟的CRIg变体”的发明申请的分案申请。
发明领域
本发明关注亲和力成熟的CRIg变体。具体而言，本发明关注具有提高的对C3b的结合亲和力且保留胜过C3的对C3b的选择性结合的CRIg变体。
发明背景
补体系统
补体系统是由正常情况下以无活性的酶原形式存在的一系列血清糖蛋白构成的复杂酶级联。三种主要途径，即经典、旁路和甘露糖结合凝集素途径，能活化补体，它们在C3水平合并，其中两种类似的C3转化酶将C3切割成C3a和C3b。
巨噬细胞是已经发展出如下先天能力的专门细胞，即识别细胞表面表达的鉴定标签的结构中的微小差异，所述的鉴定标签即所谓的分子样式(Taylor等,Eur J Immunol 33,2090-1097(2003)；Taylor等,Annu Rev Immunol 23,901-944(2005))。虽然这些表面结构的直接识别是先天免疫的一个基础方面，但是调理作用容许通用巨噬细胞受体介导吞食，提高效率和使吞噬细胞的识别全集多样化(Stuart和Ezekowitz,Immunity 22,539-550(2005))。吞食过程涉及多种配体-受体相互作用，而且现在清楚了多种调理素(包括免疫球蛋白、胶原凝集素、和补体成分)经由与巨噬细胞表面受体的相互作用来引导病原体内在化所需要的细胞活性(综述见Aderem和Underhill,Annu Rev Immunol17,593-623(1999)；Underhill和Ozinsky,Annu Rev Immunol 20,825-852(2002))。虽然由种系基因编码的天然免疫球蛋白能识别极其多种病原体，但是大多数调理性IgG是经由适应性免疫生成的，而且因此经由Fc受体的高效清除不是立即的(Carroll,Nat Immunol 5,981-986(2004))。另一方面，补体快速识别病原体表面分子并使微粒准备好由补体受体来摄取(Brown,Infect Agents Dis 1,63-70(1991))。
补体由30种以上的血清蛋白质组成，它们调理极其多种病原体，用以被补体受体所识别。取决于级联的初始触发，可区别三种途径(综述见Walport,N Engl J Med 344,1058-1066(2001))。所有这三种途径共享活化中枢成分C3的共同步骤，但是它们依据识别的本质和导致C3活化的初始生化步骤而不同。经典途径如下活化，抗体结合至病原体表面，其继而结合C1q补体成分，引起一系列蛋白酶级联，最终将C3切割成其活性形式C3b。凝集素途径在碳水化合物基序受到凝集素蛋白质识别后被活化。至今，已经鉴定了此途径的三个成员：结合甘露糖的凝集素(MBL)，SIGN-R1凝集素家族和ficolin(Pyz等,Ann Med 38,242-251(2006))。MBL和ficolin都与丝氨酸蛋白酶有关，其像经典途径中的C1那样起作用，活化成分C2和C4，导致中枢C3步骤。旁路条件与经典条件和凝集素途径二者形成对照，即它是由于内部C3酯与病原体表面上的识别基序的直接反应而被活化的。经由旁路途径蛋白酶因子B和因子D的作用，初始C3结合活化性表面导致C3b沉积的快速扩大。重要的是，经由因子B和D的作用，通过经典途径或凝集素途径任一所沉积的C3b也能导致C3b沉积的扩大。在补体活化的所有三种途径中，调理中的关键步骤是成分C3转化成C3b。补体级联的酶对C3的切割将硫酯暴露于亲核攻击，容许C3b经由硫酯结构域共价附着到抗原表面上。这是补体调理中的初始步骤。对所结合的C3b的后续蛋白水解生成iC3b、C3c和C3dg，即受到不同受体识别的片段(Ross和Medof,Adv Immunol 37,217-267(1985))。此切割消除了C3b进一步扩大C3b沉积和活化补体级联晚期成分(包括能够指导膜破坏的膜攻击复合物)的能力。然而，巨噬细胞的吞噬细胞受体优先识别C3b及其片段；由于酯键形成的通用性，C3介导的调理对于病原体识别是重要的(Holers等,Immunol Today 13,231-236(1992))，而且各种C3降解产物的受体因此在宿主免疫应答中发挥重要作用。
C3自身是由13个独特结构域组成的复杂的且有柔性的蛋白质。该分子的核心由8个所谓的巨球蛋白(MG)结构域构成，它们构成了C3的紧密压缩的α和β链。插入此结构的是CUB(C1r/C1s、Uegf和骨形态生成蛋白-1)和TED结构域，后者含有容许C3b与病原体表面共价结合的硫酯键。剩余结构域含有C3a，或者作为核心结构域的接头和间隔物起作用。C3b和C3c结构与C3的比较证明了该分子在每次蛋白水解时经历重大构象重排，不仅暴露TED， 而且暴露了该分子的能与细胞受体相互作用的别的新的表面(Janssen和Gros,Mol Immunol 44,3-10(2007))。
吞噬细胞上的补体C3受体
有三个已知的补体受体基因超家族：短共有重复(SCR)模块(其编码CR1和CR2)，β-2整联蛋白家族成员CR3和CR4，及免疫球蛋白Ig超家族成员CRIg。
CR1是由30个短共有重复(SCR)组成的180-210kDa糖蛋白，在免疫复合物清除中发挥主要作用。SCR是约60个氨基酸的模块结构，每个有两对二硫键，提供结构刚性。对C3b和C4b二者的高亲和力结合经由两个独特位点发生，每个由3个SCR构成(综述见Krych-Goldberg和Atkinson,Immunol Rev 180,112-122(2001))。CR1的SCR 15-17内所包含的C3b结合位点(位点2)的结构已经通过MRI测定(Smith等,Cell 108,769-780(2002))，揭示了三个模块处于延伸的头对尾排列中，在16-17连接处有柔性。结构指导的诱变鉴定了模块15上对C4b结合至关重要的一个带正电荷的表面区域。此片与CR1同一面上暴露的模块16的碱性侧链一起是C3b结合所需要的。CR1的主要功能，首先描述为免疫粘附受体(Rothman等,J Immunol 115,1312-1315(1975))，用以捕捉红细胞上的IC，供转运和通过肝的清除(Taylor等,Clin Immunol Immunopathol 82,49-59(1997))。嗜中性细胞上的CR1在吞噬中有作用，但是在组织巨噬细胞中不然(Sengelov等,J Immunol 153,804-810(1994))。在其在免疫复合物清除中的作用之外，经由其与相应转化酶的相互作用，CR1是经典途径和旁路途径二者活化的有力抑制剂(Krych-Goldberg和Atkinson,2001,见上文；Krych-Goldberg等,J Biol Chem 274,31160-31168(1999))。在小鼠中，CR1和CR2是同一基因通过可变剪接形成的两种产物，主要与B淋巴细胞和滤泡树突细胞有关，且主要在调节B细胞应答中发挥功能(Molina等,1996)。CR1的小鼠功能等效物Crry灭活经典途径和旁路途径酶，并作为补体活化的内在调控物起作用，而不是作为吞噬细胞受体起作用(Molina等,Proc Natl Acad Sci USA 93,3357-3361(1992))。
CR2(CD21)结合iC3b和C3dg，而且是增强B细胞免疫的主要补体受体(Carroll,Nat Immunol 5,981-986(2004)；Weis等,Proc Natl Acad Sci USA 81,881-885(1984))。关联B细胞对C3d包被的抗原的摄取经由B细胞抗原受体导 致增强的信号。如此，CD21-CD19-CD81共同受体与B细胞抗原受体的共参与降低了B细胞活化的阈值并提供了重要的存活信号(Matsumoto等,J Exp Med 173,55-64(1991))。iC3b上的CR2结合位点已经部分定位在介于TED和MG1结构域之间的界面上(Clemenza和Isenman,J Immunol 165,3839-3848(2000))。
CR3和CR4是由α亚基(分别为CD11b或αM和CD11c或αX)和共同β链(CD18或β2)构成的跨膜异二聚体，而且涉及对胞外基质和对其它细胞的粘附以及iC3b识别。它们属于整联蛋白家族，而且不仅在吞噬中，而且在白细胞运输、突触形成和共刺激中实施功能(综述见Ross,Adv Immunol 37,217-267(2000))。整联蛋白粘性经由称作内向外信号传导的过程来调控，将整联蛋白自低亲和力结合状态转化成高亲和力结合状态(Liddington和Ginsberg,J Cell Biol 158,833-839(2002))。另外，配体结合将信号自胞外结构域转导至胞质。iC3b的结合位点已经定位至CR3和CR4的α链上的数个结构域(Diamond等,J Cell Biol 120,1031-1043(1993)；Li和Zhang,J Biol Chem 278,34395-34402(2003)；Xiong和Zhang,J Biol Chem 278,34395-34402(2001))。CR3的多种配体(iC3b、β-葡聚糖和ICAM-1)似乎结合CD11b的I结构域内所包含的部分交叠位点(Balsam等,1998；Diamond等,1990；Zhang和Plow,1996)。基于将CR3结合位点定位至在C3b中CUB结构域解折叠后变成暴露的残基的结构研究，预测了它对蛋白水解灭活形式的C3b(即iC3b)的特异性识别(Nishida等,Proc Natl Acad Sci U S A 103,19737-19742(2006))，这发生在补体调控蛋白酶因子I的α’链切割后。
CRIg是一种巨噬细胞相关受体，与A33抗原和自血流清除病原体所需要的JAM1有同源性。人CRIg蛋白是使用识别人JAM1的保守Ig结构域的简并引物首先自人胎cDNA文库克隆的。对数个克隆的测序揭示了400个氨基酸的可读框。Blast搜索证实了与1型跨膜蛋白Z39Ig的相似性(Langnaese等,Biochim Biophys Acta 1492(2000)522-525)。发现此分子的胞外区有两个Ig样结构域组成，包含N端V-set结构域和C端C2-set结构域。这种新的人蛋白质最初称作“单次跨膜Ig超家族成员巨噬细胞相关的”(huSTIgMA)。(huSTIgMA)。随后，使用3’和5’引物，克隆了huSTIgMA的一种剪接变体，它缺少最接近膜的IgC结构域，而且短50个氨基酸。因而，这种人蛋白质的较短剪接变体称作huSTIgMA-短。huSTIgMA(称作PRO362)的氨基酸序列和编码多核苷酸序 列披露于2002年6月25日授权的美国专利No.6,410,708。另外，huSTIgMA和huSTIgMA-短二者以及鼠STIgMA(muSTIgMA)蛋白质和核酸序列披露于2004年4月15日公布的PCT公开文本WO 2004031105。
2008年2月21日公布的美国申请公开文本No.2008/0045697中披露了CRIg和C3b:CRIg复合物的晶体结构。
驻留在肝血窦的内腔内的Kupffer细胞(KC)形成身体中最大群的巨噬细胞。虽然KC具有与其它组织驻留的巨噬细胞共同的标志物，但是它们实施专门化的功能，连接通向有效清除自消化道的微血管系统排出的门静脉血中存在的、肠衍生的细菌、微生物碎片、细菌内毒素、免疫复合物和死细胞(Bilzer等，Liver Int 26，1175-1186(2006))。病原体对KC表面的有效结合是针对病原体的一线免疫防御中的一个至关重要的步骤(Benacerraf等,J Exp Med 110,27-48(1959))。消减了KC的小鼠中显著升高的死亡率证明了KC在自循环中快速清除病原体方面的重要作用(Hirakata等,Infect Immun 59,289-294(1991))。CRIg的鉴定进一步强调补体和KC在针对循环中的病原体的一线免疫防御中的重要作用。
在小鼠KC上鉴定的唯一补体C3受体是CRIg和CR3(Helmy等,Cell 124,915-927(2006))，而人KC显示额外的CR1和CR4表达(Hinglais等,1989)。在体外，KC上的CRIg和CR3都有助于对iC3b调理的微粒的结合(Helmy等,Lab Invest 61,509-514(2006))。在体内，KC表达的CR3在结合iC3b包被的病原体中的作用不太清楚。已经提出，CR3有助于经嗜中性细胞募集和与嗜中性细胞表达的ICAM1的相互作用而间接清除病原体(Conlan和North,Exp Med 179,259-268(1994)；Ebe等,Pathol Int 49,519-532(1999)；Gregory等,J Immunol157,2514-2520(1996)；Gregory和Wing,J Leukoc Biol 72,239-248(2002)；Rogers和Unanue,Infect Immun 61,5090-5096(1993))。相反，CRIg通过捕捉穿过肝血窦内腔的病原体而实施直接作用(Helmy等,2006,见上文)。CRIg与CR3在结合特征中的差异部分反映了这两种受体在生物学中的差异。在KC上表达的CRIg组成性地结合单体C3片段，而CR3只结合iC3b调理的微粒(Helmy等,2006,见上文)。CRIg有效捕捉单体C3b和iC3b以及C3b/iC3b包被的微粒的能力反映了通过在巨噬细胞的膜延伸的尖端处集中的CRIg分子(Helmy等,2006,见上文)与病原体表面上存在的C3b和iC3b多聚体之间的多价相互作用而创建的升高的亲合力。虽然CR3只结合iC3b包被的微粒，但是 CRIg另外结合C3b，即在血清调理的病原体上形成的第一C3切割产物(Croize等,Infect Immun 61,5134-5139(1993))。既然结合至病原体表面的大量C3b分子受到保护免于因子H和I的切割(Gordon等,J Infect Dis 157,697-704(1988))，那么CRIg对C3b配体的识别确保了快速结合和清除。如此，虽然CRIg和CR3都在KC上表达，但是它们显示不同的配体特异性、独特的结合特性和独特的病原体清除动力学。
利用细胞表面受体来实现细胞进入的病原体的例子是病毒，像人免疫缺陷病毒(HIV)和细胞内细菌，像结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosum)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria Monocytogenes)，及寄生虫，像类前气门(prostigmatoid)硕大利什曼原虫(Leishmania major)(Cossart和Sansonetti,Science 304:242-248(2004)；Galan,Cell 103:363-366(2000)；Hornef等,Nat.Immunol.3:1033-1040(2002)；Stoiber等,Mol.Immunol.42:153-160(2005))。
如上文所讨论的，CRIg是一种最近发现的在一个驻留组织的巨噬细胞亚群上表达的补体C3受体。在发挥C3蛋白质的补体受体的功能之外，通过结合C3b及抑制C3和C5的蛋白水解活化，CRIg的胞外IgV结构域选择性抑制补体的旁路途径。然而，CRIg对转化酶亚基C3b的结合亲和力较低(IC50>1μM)，需要相对较高浓度的蛋白质来达到接近完全补体抑制。因而，需要具有改善的治疗功效的CRIg多肽。本发明提供此类多肽。
发明概述
本发明(至少部分地)基于具有增强的结合亲和力的CRIg变体的构建。带有组合氨基酸替代Q64R和M86Y的CRIg-ECD蛋白显示出比野生型CRIg变体提高30倍的结合亲和力和改善7倍的补体抑制活性。另外，在小鼠关节炎模型中用亲和力改善的CRIg融合蛋白处理导致临床得分与用野生型CRIg蛋白质处理相比显著降低。
因而，本发明关注CRIg变体。
一方面，本发明关注一种CRIg变体，其包含在选自下组的区域中的氨基酸替代：SEQ ID NO:2之氨基酸序列的E8-K15，R41-T47，S54-Q64，E85-Q99和Q105-K111。
在一个实施方案中，所述变体或其片段选择性结合C3b胜过C3。
在另一个实施方案中，所述变体具有提高的对C3b的结合亲和力胜过SEQ ID NO:2之天然序列人CRIg，其中所述结合亲和力可以例如提高至少2倍，或至少3倍，或至少4倍，或至少5倍，或至少6倍，或至少7倍，或至少9倍，或至少10倍，或至少15倍，或至少20倍，或至少30倍，或至少40倍，或至少50倍，或至少70倍，或至少80倍，或至少90倍，或至少100倍。
在还有一个实施方案中，所述变体是比SEQ ID NO:2之天然序列人CRIg更有力的旁路补体途径抑制剂。
在又一个实施方案中，所述变体包含在选自下组的一个或多个氨基酸位置处的氨基酸替代：SEQ ID NO:2之氨基酸序列中的位置8，14，18，42，44，45，60，64，86，99，105和110。
在还有一个实施方案中，所述变体包含在SEQ ID NO:2之氨基酸序列中的氨基酸位置60，64，86，99，105和110中一个或多个位置处的氨基酸替代。
在另一个实施方案中，所述变体包含选自下组的一处或多处替代：E8W，W14F，E84Y/W14F；P45F；G42D/D44H/P45F；Q60I；Q64R；Q60I/Q64R；M86Y；M86W，M86F，M86W/Q9R；M86F/Q99R；K110D，K11N；Q105R/K110N；Q105R/K110Q和Q105K/K110D。
在另一个实施方案中，所述变体包含选自下组的一处或多处替代：Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/E8Y；Q60I/Q64R/G42D；Q60I/Q64R/P45F；Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F；Q60I/Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/Q105R；Q60I/Q64R/Q105K；Q60I/Q64R/K110N；Q60I/Q105R/K110N；M86Y/E8Y；M86Y/G42D/D44H/P45F；M86Y/P45F；M86Y/G42D/D44H/P45F和M86Y/Q99K/M86Y/Q99R/M86Y/Q105R/M86Y/Q105K/M86Y/Q105R/K110N。
在还有一个实施方案中，所述变体包含选自下组的一处或多处替代：Q60I；Q64R；Q60I/Q64R；M86Y；Q99L；Q105K/K110D；E8W/Q105R/K110N；Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/E8Y；Q60I/Q64R/G42D；Q60I/Q64R/P45F；Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F；Q60I/Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/Q105R；Q60I/Q64R/Q105K；Q60I/Q64R/K110N；M86Y/P45F和M86Y/Q105K。
在一个更具体的实施方案中，所述变体包含Q60I/Q64R/M86Y或Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F替代。
另一方面，本发明关注一种嵌合分子，其包含上文定义的CRIg变体。
在一个实施方案中，所述嵌合分子是免疫粘附素。
在另一个实施方案中，所述免疫粘附素包含比SEQ ID NO:2之全长CRIg短的CRIg变体。
在还有一个实施方案中，所述嵌合分子包含CRIg胞外结构域。
又一方面，本发明关注一种药物组合物，其包含与药学可接受赋形剂混合的本发明CRIg变体或嵌合分子，例如免疫粘附素。
还有一方面，本发明关注一种用于预防或治疗补体相关疾病或状况的方法，包括对需要此类处理的受试者施用预防或治疗有效量的CRIg变体或包含此类变体的嵌合分子，诸如免疫粘附素。
在一个实施方案中，所述补体相关疾病是炎性疾病或自身免疫性疾病。
在另一个实施方案中，所述补体相关疾病选自下组：类风湿性关节炎(RA)，成人呼吸窘迫综合征(ARDS)，缺血和再灌注后远端组织损伤，心肺旁路手术期间补体活化，皮肌炎，天疱疮，狼疮肾炎及所致肾小球肾炎和血管炎，心肺旁路，心脏停搏诱导的冠状内皮功能障碍，II型膜性增生性肾小球肾炎，IgA肾病，急性肾衰竭，冷球蛋白血症，抗磷脂综合征，年龄相关黄斑变性，葡萄膜炎，糖尿病视网膜病，同种异基因移植，超急性排斥反应，血液透析，慢性阻塞性肺窘迫综合征(COPD)，哮喘，吸入性肺炎，荨麻疹，慢性特发性荨麻疹，溶血性尿毒症综合征，子宫内膜异位症，心源性休克，缺血再灌注损伤和多发性硬化(MS)。
在还有一个实施方案中，所述补体相关疾病选自下组：炎性肠病(IBD)，系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，青少年慢性关节炎，脊椎关节病，系统性硬化(硬皮病)，特发性炎性肌病(皮肌炎，多肌炎)，斯耶格伦氏综合征，系统性血管炎，结节病，自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少，阵发性睡眠性血红蛋白尿)，自身免疫性血小板减少(特发性血小板减少性紫癜，免疫介导的血小板减少)，甲状腺炎(格雷夫斯氏病，桥本氏甲状腺炎，青少年淋巴细胞性甲状腺炎，萎缩性甲状腺炎)，糖尿病，免疫介导的肾病(肾小球肾炎，小管间质性肾炎)，中枢和周围神经系统的脱髓鞘病诸如多发性硬化，特发性多神经病，肝胆病诸如传染性肝炎(甲型，乙型，丙型，丁型，戊型和其它非亲肝性病毒的肝炎)，自身免疫性慢性活动性肝炎，原发性胆汁性肝硬化，肉芽肿性肝炎和硬化性胆管炎，炎性和纤维化肺病(例如囊性纤维化病)，麸胶敏感性肠病，惠普尔氏病，自身免疫或免疫介导皮 肤病包括大疱性皮肤病，多形性红斑和接触性皮炎，银屑病，肺的变应性疾病诸如嗜曙红细胞性肺炎，特发性肺纤维化和超敏感性肺炎，移植相关疾病包括移植物排斥，移植物抗宿主病，阿尔茨海默氏病，阵发性睡眠性血红蛋白尿，遗传性血管水肿，动脉粥样硬化和II型膜性增生性肾小球肾炎。
在一个优选的实施方案中，所述补体相关疾病是类风湿性关节炎(RA)。
在另一个优选的实施方案中，所述补体相关疾病是补体相关眼状况。
在又一个实施方案中，所述补体相关眼状况选自下组：所有阶段的年龄相关黄斑变性(AMD)，葡萄膜炎，糖尿病性和其它缺血相关视网膜病，眼内炎和其它眼内新血管疾病。
在还有一个实施方案中，所述眼内新血管疾病选自下组：糖尿病黄斑水肿，病理性近视，von Hippel-Lindau病，眼的组织胞浆菌病，视网膜中央静脉阻塞(CRVO)，角膜新生血管形成和视网膜新生血管形成。
在还有一个实施方案中，所述补体相关眼状况选自下组：年龄相关黄斑变性(AMD)，脉络膜新生血管形成(CNV)，糖尿病视网膜病(DR)和眼内炎，其中AMD包括湿性和干性或萎缩性AMD。
在一个实施方案中，所述患者是哺乳动物，优选人。
另一方面，本发明关注一种用于在哺乳动物中抑制C3b变体片段生成的方法，包括对所述哺乳动物施用有效量的本发明CRIg变体或包含此类变体的免疫粘附素。
还有一方面，本发明关注一种用于在哺乳动物中选择性抑制旁路补体途径的方法，包括对所述哺乳动物施用有效量的本发明CRIg变体或包含此类变体的免疫粘附素。
附图简述
图1A-1B显示了399个氨基酸的全长形式的天然人CRIg(huCRIg)的核苷酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID NO:1和2)。
图2A-2B显示了305个氨基酸的短形式的天然人CRIg(huCRIg-短)的核苷酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID NO:3和4)。
图3A-3C显示了280个氨基酸的天然鼠CRIg(muCRIg)的核苷酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID NO:5和6)。
图4：CRIg突变体在结合测定法和抑制测定法中的活性。作为C3b的竞 争性置换测量CRIg的结合亲和力(A)，而通过溶血抑制测定法测量生物学活性。PUR10680是野生型对照(红色)，RIL 41(蓝色)和RL41(绿色)是两种突变体(B)。(C)CRIg结合界面的逐步优化。
图5：竞争性ELISA与溶血测定法之间的相关性。
图6：CRIg突变体Q64R/M86Y通过Biacore分析显示出改善的结合亲和力。(A)通过在包被的CRIg wt和CRIg Q64R M86Y蛋白质上注射渐增浓度的C3b产生的SPR传感图。(B)对结合数据的稳态分析指示Q64R/M86Y突变体和野生型CRIg的Kd为0.2微摩尔和1.1微摩尔。
图7：亲和力改善的CRIg保留对C3b的选择性。对纯化的C3和C3b利用α筛选竞争性测定法。
图8：CRIg Q64R M86Y与野生型CRIg相比改善的补体抑制效力。(A)使用家兔红血球和C1q消减的人血清使用旁路途径选择性溶血测定法比较野生型CRIg和CRIg Q46R M86Y的补体抑制。(B)用微孔板上包被的LPS和C1q消减的人血清使用基于ELISA的旁路途径测定法比较野生型CRIg和CRIg Q46R M86Y的补体抑制。
图9：CRIg Q64R M86Y在体内显示出胜过CRIg WT改善的功效。
(A)注射KRN血清并用各种浓度和型式的野生型和亲和力成熟的重组人和小鼠CRIg蛋白质处理的小鼠的临床得分。数据代表每组4-7只小鼠的均值。(B)来自血清转移后第6天的各只小鼠的临床得分的散布图。(C)血清转移后6天用CRIg wt或CRIg Q64R M86Y处理的小鼠的苏木精和曙红染色切片。(D)来自血清转移后6天用CRIg wt或CRIg Q64R M86Y处理的小鼠的组织学得分的散布图。
发明详述
I.定义
术语“CRIg”、“PRO362”、“JAM4”、和“STIgMA”可互换使用，指天然序列和变体CRIg多肽。
“天然序列”CRIg指与从自然界衍生的CRIg多肽具有相同氨基酸序列的多肽，不管其制剂形式。如此，天然序列CRIg可以从自然界分离，或者可以通过重组和/或合成手段生成。术语“天然序列CRIg”明确涵盖天然存在的截短或分泌形式的CRIg(例如胞外结构域序列)、CRIg的天然存在的变体形式 (例如可变剪接形式)和天然存在的等位变体。天然序列CRIg多肽明确包括SEQ ID NO:2的全长的长399个氨基酸的人CRIg多肽(huCRIg，图1A和1B所示)，含或不含N端信号序列，含或不含第1位处的起始甲硫氨酸，及含或不含SEQ ID NO:2大约第277-307位氨基酸处的任何或所有跨膜结构域。在又一个实施方案中，天然序列CRIg多肽是305个氨基酸的短形式的人CRIg(huCRIg-短(huCRIg-short)，SEQ ID NO:4，图2A和2B所示)，含或不含N端信号序列，含或不含第1位处的起始甲硫氨酸，及含或不含SEQ ID NO:4大约第183-213位处的任何或所有跨膜结构域。在一个不同的实施方案中，天然序列CRIg多肽是SEQ ID NO:6的长280个氨基酸的全长鼠CRIg多肽(muCRIg，图3A-3C所示)，含或不含N端信号序列，含或不含第1位处的起始甲硫氨酸，及含或不含SEQ ID NO:6大约第181-211位氨基酸处的任何或所有跨膜结构域。其它非人动物(包括高等灵长类和哺乳类)的CRIg多肽被明确包括在此定义内。
CRIg“胞外结构域”或“ECD”指CRIg多肽的基本上不含相应全长分子的跨膜和胞质结构域的一种形式。通常，CRIg ECD具有少于1％的此类跨膜和/或胞质结构域，而且优选具有少于0.5％的此类结构域。CRIg ECD可包含SEQ ID NO:2,4,或6的氨基酸残基1或约21至X，其中X是SEQ ID NO:2中约271至281的任何氨基酸、SEQ ID NO:4中约178至186的任何氨基酸、和SEQ ID NO:6中约176至184的任何氨基酸。
如本文中所使用的，术语“CRIg变体”指如下文所定义的天然CRIg多肽，其与天然序列CRIg多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性，包括但不限于全长huCRIg(SEQ ID NO:2)、huCRIg-short(SEQ ID NO:4)、和muCRIg(SEQ ID NO:6)，各自有或无N端起始甲硫氨酸，有或无N端信号序列，有或无整个或部分跨膜域及有或无胞内域。在一个具体的实施方案中，CRIg变体与来自序列SEQ ID NO:2之序列内的成熟的全长多肽具有至少约80％氨基酸序列同源性。在另一个实施方案中，CRIg变体与来自序列SEQ ID NO:4内的成熟的全长多肽具有至少约80％氨基酸序列同源性。在还有一个实施方案中，CRIg变体与来自序列SEQ ID NO:6内的成熟的全长多肽具有至少约80％氨基酸序列同源性。通常，CRIg变体会与来自SEQ ID NO:2，4，或6内的成熟氨基酸序列具有至少约80％氨基酸序列同一性，或至少约85％氨基酸序列同一性，或至少约90％氨基酸序列同一性，或至少约95％氨基酸序列同一性，或至少约 98％氨基酸序列同一性，或至少约99％氨基酸序列同一性。贯穿本说明书，包括实施例，术语“野生型”或“WT”指人CRIg的成熟全长短形式(CRIg(S))(SEQ ID NO:4)，而且CRIg变体中的氨基酸残基的编号方式指序列SEQ ID NO:4
本发明的CRIg变体是CRIg激动剂，如下文所定义的。具体而言，本文中的CRIg变体维持选择性结合C3b胜过C3，其中“选择性结合”用于指结合C3b且不结合C3。另外，在一个优选的实施方案中，本发明的CRIg变体具有相对于天然序列CRIg多肽，诸如CRIg的人长型(SEQ ID NO:2)提高的对C3b的结合亲和力。在各种实施方案中，相对于天然序列人CRIg多肽SEQ ID NO:2，结合亲和力的提高是至少约2倍，或至少约3倍，或至少约4倍，或至少约5倍，或至少约6倍，或至少约7倍，或至少约8倍，或至少约9倍，或至少约10倍，或至少约15倍，或至少约20倍，或至少约25倍，或至少约30倍，或至少约35倍，或至少约40倍，或至少约45倍，或至少约50倍，或至少约55倍，或至少约60倍，或至少约65倍，或至少约70倍，或至少约75倍，或至少约80倍，或至少约85倍，或至少约90倍，或至少约95倍，或至少约100倍。在其它实施方案中，相对于天然序列人CRIg多肽SEQ ID NO:2，对C3b的结合亲和力的提高是约5-10倍，或约5-15倍，或约5-20倍，或约5-25倍，或约5-25倍，或约5-30倍，或约5-35倍，或约5-40倍，或约5-45倍，或约5-50倍，或约5-55倍，或约5-60倍，或约5-65倍，或约5-70倍，或约5-75倍，或约5-80倍，或约5-85倍，或约5-90倍，或约5-95倍，或约5-100倍。
关于本文中CRIg变体的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，CRIg变体序列中与它们与之比较的天然CRIg序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。对于长度不同的序列，百分比序列同一性是相对于较长的序列，沿着较长序列的全长测定的。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于测量对比的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然后相对于较长的序列计算序列同一性，即，即使较短的序列显示与较长的序列一部分的100％序列同一性，整体序列同一性也会小于100％。
关于本文中鉴定的CRIg变体编码序列的“百分比(％)核酸序列同一性”定义为分别对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，候选序列中与CRIg变体编码序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分率。为测定百分比核酸序列同一性目的的对比可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于测量对比的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然后相对于较长的序列计算序列同一性，即，即使较短的序列显示与较长的序列一部分的100％序列同一性，整体序列同一性也会小于100％。
CRIg变体的定义中包括所有氨基酸序列变体，如上文所定义的，不管它们的鉴定或制备模式。具体而言，本文中包括通过替代、化学的、酶促的、或通过其它适宜手段用天然存在氨基酸以外的模块经过修饰的变体，只要它们保留天然序列CRIg的定性生物学特性。例示性的非天然存在氨基酸替代包括下文描述的那些。
氨基酸残基归入四大组：
酸性的：这种残基在生理pH由于丢失H离子而具有负电荷，而且当包含这种残基的肽在水溶液中时，该残基受水溶液吸引以寻找该肽的构造中的表面位置。
碱性的：这种残基在生理pH由于结合H离子而具有正电荷，而且当包含这种残基的肽在生理pH的水溶液中时，该残基受水溶液吸引以寻找该肽的构造中的表面位置。
中性的/非极性的：这种残基在生理pH不带电荷，而且当包含这种残基的肽在水性介质中时，该残基受水溶液排斥以寻找该肽的构造中的内部位置。这些残基也称作“疏水性残基”。
中性的/极性的：这种残基在生理pH不带电荷，但是当包含这种残基的肽在水性介质中时，该残基受水溶液吸引以寻找该肽的构造中的外部位置。
氨基酸残基可以关于它们的侧链基团进一步分类为环状的或非环状的，芳香族的或非芳香族的，这些指派对于熟练技术人员是平常的。
常常遇到的氨基酸不是由遗传密码编码的氨基酸，包括用于Glu和Asp的2-氨基己二酸(Aad)；用于Glu和Asp的2-氨基庚二酸(Apm)；用于Met，Leu和其它脂肪族氨基酸的2-氨基丁酸(Abu)；用于Met，Leu和其它脂肪族氨基 酸的2-氨基庚酸(Ahe)；用于Gly的2-氨基异丁酸(Aib)；用于Val和Leu和Ile的环己基丙氨酸(Cha)；用于Arg和Lys的高精氨酸(Har)；用于Lys，Arg和His的2,3-二氨基丙酸(Dpr)；用于Gly，Pro和Ala的N-乙基甘氨酸(EtGly)；用于Gly，Pro和Ala的N-乙基甘氨酸(EtGly)；用于Asn和Gln的N-乙基天冬酰胺(EtAsn)；用于Lys的羟赖氨酸(Hyl)；用于Lys的别羟赖氨酸(AHyl)；用于Pro，Ser和Thr的3(和4)-羟基脯氨酸(3Hyp，4Hyp)；用于Ile，Leu和Val的别异亮氨酸(AIle)；用于Ala的ρ-脒基苯丙氨酸；用于Gly，Pro和Ala的N-甲基甘氨酸(MeGly，肌氨酸)；用于Ile的N-甲基异亮氨酸(MeIle)；用于Met和其它脂肪族氨基酸的正缬氨酸(Nva)；用于Met和其它脂肪族氨基酸的正亮氨酸(Nle)；用于Lys，Arg和His的鸟氨酸(Orn)；用于Thr，Asn和Gln的瓜氨酸(Cit)和甲硫氨酸亚砜(MSO)；用于Phe的N-甲基苯丙氨酸(MePhe)，三甲基苯丙氨酸，卤代(F，Cl，Br和I)苯丙氨酸，三氟苯丙氨酸(triflourylphenylalanine)。
在用于本文时，术语“免疫粘附素”指将异源蛋白质(“粘附素”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定域的效应器功能联合起来的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包括不同于抗体的抗原识别和结合位点(即是“异源”的)、具有期望结合特异性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定域序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分典型的是至少包含受体或配体的结合位点的连续氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以从任何免疫球蛋白获得，诸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型，IgA(包括IgA-1和IgA-2)，IgE，IgD或IgM。
“治疗”或“处理”指有意预防病症的发生或改变病症的病理而实施的干预。因而，“治疗”指治疗性处理和预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者包括早就患有病症的受试者以及要预防病症的受试者。
如本文中所使用的，“改善”在本文中定义为使得更好或改进。
如本文中所使用的，术语“哺乳动物”指归为哺乳类的任何动物，包括但不限于人，非人灵长类，家畜和牲畜，及动物园中的动物、运动用动物或宠物动物，诸如马、猪、牛、犬、猫和雪貂等。在一个优选的实施方案中，哺乳动物指高等灵长类，最优选人。
术语“补体相关疾病”在本文中以最广义使用，包括其发病机制涉及补体系统激活异常的所有疾病和病理性状况，诸如例如补体缺陷。该术语明确包括受益于C3转变酶抑制的疾病和病理性状况。该术语另外包括受益于补体 旁路抑制，包括选择性抑制的疾病和病理性状况。补体相关疾病包括但不限于炎性疾病和自身免疫病，诸如例如类风湿性关节炎(RA)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、缺血和再灌注后的远端组织损伤(remote tissue injury)、心肺旁路手术过程中的补体激活、皮肌炎、天疱疮、狼疮肾炎及由此发生的肾小球肾炎和血管炎、心肺转流术、心脏停搏诱发的冠状内皮功能障碍、II型膜性增生性肾小球肾炎、IgA肾病、急性肾衰竭、冷球蛋白血症、抗磷脂综合征、年龄相关黄斑变性、葡萄膜炎、糖尿病性视网膜病变、同种移植、超急性排斥反应、血液透析、慢性阻塞性肺应激(distress)综合征(COPD)、哮喘、和吸入性肺炎。在一个优选的实施方案中，“补体相关疾病”指如下的疾病，其中补体旁路途径发挥突出的作用，包括类风湿性关节炎(RA)、补体相关眼状况诸如年龄相关黄斑变性、抗磷脂综合征、肠和肾缺血-再灌注损伤、和II型膜性增生性肾小球肾炎。
术语“补体相关眼状况”在本文中以最广义使用，包括其病理学涉及补体，包括补体的经典和备选路径，特别是旁路的所有眼状况和疾病。此组明确包括其发生、形成、或发展可通过抑制旁路来控制的与旁路有关的所有眼状况和疾病。补体相关眼状况包括但不限于黄斑变性病，诸如所有阶段的年龄相关黄斑变性(AMD)，包括干性和湿性(非渗出性和渗出性)形式、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性和其它缺血相关视网膜病变、眼内炎、和其它眼内新血管疾病，诸如糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、冯希-林二氏(von Hippel-Lindau)病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、和视网膜新血管形成。优选的一组补体相关眼状况包括年龄相关黄斑变性(AMD)，包括非渗出性(湿性)和渗出性(干性或萎缩性)AMD、脉络膜新血管形成(CNV)、糖尿病性视网膜病变(DR)、和眼内炎。
术语“炎性疾病”和“炎性病症”可互换使用，指其中哺乳动物免疫系统的成分引起、介导或以其它方式促成炎症应答(其促成该哺乳动物中发病)的疾病和病症。还包括其中炎症应答的降低对疾病的进展具有改善效果的疾病。此定义内包括免疫介导的炎性疾病，包括自身免疫性疾病。
术语“T细胞介导的”疾病指其中T细胞直接或间接介导或以其它方式促成哺乳动物发病的疾病。T细胞介导的疾病可能与细胞介导的效应、淋巴因子介导的效应等有关，甚至与B细胞有关的效应，如果B细胞得到刺激的话， 例如受到由T细胞分泌的淋巴因子的刺激。
免疫相关和炎性疾病的例子，其中有些是T细胞介导的，包括但不限于炎性肠病(IBD)、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼年型慢性关节炎、脊椎关节病、系统性硬化(硬皮病)、特发性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、斯耶格伦氏(Sjogren)综合征、系统性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症、阵发性夜间血红蛋白尿)、自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)、甲状腺炎(格雷夫斯氏(Graves)病、桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎、幼年型淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)、糖尿病、免疫介导的肾病(肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎)、中枢和周围神经系统的脱髓鞘病诸如多发性硬化、特发性多神经病、肝胆病诸如传染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、和硬化性胆管炎、炎性和纤维化肺病(例如囊性纤维化病)、麸胶敏感性肠病、惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介导的皮肤病包括大疱性皮肤病、多形红斑和接触性皮炎、银屑病、肺的变应性疾病诸如嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化和超敏感性肺炎、移植相关疾病包括移植物排斥、移植物抗宿主病、阿尔茨海默氏病、和动脉粥样硬化。
与一种或多种其它治疗剂“联合”施用包括同时(共同)施用和任何次序的序贯施用。
“有活性的”或“活性”在本发明CRIg多肽的变体的语境中指此类多肽保留天然或天然存在本发明多肽的生物学和/或免疫学活性的形式。一种优选的生物学活性指结合C3b和/或影响补体或补体活化，特别是抑制旁路补体途径和/或C3转化酶的能力。对C3转化酶的抑制可通过例如测量对胶原或抗体诱导的关节炎期间正常血清中C3转化的抑制或对关节炎关节中C3沉积的抑制来测量。
“生物学活性”在模拟CRIg生物学活性的多肽的语境中部分地指此类分子结合C3b和/或影响补体或补体活化，特别是抑制旁路补体途径和/或C3转化酶的能力。
术语CRIg“激动剂”以最广义使用，包括模拟天然序列CRIg多肽的定性生物学活性(如上文所定义的)的任何分子。
“可操作连接”指并置，使得各成分的正常功能能实施。如此，与控制 序列“可操作连接”的编码序列指一种配置，其中编码序列能在这些序列的控制下表达且其中相连接的DNA序列是毗邻的，而且在分泌前导的情况中是毗邻且处于可读状态的。例如，若前序列(presequence)或分泌前导(secretory leader)的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质(preprotein)，则它与该多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。连接可以通过在方便的限制性位点处的连接反应来实现。若没有此类位点，则依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。
“表达系统”指如下的DNA序列，其含有可操作连接的期望的编码序列和控制序列，使得用这些序列转化的宿主能够生成所编码的蛋白质。为了实现转化，表达系统可以包括在载体上；然而，然后可以将有关DNA整合入宿主染色体中。
在用于本文时，“细胞”、“细胞系”、和“细胞培养物”可互换使用，而且所有这类名称都包括后代。如此，“转化子/转化体”或“转化细胞”包括原代受试细胞及由其衍生的培养物，不管转移的次数。还应理解，因为可发生有意的或无意的突变，所有后代可能在DNA内容上不是精确相同的。在最初转化细胞中筛选的具有相同功能性的突变后代包括在内。若想做出不同的命名，上下文会有清楚的表述。
“质粒”以居前的小写字母“p”和/或跟随的大写字母和/或数字指派。本文中的起始质粒是商品化的，是公众可不受限制获得的，或者能依照已发表的规程自此类可得质粒来构建。另外，其它等同的质粒是本领域已知的且对于普通技术人员是显而易见的。
“噬菌体展示文库”指作为与噬菌体外壳蛋白的融合物表达所克隆的蛋白质序列的集合的蛋白质表达文库。如此，短语“噬菌体展示文库”在本文中指噬菌体(例如丝状噬菌体)集合，其中噬菌体表达外部(通常是异源的)蛋白质。外部蛋白质不与噬菌体所接触的其它模块相互作用(结合)。每个展示外部蛋白质的噬菌体是噬菌体展示文库的一个成员。
术语“丝状噬菌体”指能够在其表面上展示异源多肽的病毒颗粒，而且包括但不限于f1、fd、Pf1、和M13。丝状噬菌体可包含选择标志，诸如四环素(例如“fd-tet”)。多种丝状噬菌体展示系统对于本领域技术人员是众所周知的(参见例如Zacher等,Gene,9:127-140(1980)；Smith等,Science,228:1315-1317(1985)；及Parmley和Smith,Gene,73:305-318(1988))。
术语“淘选”用于指鉴定和分离携带如下化合物(诸如抗体)的噬菌体的多轮筛选过程，所述化合物对靶物具有高亲和力和特异性。
短语“保守的氨基酸残基”用于指在彼此比对的两种或更多种氨基酸序列之间相同的氨基酸残基。
II.详细描述
补体是先天性和适应性免疫应答的一种重要成分，但是经由三种补体途径(经典，旁路和凝集素)中每一项的活化生成的补体拆分产物能引起炎症和组织破坏。如此，已经将适宜补体调节缺失所致不受控制的变体活化与多种慢性炎性疾病联系起来。此炎症级联中占控制权的是补体拆分产物C3a和C5a，它们经C3a和C5a受体发挥嗜中性粒细胞和炎性巨噬细胞化学引诱物和活化物的功能(Mollnes，T.E.，W.C.Song和J.D.Lambris.2002.Complement in inflammatory tissue damage and disease.Trends Immunol.23:61-64)。
CRIg是最近发现的一种补体受体，其在驻留组织的一种巨噬细胞亚群上表达。作为功能性受体，CRIg的细胞外IgV结构域是旁路补体途径的选择性抑制剂(Wiesmann et al.，Nature，444(7116):217-20，2006)。通过抑制关节中的旁路补体途径，可溶性形式的CRIg在关节炎的实验模型中显示出逆转炎症和骨丢失。还显示了旁路补体途径不仅是疾病诱导所需要的，而且还是疾病进展所需要的。如此，通过CRIg来抑制旁路途径构成一种有希望的治疗途径，用于预防和治疗其发病机制涉及旁路补体途径的疾病和病症。进一步的细节参见例如Helmy et al.，Cell，125(1):29-32(2006)和Katschke et al.，J.Exp Med204(6):1319-1325(2007)。
然而，CRIg对转化酶亚基C3b的亲和力较低(微摩尔范围)。为了生成更有力的抑制剂来开发治疗性试剂，使用与C3b复合的CRIg的晶体结构作为指导，而且我们采用噬菌体展示技术来生成具有改进的对C3b的结合亲和力的CRIg变体。
如此，本发明关注具有改进的特性，诸如改进的对C3b的结合亲和力和 增强的抑制功效的CRIg变体。
亲和力成熟的CRIg变体的鉴定
如实施例中极为详细描述的，蛋白质或肽文库的噬菌体展示为选择具有改进的对C3b的结合亲和力和/或其它改进的特性(诸如增强的生物学活性)的CRIg变体提供了一种有用的工具(Smith，G.P.，(1991)Curr.Opin.Biotechnol.2:668-673)。作为与M13基因III外壳蛋白的融合物以单价形式展示的高亲和力蛋白质(Clackson，T.，(1994)et al.，Trends Biotechnol.12:173-183)可通过多轮结合选择后噬菌粒颗粒中包装的相应DNA的克隆和测序来鉴定。
使用噬菌体展示进行的亲和力成熟已有记载，例如Lowman et al.，Biochemistry 30(45):10832-10838(1991)，还可参见Hawkins et al，J.Mol Biol.254:889-896(1992)，及下文实施例。不严格限于下列描述，这种工艺可简单描述如下：突变预定区域内的数个位点以生成每个位点处所有可能的氨基酸替代。作为与每个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物以单价形式自丝状噬菌体颗粒展示如此生成的抗体突变体。表达各种突变体的噬菌体可循环经历多轮结合选择，接着对那些展示高亲和力的突变体进行分离和测序。所述方法还记载于1998年5月12日公告的美国专利No.5,750,373。
一种涉及合并亲和力展示的改良规程记载于Cunningham，B.C.et al，EMBO J.13(11)，2508-2515(1994)。所述方法提供了一种用于选择新结合多肽的方法，包括：a)构建如下的可复制表达载体，其包含编码多肽的第一基因，编码天然或野生型噬菌体外壳蛋白至少一部分的第二基因(其中第一和第二基因是异源的)和与第一和第二基因可操作连接的转录调节元件，由此形成编码融合蛋白的基因融合物；b)在第一基因内的一个或多个选定位置处突变载体，由此形成一族相关质粒；c)用质粒转化合适的宿主细胞；d)用具有编码噬菌体外壳蛋白的基因的辅助噬菌体感染经过转化的宿主细胞；e)在适合于形成重组噬菌粒颗粒(其含有噬菌粒的至少一部分且能够转化宿主)的条件下培养经过转化，经过感染的宿主细胞，调整条件，使得不超过极小量的噬菌粒颗粒在颗粒表面上展示超过一个拷贝的融合蛋白；f)使噬菌粒颗粒与靶分子接触，使得噬菌粒颗粒的至少一部分结合靶分子；并g)将结合的噬菌粒颗粒与不结合的噬菌粒颗粒分开。优选的是，所述方法进一步包括用结合靶分子的重组噬菌粒颗粒转化合适的宿主细胞并重复步骤d)至g)一次或多次。
注意，虽然本发明的CRIg变体是使用噬菌体展示鉴定的，但是其它技术和其它展示技术也可用于鉴定具有改进的特性的CRIg变体，包括亲和力成熟的CRIg变体。
本发明的亲和力成熟的CRIg变体设计成覆盖CRIg与C3b之间的接触面，这使用美国申请公开号20080045697中披露的CRIg和C3b:CRIg复合物的晶体结构来鉴定。具体而言，如表1所示，文库1-5设计成分别覆盖SEQ ID NO:2之天然序列全长CRIg分子的残基E8-K15，R41-T47，S54-Q64，E85-Q99和Q105-K111。
在一个实施方案中，本文中的CRIg变体在选自下组的一个或多个氨基酸位置处含有氨基酸替代：SEQ ID NO:2之氨基酸序列的位置8，14，18，42，44，45，60，64，86，99，105和110。
表3中列出了本文中代表性的CRIg变体。
优选的是，替代是在SEQ ID NO:2之全长天然CRIg的氨基酸序列的氨基酸位置60，64，86，99，105和110中的一或多个位置处。
不是限制，亲和力成熟的CRIg变体具体包括SEQ ID NO:2内的一处或多处下列替代：E8W，W14F，E84Y/W14F；P45F；G42D/D44H/P45F；Q60I；Q64R；Q60I/Q64R；M86Y；M86W，M86F，M86W/Q9R；M86F/Q99R；K110D，K11N；Q105R/K110N；Q105R/K110Q；Q105K/K110D。
表3中显示了SEQ ID NO:2之天然序列CRIg具有两处或更多处氨基酸替代的其它变体。这组内具体包括Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/E8Y；Q60I/Q64R/G42D；Q60I/Q64R/P45F；Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F；Q60I/Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/Q105R；Q60I/Q64R/Q105K；Q60I/Q64R/K110N；Q60I/Q105R/K110N；M86Y/E8Y；M86Y/G42D/D44H/P45F；M86Y/P45F；M86Y/G42D/D44H/P45F；M86Y/Q99K/M86Y/Q99R/M86Y/Q105R/M86Y/Q105K/M86Y/Q105R/K110N。
本文中优选的CRIg变体包含选自下组的突变：Q60I；Q64R；Q60I/Q64R；M86Y；Q99L；Q105K/K110D；E8W/Q105R/K110N；Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/E8Y；Q60I/Q64R/G42D；Q60I/Q64R/P45F；Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F；Q60I/Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/Q105R；Q60I/Q64R/Q105K；Q60I/Q64R/K110N；M86Y/P45F；M86Y/Q105K。
特别优选的变体包含突变Q60I/Q64R/M86Y或 Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F。
本文中具体包括含有上文或表3和表4中所列一处或多处突变但其它方面保留SEQ ID NO:2之天然CRIg序列的变体。此类变体在本文中会通过在“CRIg”前面列出具体突变来命名。如此，例如只因突变E8W而与SEQ ID NO:2之天然序列CRIg不同的变体会命名为“E8W CRIg”，只因突变Q60I/Q64R/M86Y而与SEQ ID NO:2之天然序列CRIg不同的变体会命名为“Q60I/Q64R/M86Y CRIg”，等。
CRIg变体的制备
有多种技术可被采用来生成能编码蛋白质的DNA，用于重组合成本发明的CRIg变体。例如，有可能基于天然存在DNA序列来衍生编码所得蛋白质氨基酸序列中变化的DNA。这些突变的DNA可用于获得本发明的CRIg变体。简言之，这些技术涵盖获得编码天然CRIg多肽的基因，通过重组技术(诸如下文讨论的那些)修改基因，将基因插入适宜的表达载体，将载体插入适宜的宿主细胞，培养宿主细胞以引起期望CRIg变体表达，及纯化由此生成的分子。
略微更具体的说，通过DNA序列的合成构建获得编码本发明CRIg变体的DNA序列，如标准教科书中所记载的，诸如例如Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning(第2版)，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.，(1989)。
a.寡核苷酸介导的诱变
寡核苷酸介导的诱变是用于制备天然CRIg多肽或其片段之替代，删除和插入变体的优选方法。这种技术是本领域公知的，记载于Zoller et al.，Nucleic Acids Res.10:6487-6504(1987)。简言之，编码起始多肽序列的核酸通过将编码期望突变的寡核苷酸与DNA模板杂交来改变，其中模板是含有未改变的或天然的编码核酸DNA序列的质粒的单链形式。杂交后，使用DNA聚合酶来合成完整的第二条模板互补链，这会如此掺入寡核苷酸引物，而且会编码起始核酸的选定改变。
通常，使用长度为至少25个核苷酸的寡核苷酸。最佳的寡核苷酸会在编码突变的核苷酸的任一侧具有12至15个与模板完全互补的核苷酸。这确保寡核苷酸会与单链DNA模板分子正确杂交。寡核苷酸易于使用本领域已知技术来合成，诸如记载于Crea et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA 75:5765(1978)。
如果使用噬菌体展示，只能用自噬菌体M13载体(普遍可得的M13mp18 和M13mpl9载体是合适的)，或含有单链噬菌体复制起点的那些载体(Viera et al.，Meth.Enzymol.153:3(1987))衍生的那些载体来生成DNA模板。如此，必须将要突变的DNA插入这些载体之一以生成单链模板。单链模板的生成记载于Sambrook et al.，见上文的4.21-4.41节。
为了改变天然DNA序列，在合适的杂交条件下将寡核苷酸与单链模板杂交。然后添加DNA聚合酶(通常是DNA聚合酶I的Klenow片段)来合成模板的互补链，使用寡核苷酸作为合成的引物。如此形成异源双链体分子，使得DNA的一条链编码突变型CRIg，而另一条链(原始链)编码天然的，未改变的CRIg序列。然后将此异源双链体分子转化入合适的宿主细胞，通常是原核生物，诸如大肠杆菌JM-101。培养细胞后，将它们涂布在琼脂糖板上并筛选，即使用用32磷酸根放射性标记的寡核苷酸引物来鉴定含有突变DNA的细菌菌落。
可以改良上文刚刚描述的方法，使得创建同源双链体分子，其中质粒的两条链都含有突变。改良如下：与上文所述将单链寡核苷酸单链模板退火。将三种脱氧核糖核苷酸即脱氧核糖腺苷(dATP)，脱氧核糖尿苷(dGTP)和脱氧核糖胸苷(dTTP)的混合物与称作dCTP-(aS)的改良硫代-脱氧核糖胞嘧啶(Amersham)组合。将此混合物添加至模板-寡核苷酸复合物。将DNA聚合酶添加至此混合物后，生成除了突变的碱基之外与模板相同的一条DNA链。另外，这条新的DNA链会含有dCTP-(aS)来代替dCTP，这有助于保护它免于限制性内切核酸酶消化。用适宜的限制酶在双链异源双链体的模板链中生成缺刻后，可以用ExoIII核酸酶或其它适宜的核酸酶消化模板链经过含有要诱变的位点的区域。然后终止反应以留下仅部分为单链的分子。然后在所有四种脱氧核糖核苷酸三磷酸，ATP和DNA连接酶存在下使用DNA聚合酶形成完整的双链DNA同源双链体。然后可如上所述将此同源双链体分子转化入合适的宿主细胞，诸如大肠杆菌JM101。
有超过一个氨基酸要替代的突变体可以以数种方式之一来生成。如果所述氨基酸在多肽链中位置靠近在一起，那么可以使用编码所有期望氨基酸替代的一条寡核苷酸同时突变它们。然而，如果所述氨基酸彼此的位置有些距离(相隔超过约10个氨基酸)，那么生成编码所有期望变化的单一寡核苷酸是更加可能的。改为可采用一种或两种备选方法。
在第一种方法中，为每一个要替代的氨基酸生成单独的寡核苷酸。然后 同时将寡核苷酸与单链DNA退火，而且自模板合成的第二条DNA链会编码所有期望氨基酸替代。备选方法涉及两轮或更多轮诱变以生成期望的突变体。第一轮如关于单突变所描述的：使用野生型DNA作为模板，并将编码第一处期望氨基酸替代的寡核苷酸与此模板退火，然后生成异源双链体DNA分子。第二轮诱变利用第一轮诱变中生成的突变DNA产物作为模板。如此，此模板早就含有一处或多处突变。然后将编码别的期望氨基酸替代的寡核苷酸与此模板退火，现在所得DNA链编码来自第一轮和第二轮二者诱变的突变。此所得DNA可在第三轮诱变中用作模板，以此类推。
b.盒式诱变
这种方法也是一种用于制备CRIg替代，删除和插入变体的优选方法。该方法基于Wells et al.Gene 34:315(1985)所述。起始材料是包含基因1(即要突变的基因)的质粒(或其它载体)。鉴定编码起始CRIg分子的核酸中要突变的密码子。所鉴定的突变位点的每一侧上必须有唯一的限制性内切核酸酶位点。如果没有此类限制性位点存在，那么可以生成它们，即使用上文描述的寡核苷酸介导的诱变方法在基因1中适宜位置处引入它们。将限制性位点引入质粒后，在这些位点处切割质粒以使之线性化。使用标准规程合成编码限制性位点之间DNA序列但含有期望突变的双链寡核苷酸。分开合成两条链，然后使用标准技术杂交在一起。此双链寡核苷酸称作盒。此盒设计成具有与线性化质粒的末端相容的3'和5'末端，使得它能与质粒直接连接。此质粒现在含有突变的CRIg DNA序列。
c.CRIg变体的重组生产
然后将编码变体的DNA插入适宜的质粒或载体。使用载体来转化宿主细胞。一般而言，含有自与宿主细胞相容的物种衍生的复制和控制序列的质粒载体与那些宿主联合使用。载体通常携带复制位点，以及编码能够在转化细胞中提供表型选择的蛋白质的序列。
例如，可以使用pBR322，一种自大肠杆菌物种衍生的质粒(Mandel，M.et al.，(1970)J.Mol.Biol.53:154)来转化大肠杆菌。质粒pBR322含有氨苄青霉素和四环素抗性的基因，并因此提供容易的选择手段。其它载体包括不同特征，诸如不同启动子，它们在表达中常常是重要的。例如，质粒pKK223-3，pDR720和pPL-λ代表当前可得的具有tac，trp，或PL启动子的表达载体(Pharmacia Biotechnology)。
其它优选的载体可使用标准技术通过组合本文所述载体的有关特性来构建。载体的有关特性包括启动子，核糖体结合位点，变体基因或基因融合物，信号序列，抗生素抗性标志物，拷贝数和适宜的复制起点。
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括原核生物、酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌或大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、和志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，尽管其它菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC27,325)也是合适的。这些例子是例示性的，而不是限制性的。
在原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常用的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。然而，通常可获得许多其它属、种和菌株且可用于本发明，诸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)和丝状真菌，诸如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲 霉(A.niger)。
适于表达糖基化抗体的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕(Bombyx mori)NPV的Bm-5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。还可利用棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物作为宿主。
然而，脊椎动物细胞得到最多关注，而且培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7,ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham等,J.Gen Virol.,36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980))；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1,ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2,HB8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562,ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68(1982)；MRC5细胞；FS4细胞和人肝瘤系(Hep G2)。
用上文所述用于生产本文中CRIg变体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当更改的常规营养培养基中进行培养。
可以在多种培养基中培养用于生产本发明CRIg变体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM,Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM,Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham等,Meth.Enz.58:44(1979)；Barnes等,Anal.Biochem.102:255(1980)；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或再版美国专利30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以本领域技术人员知道的适宜浓度包含任何其它必需补充物。培养条件，诸如温度、pH等，就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。
在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成CRIg变体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成CRIg变体，那么作为第一步，通过例如离心或超滤除去宿主细胞或裂解细胞的微粒碎片。如果将CRIg变体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。
可以通过已知技术使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和/或亲和层析来纯化由细胞制备的CRIg变体，优选的纯化技术是亲和层析。
CRIg变体的其它修饰
本发明的CRIg变体还可以以如下的方式修饰，以形成包含融合至另一异源多肽或氨基酸序列的CRIg变体(包括其片段)的嵌合分子。在一个实施方案中，此类嵌合分子包括带有标签多肽的CRIg变体或其片段的融合物，所述标签多肽提供了抗标签抗体可选择性结合的表位。表位标签通常位于变体CRIg多肽的氨基或羧基末端。此类表位标记形式的CRIg变体的存在可使用针对所述标签多肽的抗体来检测。而且，表位标签的提供使CRIg多肽易于使用抗标签抗体或另一类结合所述表位标签的亲和基质通过亲和纯化来纯化。多种标签多肽及其各自抗体是本领域公知的。例子包括多组氨酸(poly-his)或多-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；流感HA标签多肽及其抗体12CA5[Field et al.，Mol.Cell.Biol.，8:2159-2165(1988)]；c-myc标签及其抗体8F9，3C7，6E10，G4，B7和9E10抗体(Evan et al.，Molecular and Cellular Biology，5:3610-3616(1985))；及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky et al.，Protein Engineering，3(6):547-553(1990))。其它标签多肽包括Flag肽(Hopp et al.，BioTechnology，6:1204-1210(1988))；KT3表位肽(Martin et al.，Science，255:192-194(1992))；quadrature-微管蛋白表位肽[Skinner et al.，J.Biol.Chem.，266:15163-15166(1991)]；及T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87:6393-6397(1990))。
在另一个实施方案中，嵌合分子可包括CRIg变体或其片段与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区的融合物。对于二价形式的嵌合分子，此类融合可以是对IgG分子的Fc区。这些融合多肽是将异源蛋白质(“粘附素”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定域的效应器功能联合起来的抗体样分子，而且常常称作免疫粘附素。在结构上，免疫粘附素包括不同于抗体的抗原识别和结合位点(即是“异源”的)，具有期望结合特异性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定域序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素分子通常是至少包含受体或配体之结合位点的连续氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以从任何免疫球蛋白获得，诸如IgG-1，IgG-2，IgG-3，或IgG-4亚型，IgA(包括IgA-1和IgA-2)，IgE，IgD或IgM。
最简单且最直接的免疫粘附素设计将“粘附素”蛋白质的结合区与免疫球蛋白重链的铰链和Fc区组合在一起。通常，在制备本发明的CRIg-免疫球蛋白嵌合物时，将编码CRIg细胞外结构域的核酸融合在编码免疫球蛋白恒定域序列N-末端的核酸的C-末端，然而N-末端融合也是可能的。
通常，在此类融合物中，所编码的嵌合多肽将至少保留有功能活性的免疫球蛋白重链恒定区铰链和CH2和CH3结构域。还可以对恒定域Fc部分的C-末端进行融合，或者紧挨着重链CH1或轻链对应区的N-末端进行。
进行融合的精确位点不是至关重要的；具体位点是众所周知的，而且可以进行选择以优化CRIg-免疫球蛋白嵌合物的生物学活性，分泌或结合特征。
在一些实施方案中，将CRIg-免疫球蛋白嵌合物装配成单体，或异多聚体或同多聚体，特别是二聚体或四聚体，基本上如WO 91/08298中所例示的。
在一个优选的实施方案中，将CRIg细胞外结构域序列融合至含有免疫球蛋白(例如免疫球蛋白G.sub.1(IgG 1))效应器功能的抗体C端部分(特别是Fc域)的N-末端。有可能将整个重链恒定区融合至CRIg细胞外结构域序列。然而，更优选的是，在融合中使用在铰链区中正好在木瓜蛋白酶切割位点(其在化学上限定IgG Fc；残基216，以重链恒定区的第一个残基或其它免疫球蛋白的类似位点为114)上游起始的序列。在一个特别优选的实施方案中， 将CRIg氨基酸序列融合至IgG1，IgG2，或IgG3重链的铰链区和CH2和CH3或与CH1，铰链，CH2和CH3结构域。进行融合的精确位点不是至关重要的，而且可以通过例行实验来确定最佳位点。
在一些实施方案中，将CRIg-免疫球蛋白嵌合物装配成多聚体，特别是同二聚体或同四聚体。一般而言，这些装配好的免疫球蛋白将具有已知的单元结构。基本的四链结构单元就是IgG，IgD和IgE存在的形式。四链单元在更高分子量的免疫球蛋白中重复；IgM一般作为通过二硫键保持在一起的基本四链单元的五聚体存在。IgA球蛋白及偶尔的IgG球蛋白也可以以多聚体的形式存在于血清中。在多聚体的情况中，各个四链单元可以是相同的或不同的。
或者，可以将CRIg细胞外结构域序列插入免疫球蛋白重链与轻链序列之间，从而得到包含嵌合重链的免疫球蛋白。在该实施方案中，将CRIg序列融合在免疫球蛋白每个臂中的免疫球蛋白重链的3’端，或是在铰链与CH2结构域之间，或是在CH2与CH3结构域之间。类似的构建物已报道于Hoogenboom et al.，Mol.Immunol.，28:1027-1037(1991)。
尽管本发明的免疫粘附素中不需要存在免疫球蛋白轻链，然而可以存在免疫球蛋白轻链，或是与CRIg-免疫球蛋白重链融合多肽共价结合，或是直接与CRIg细胞外结构域融合。在前一种情况中，通常将编码免疫球蛋白轻链的DNA与编码CRIg-免疫球蛋白重链融合蛋白的DNA共表达。在分泌后，杂合重链与轻链将共价结合以提供包含两对二硫键相连的免疫球蛋白重链-轻链的免疫球蛋白样结构。适于制备此类结构的方法披露于例如1989年3月28日公告的美国专利No.4,816,567。
药物组合物
可施用本发明的CRIg变体来治疗其病理涉及旁路补体途径的疾病。
以冻干剂型或水溶液的形式，通过将具有期望纯度的活性分子与任选的药学可接受载体、赋形剂或稳定剂(《Remington's Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol,A.编，1980)混合来制备治疗用配制剂，供贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲 酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
还可以用脂转染或脂质体将多肽、抗体、或抗体片段投递到细胞中。在使用抗体片段时，优选特异性结合靶蛋白质的结合结构域的最小片段。例如，根据抗体的可变区序列，可以设计保留与靶蛋白质序列结合能力的肽分子。此类肽可以化学合成和/或通过重组DNA技术生成(参见例如Marasco et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，7889-7893[1993])。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选活性互补且彼此没有不利影响的那些。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合存在。
活性分子还可包载入例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶状药物投递系统(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或粗滴乳状液。此类技术披露于例如《Remington's Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol,A.编，1980。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当 胶囊化抗体在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换而形成分子间S-S键，那么可通过修饰巯基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定化。
治疗方法
作为它们抑制补体活化，特别是旁路补体途径的能力的结果，本发明的CRIg变体在补体相关疾病和病理状况的预防和/或治疗中找到应用。此类疾病和状况包括但不限于补体相关的，炎性的和自身免疫的疾病。
早先已经列出了本文中的CRIg变体所能针对的补体相关的，炎性的和免疫相关的疾病和病症的具体例子。
以下非限制性实施例例示了本发明的更多详情。
实施例1：亲和力成熟的CRIg变体的制备
材料和方法
材料：
材料—酶和M13-KO7辅助噬菌体(New England Biolabs)；Maxisorp免疫板(Nunc.Roskilde，Denmark)；96孔U底聚丙烯板(COSTAR；产品目录#3365)；96孔平底，非结合板(NUNC；产品目录#269620)；辣根过氧化物酶/抗M13抗体偶联物(Pharmacia)；3,3',5,5'-四甲基-联苯胺，H2O2过氧化物酶底物(TEB)(Kirkegaard and Perry Laboratories，Inc)；大肠杆菌XL1-blue和大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagene)；牛血清清蛋白(BSA)和Tween 20(Sigma)；Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)；家兔RBC(Colorado Serum Company；产品目录#CS1081)；明胶Veronal缓冲液(GVB)[100mL Veronal缓冲液(BioWhittaker；产品目录#12-624E)；明胶(牛皮肤B型；SIGMA；产品目录#G9391-100G)；C1q消减的血清(CompTech；产品目录#A300)；fH蛋白(Complement Technology；产品目录#A137)；抗FLAG-HRP，mAb，在50％甘油中，Sigma产品目录#A-85921.1mg/mL
噬菌体展示CRIg文库的构建
将编码CRIg的DNA片段连接入经XhoI和SpeI消化的噬菌粒载体(p3DvlzPDZ-gD)(Kunkel et al.，Methods Enzymol.154:367-382(1987))，作为野生型对照和设计CRIg变体的模板。然后，自CJ239大肠杆菌细胞(Kunkel et al.，1987，见上文)制备在每个靶定残基处具有TAA终止密码子的模板，供随机化用。使用一种软随机化策略来进行CRIg变体选择，其中通过使用定位寡核苷酸策略用偏向野生型核苷酸的70-10-10-10碱基混合物在选定位置处引入大约50％的突变率。在文库设计中：5＝50％A，10％G，10％C和10％T；6＝50％G，10％A，10％C和10％T；7＝50％C，10％A，10％G和10％T；8＝50％T，10％A，10％G和10％C。
设计了5个文库。
文库1中的BCR1，ATC CTG GAA GTG CAA 656(SEQ ID NO:7)AGTGTA ACA GGA CCT 866(SEQ ID NO:8)555 GGG GAT GTG AAT CTT(SEQ ID NO:9)；
文库2中的BCR2，AAG TGG CTG GTA CAA 768(SEQ ID NO:10)668TCA 657 775 688 577ATC TTT(SEQ ID NO:11)786 CGT 657 TCT TCT GGA GAC CAT(SEQ ID NO:12)；
文库3中的BCR3，TTT CTA CGT GAC TCT(SEQ ID NO:13)877 668 657757 588 756 756 678 555 TAC 756 GGC CGC CTG CAT GTVG(SEQ ID NO:14)；
文库4中的BCR4，CAA TTG AGC ACC CTG(SEQ ID NO:15)656 586657 GAC 768 AGC CAC TAC ACG TGT 656(SEQ ID NO:16)GTC ACC TGG756(SEQ ID NO:17)ACT CCT GAT GGC AAC(SEQ ID NO:18)；
文库5中的BCR5，ACT CCT GAT GGC AAC 756(SEQ ID NO:19)GTC688 768 657 555 ATT ACT GAG CTC CGT(SEQ ID NO:20)。
通过使用适宜密码子来引入相应突变，如上所述进行定点诱变以进行点突变，并通过序列来确认正确的克隆。
文库分选和筛选以选择CRIg变体：
将Maxisorp免疫板用C3b(5μg/ml)于4℃包被过夜并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)和0.05％(w/v)牛血清清蛋白(BSA)于室温封闭1小时。将噬菌体文库添加至C3b包被的板并于室温温育3小时。将板清洗10次并用50mM HCl洗脱结合的噬菌体并用等体积的1.0M Tris碱(pH7.5)中和。通过经大肠杆菌XL1-blue传代来扩增回收的噬菌体并用于别的结合选择轮次。5轮后，我们自每个文库选出12个克隆并以96孔形式在500μl补充有羧苄青霉素和M13-KO7辅助噬菌体的2YT肉汤中培养它们。按照设计的位置在经C3b、抗gD、BSA和无关 蛋白质包被的384孔板中直接添加2倍连续稀释的培养物上清液。测量结合亲和力以评估给出的噬菌体浓度，比抗gD显著更高地结合C3b但不结合BSA和无关蛋白质。我们将噬菌体浓度固定，以相同的形式自每个文库筛选出约200个克隆，并自每个文库选出24-48个显示出显著结合C3b胜过抗gD的克隆，然后对它们测序以进行分析。
竞争性噬菌体ELISA
为了评估结合亲和力，使用一种改良的噬菌体ELISA。将96孔微量滴定板用含2ug/ml 3Cb的50mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)于4C包被过夜。然后将板用PBS，0.5％BSA于室温封闭1小时。将展示CRIg变体的噬菌体在PBT缓冲液中连续稀释，并测量结合以评估给出饱和时的信号50％的噬菌体浓度。固定亚饱和浓度的噬菌体并与C3b的连续稀释液一起预温育2小时，然后将混合物转移至经C3b包被的测定板。温育15分钟后，将板用PBS，0.05％Tween 20清洗，并与辣根过氧化物酶/抗M13抗体偶联物(在PBT缓冲液中1:5000稀释)一起温育30分钟。将板清洗，用TMB底物显色，用1.0M H3PO4淬灭，并于450nm处以分光光度法读数。作为导致噬菌粒结合半最大值的竞争C3b的浓度来计算亲和力(Ic50)。
蛋白质纯化
将包含表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)的单菌落接种入30mL补充有50μg/mL羧苄青霉素的LB培养基(LB/carb培养基)并于37℃培养过夜。收获细菌，清洗，重悬浮，并接种入500mL LB/carb培养基。将培养物于37℃培养至对数生长中期(A 600＝0.8)。用0.4mM异丙基1-硫--D-吡喃半乳糖甘来诱导蛋白质表达，并将培养物于30℃培养24小时。通过以4000g离心15分钟来沉淀细菌，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗2次，并于-80℃冷冻8小时。将沉淀物重悬浮于50mL PBS，并通过穿过微流化仪加工或声处理设备来溶解细胞。用2ml NI-NTA琼脂糖和凝胶过滤来纯化CRIg变体蛋白。
mutCRIg-huFc液相竞争性结合ELISA：
将huCRIg(L)-LFH在PBS，pH 7.4中稀释至2ug/mL，并通过于4℃温育过夜(16-18小时)(25ul/孔)来包被到Maxisorp 384孔平底板(Nunc，Neptune，NJ)上。将板在清洗缓冲液(PBS，pH7.4，0.05％Tween 20)中清洗3次，并将50ul/孔封闭缓冲液(PBS，pH 7.4，0.5％BSA)添加至每个孔。让板封闭1-3小时；这次和所有后续温育在定轨摇床上于室温实施。在封闭步骤期间，将C3b (在Genentech纯化)在测定缓冲液(PBS pH7.4，0.5％BSA，0.05％Tween-20)中稀释至20nM，并将mutCRIg-huFc分子在测定缓冲液中连续稀释，浓度范围为20,000–0.34nM。然后将C3b与mutCRIg-huFc分子1:1混合并容许预温育0.5-1小时。将经过封闭的板清洗3次(如上所述)，并将C3b:mutCRIg-huFc复合物添加至反应板(25ul/孔)。温育1-2小时后，将ELISA板清洗3次(如上所述)，并通过添加抗人C3b抗体(克隆5F202，US Biological，Swampscott，MA；600ng/mL，25ul/孔)来检测板结合的C3b。将板温育1-2小时并清洗(如上所述)。然后添加(25ul/孔)1:2,000稀释的HRP偶联的抗鼠Fc IgG(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)，并将板温育1-2小时。最后一次清洗后，将25ul/孔TMB底物(Kirkegaard&Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)添加至ELISA板。大约8分钟后通过添加25ul/孔1.0M磷酸来终止显色。使用SpectraMax 250微量滴定板阅读仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)测定450nm和650nm处的吸光度。
补体活化测定法：
使用WieslabTM补体系统旁路途径试剂盒(Alpco Diagnostics，Salem，NH)来评估mutCRIg-Fc抑制补体活化的能力。以想要的终浓度2倍制备连续稀释的mutCRIg-Fc(400至0.2nM)和C1q缺陷的人血清(5％)(Complement Technology，Tyler，TX)，1:1混合，并在定轨摇床上以300RPM预温育5分钟，之后添加至经LPS包被的ELISA板(100ul/孔)。测定的其余部分遵循制造商的指令。简言之，将ELISA板中的样品于37℃温育60-70分钟，然后在清洗缓冲液(PBS，pH7.4，0.05％Tween 20)中清洗3次。将100ul/孔抗C5b-9偶联物添加至ELISA板。于室温温育30分钟后，如上所述清洗ELISA板，并添加100ul/孔底物，并将板于室温再温育30分钟。通过添加50ul/孔5mM EDTA来终止显色。使用MultiSkan Ascent微量滴定板阅读仪(Thermo Fisher Scientific，Milford，MA)来测定405nm处的吸光度。
溶血抑制测定法：
将家兔红血球(Colorado Serum Company，Denver，CO)用含有0.1％牛皮肤明胶(Sigma)的Veronal缓冲液(Sigma，St.Louis，MO)(GVB)清洗3次，每次清洗以1500rpm，于4℃离心10分钟。最后一个离心步骤后，将细胞以终浓度2x109个细胞/mL重悬浮于GVB。将在GVB中连续稀释的补体抑制剂以50μL/孔添加至96孔U底聚丙烯板(Costar，Cambridge，MA)，接着是20μL/孔在0.1M MgCl2/0.1M EGTA/GVB中1:2稀释的家兔红血球。通过添加30μL/孔用GVB1:3预稀释的C1q消减的血清(Complement Technology，Tyler，TX)来触发板中补体级联。将板以温和摇动于室温温育30分钟，之后用100μL/孔10mM EDTA/GVB终止反应。将板以1500rpm离心5分钟后，将上清液转移至透明平底无结合96孔板(Nunc，Neptune，NJ)并使用微量板阅读仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)于412nm读取光密度。
阿尔法筛选竞争性测定法：
使用组氨酸(镍螯合物)检测试剂盒(PerkinElmer，Waltham，MA)来评估突变型CRIg分子对C3的潜在交叉反应性。以想要的终浓度3倍制备连续稀释的人C3和C3b(3,000至0.7nM)，以及固定浓度的生物素化iC3b(30nM)，及突变型CRIg(mutCRIg)和野生型CRIg分子(15-60nM)，1:1:1混合，并在定轨摇床上以3000TPM于环境温度预温育30分钟。以想要的终浓度4倍制备链霉亲合素供体珠与镍螯合物受体珠(各0.1mg/mL)的1:1混合物并添加至反应。将反应板在定轨摇床上以3000rpm于环境温度避光温育60分钟。在微量板分析仪(PerkinElmer，Waltham，MA)上分析板。
表面等离振子共振
在A100设备(GE healthcare)上使用表面等离振子共振测量来测定C3b对突变型和野生型CRIg的亲和力。采用一种抗Fc捕捉形式，而且自平衡结合测量计算KD。使用抗muFc捕捉试剂盒(BR-1008-38)遵循制造商提供的指令准备传感器芯片。将突变型或野生型CRIg在运行缓冲液(10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，0.01％Tween-20)中稀释至1μg/mL并进行60μL注射，使得芯片表面的一个点捕捉约100RU的融合蛋白。记录在CRIg点上注射10分钟不同C3b浓度的溶液的传感图，减去含有捕捉抗体但没有CRIg的参照点的信号。为浓度范围4μM至15.6nM的C3b 2倍稀释系列获得数据，流速10μL/分，温度25℃。在结合循环间通过注射10mM Gly-HCl pH 1.730秒来再生表面。使用Biacore A100评估软件v1.1(Safsten et al.(2006)Anal.Biochem.353:181)的亲和力算法，使用每次C3b注射结束时获得的高台值来计算KD。
结果
噬菌体文库设计
我们使用与C3b复合的CRIg的晶体结构来设计靶文库。设计了5个文库 来覆盖CRIg与C3b之间的接触面(图4)。CRIg文库在单价噬菌体展示载体中构建成与g3p次要外壳蛋白的融合物(Zhang et al.，J Biol Chem 281(31):22299-311(2006))。我们通过诱变将终止密码子噬菌体噬菌粒的CRIg编码部分每个要随机化的残基处。然后使用每种含有终止密码子的构建物来生成噬菌体展示文库(见材料和方法)。使用“软随机化”策略来选择结合物以维持野生型序列偏爱，使得选定的位置只有50％的时间被突变。所有5个文库是以>1010种独立序列每个文库的平均多样性获得的(表1)。
用CRIg噬菌体文库选择
4轮结合选择后，我们自这5个文库获得了38个独特克隆(表2)。在文库1中，第15位赖氨酸得到保留。芳香族残基(即酪氨酸和色氨酸)替换第8位谷氨酸。第14位被亲本的色氨酸或同源的苯丙氨酸占据。在文库2中，我们对24个克隆测序，而且它们都揭示共有。第42位，第46位和第47位作为野生型得到保留。天冬酰胺，组氨酸和苯丙氨酸替换第43位，第44位和第45位处的野生型序列。在文库3中，我们随机化10个位置，而且序列在第54位，第55位，第56位，第57位，第58位，第61位，第62位和第63位处展现完全保守。异亮氨酸或赖氨酸占据第60位。在第64位，谷氨酰胺被精氨酸替换或得到保留。在文库4中，芳香族残基在第86位占优，而同源碱性残基，即精氨酸和赖氨酸在第99位占优。第85位，第87位和第95位也得到软随机化，但是表现为高度保守的。在文库5中，两种显著同源的碱性残基，即赖氨酸和精氨酸在第105位是优选的，胜过谷氨酰胺。带负电荷的残基即天冬氨酸或酸性氨基酸即天冬酰胺在第110位占优。
我们通过竞争性噬菌体ELISA评估了一些突变体的亲和力(数据未显示)，而且我们发现文库3中有如下的克隆，它们是比野生型CRIg好大约8倍的C3b结合物。
体外结合亲和力及体内生物学功效的测定
为了鉴定提高对C3b的结合亲和力和溶血抑制测定法中的功效的关键残基，通过掺入占优的单突变并将其它位置保持为野生型，或自第一代噬菌体文库选出2-3个通过噬菌体ELISA测定的高亲和力克隆，接着设计第二代CRIg变体来进行。为了精确测量我们的突变体的亲和力和功效，我们作为分离的蛋白质表达了所有变体。来自溶血抑制测定法的结果(表3)显示在溶血测定法中与野生型相比来自文库1的L12，来自文库3的L33和来自文库4的 L41显著提高功效4-10倍。来自文库3的L32显示与野生型CRIg相比改进10倍的IC50。数据还表明结合亲和力与来自基于细胞的测定法的功效没有关联。
突变体的组合
基于来自第二代文库的结果，我们设计了第三代突变体以进一步改进在溶血测定法中的功效和结合亲和力。我们选择3个最有生物学效力的突变体(L12-8W，L33-Q60I/L32-Q64R和L41-M86Y)和1个结合亲和力最高的突变体(L32-Q64R)作为模板。然后，我们将这些突变体与在第二代文库中获得的其它有生物学效力的克隆组合以测定提高溶血测定法中的功效和结合亲和力的最佳突变集。我们表达和纯化了CRIg变体，供详细的分析用。数据显示(表4)来自L12的组合突变体不改进抑制功效，而且甚至展示与亲本突变体相比较低的活性，尽管WL41和WL59突变体的结合亲和力高3-6倍。在来自L32的突变体内，RL41展现比野生型好1.8倍的结合亲和力和溶血测定法中好6倍的功效。所有来自L33组的突变体显示显著提高的结合亲和力；与野生型相比提高27-226倍，尽管溶血测定法中的功效没有显著提高。我们还注意到60I-64R和86Y涉及大多数亲和力改进的组合克隆。
CRIg Q64R M86Y突变体改进的结合亲和力和补体抑制活性
我们选择了在竞争性ELISA中具有最高亲和力的突变体Q64R M86Y(图4和表3)供进一步分析用。为了测定CRIg wt和CRIg Q64R M86Y对C3b的结合亲和力，对CRIg wt和CRIg Q64R M86Y实施了Biacore分析。CRIg Q64R M86Y的亲和力相对于野生型CRIg改进了5倍(图6)。先前的研究显示CRIg wt选择性结合C3b但不结合天然C3(Wiesman et al.，Nature，444(7116):217-20，2006)。因为诱变可改变这种选择性，所以我们在α筛选液相竞争性测定法中比较了CRIg Q64R M86Y对C3b与C3相比的亲和力。CRIg Q64R M86Y与可溶性C3b竞争，但不与可溶性C3竞争，指示诱变不改变CRIg对活性成分C3b的选择性(图7)。通过分析与C3b复合的CRIg Q64R M86Y的结构中的这些残基(数据未显示)，这种选择性得到了进一步确认。
为了测试对C3b改进的亲和力和保守的选择性是否转化成改进的功效，我们在对补体旁路途径选择性的基于红细胞的溶血测定法中测试了CRIg Q64R M86Y对CRIg wt。CRIg Q64R M86Y显示出与CRIg wt相比改进4倍的IC50(图8的A小图)。为了进一步证实针对旁路途径补体抑制的改进的功效，我们在对补体旁路途径选择性的基于LPS的测定法中比较了CRIg Q64R M86Y与CRIg wt的抑制活性。在此，CRIg显示出与野生型重组蛋白相比180倍的IC50改进。CRIg wt和CRIg Q64R M86Y不影响经由经典途径的补体活化。如此，CRIg-C3b结合界面中的两处氨基酸替代产生具有改进的结合亲和力和对不同旁路途径具有选择性的两种不同测定法中优良补体抑制活性的分子。
为了进一步确定提高的结合亲和力和功效是否转化成改进的治疗功效，我们在血清转移关节炎模型中比较了wt和Q64R M86Y型式的CRIg的保护效果。先前的研究显示了CRIg有力抑制胶原和抗体诱导的关节炎中的炎症和骨破坏(Katschke et al.，J.Exp Med 204(6):1319-1325(2007))。
在此，在免疫复合物介导的关节炎的第三种临床前模型中测试CRIg功效。类风湿性关节炎的一种自发性鼠模型(K/BxN)模拟人关节炎疾病的许多临床和组织学特征。第0天给小鼠注射自K/BxN小鼠获得的50微升血清。每天检查动物，并通过目视观察对疾病程度打分。第6天处死所有小鼠。
自第-1天开始在100ul无菌盐水中每天给小鼠皮下注射指定量的同种型对照或hCRIg-mIgG1或hCRIg-RL41-mIgG1重组蛋白。
监测和打分：
每只爪的得分。
0＝没有红斑和肿胀的证据
1＝限于足中段(跗骨)或踝的红斑和轻度肿胀
2＝自踝延伸至足中部的红斑和轻度肿胀
3＝自踝延伸至跖关节的红斑和中度肿胀
4＝涵盖踝，足和趾的红斑和重度肿胀
得分均值＝4只爪的得分之和。
疾病阶段，轻度(得分均值1-3)，中度(得分均值4-8)和重度疾病(得分均值9以上)。得分均值反映累及的关节数目。
在第6天，通过处死前麻醉下的心内穿刺采集血液样品。使用血清测量hCRIg-Fc融合蛋白的量。
收集关节供组织学评估用。
将来自KRN小鼠的血清转移入Balb/c接受者导致快速且强力的免疫应答，其特征为对称的关节炎症。关节炎诱导是由在关节中形成促炎性免疫复合物的抗葡萄糖-6-磷酸异构酶自身抗体介导的(Kouskoff，V.，Korganow， A.S.，Duchatelle，V.，Degott，C.，Benoist，C.，and Mathis，D.(1996).Organ-specific disease provoked by systemic autoimmunity.Cell 87，811-822)。关节炎的形成完全依赖于完整无缺的旁路补体途径和Fc受体功能，如旁路补体途径成分缺陷的小鼠中和常见Fc受体γ链缺陷的小鼠中没有疾病所显示的(Ji，H.，Ohmura，K.，Mahmood，U.，Lee，D.M.，Hofhuis，F.M.，Boackle，S.A.，Takahashi，K.，Holers，V.M.，Walport，M.，Gerard，C.，et al.(2002).Arthritis critically dependent on innate immune system players.Immunity 16，157-168)。由于疾病的快速发作和严重性，用CRIg wt-Fc融合蛋白处理只将关节炎得分降低22％(图9的A小图，B小图)。用CRIg Q64R M86Y处理显示关节炎得分降低66％。组织学检查显示，与用CRIg wt或对照融合蛋白处理的小鼠相比，用CRIg Q64R M86Y处理的小鼠中主要由嗜中性粒细胞和巨噬细胞组成的免疫细胞浸润显著降低(图9的C小图，D小图)。CRIg wt和CRIg Q64R M86Y的血清浓度是相似的，指示关节炎得分的差异不是由于CRIg wt与CRIg Q64R M86Y蛋白质的半衰期差异。如此，我们显示了CRIg对其靶物C3b提高的结合亲和力转化成显著改进的治疗功效。
在此通过述及明确地完整收录本说明书中所引用的所有专利和参考文献。
虽然已经参照具体实施方案描述了本发明，但是要理解，本发明不限于此类实施方案。相反，本发明意图覆盖所附权利要求的精神和范围内所包括的各种修改和等效方案。
本发明涉及下述各项。
1.一种CRIg变体，其包含在选自下组的区域中的氨基酸替代：SEQ ID NO:2之氨基酸序列的E8-K15，R41-T47，S54-Q64，E85-Q99和Q105-K111。
2.项1的变体或其片段，其选择性结合C3b胜过C3。
3.项1的变体，其具有提高的对C3b的结合亲和力胜过SEQ ID NO:2之天然序列人CRIg。
4.项3的变体，其中所述结合亲和力提高至少2倍。
5.项3的变体，其中所述结合亲和力提高至少5倍。
6.项3的变体，其中所述结合亲和力提高至少10倍。
7.项3的变体，其中所述结合亲和力提高至少90倍。
8.项1的变体，其是比SEQ ID NO:2之天然序列人CRIg更有力的旁路补体途径抑制剂。
9.项8的变体，其比SEQ ID NO:2之天然序列人CRIg更有力至少2倍。
10.项8的变体，其比SEQ ID NO:2之天然序列人CRIg更有力至少5倍。
11.项8的变体，其比SEQ ID NO:2之天然序列人CRIg更有力至少10倍。
12.项1的变体，其包含在选自下组的一个或多个氨基酸位置处的氨基酸替代：SEQ ID NO:2之氨基酸序列中的位置8，14，18，42，44，45，60，64，86，99，105和110。
13.项1的变体，其包含在SEQ ID NO:2之氨基酸序列中的氨基酸位置60，64，86，99，105和110中一个或多个位置处的氨基酸替代。
14.项1的变体，其包含选自下组的一处或多处替代：E8W，W14F，E84Y/W14F；P45F；G42D/D44H/P45F；Q60I；Q64R；Q60I/Q64R；M86Y；M86W，M86F，M86W/Q9R；M86F/Q99R；K110D，K11N；Q105R/K110N；Q105R/K110Q和Q105K/K110D。
15.项1的变体，其包含选自下组的一处或多处替代：Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/E8Y；Q60I/Q64R/G42D；Q60I/Q64R/P45F；Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F；Q60I/Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/Q105R；Q60I/Q64R/Q105K；Q60I/Q64R/K110N；Q60I/Q105R/K110N；M86Y/E8Y；M86Y/G42D/D44H/P45F；M86Y/P45F；M86Y/G42D/D44H/P45F和M86Y/Q99K/M86Y/Q99R/M86Y/Q105R/M86Y/Q105K/M86Y/Q105R/K110N。
16.项1的变体，其包含选自下组的一处或多处替代：Q60I；Q64R；Q60I/Q64R；M86Y；Q99L；Q105K/K110D；E8W/Q105R/K110N；Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/E8Y；Q60I/Q64R/G42D；Q60I/Q64R/P45F；Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F；Q60I/Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/Q105R；Q60I/Q64R/Q105K；Q60I/Q64R/K110N；M86Y/P45F和M86Y/Q105K。
17.项1的变体，其包含Q60I/Q64R/M86Y或Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F替代。
18.一种嵌合分子，其包含依照项1至17任一项的变体。
19.项18的嵌合分子，其是免疫粘附素。
20.项19的嵌合分子，其中所述CRIg变体比SEQ ID NO:2之全长CRIg短。
21.项20的嵌合分子，其包含CRIg胞外结构域。
22.一种药物组合物，其包含与药学可接受赋形剂混合的依照项1至17任一项的CRIg变体。
23.一种药物组合物，其包含与药学可接受赋形剂混合的依照项19的免疫粘附素。
24.一种用于预防或治疗补体相关疾病或状况的方法，包括对需要此类处理的受试者施用预防或治疗有效量的依照项1至17任一项的CRIg变体或包含此类变体的免疫粘附素。
25.项24的方法，其中所述补体相关疾病是炎性疾病或自身免疫性疾病。
26.项25的方法，其中所述补体相关疾病选自下组：类风湿性关节炎(RA)，成人呼吸窘迫综合征(ARDS)，缺血和再灌注后远端组织损伤，心肺旁路手术期间补体活化，皮肌炎，天疱疮，狼疮肾炎及所致肾小球肾炎和血管炎，心肺旁路，心脏停搏诱导的冠状内皮功能障碍，II型膜性增生性肾小球肾炎，IgA肾病，急性肾衰竭，冷球蛋白血症，抗磷脂综合征，年龄相关黄斑变性，葡萄膜炎，糖尿病视网膜病，同种异基因移植，超急性排斥反应，血液透析，慢性阻塞性肺窘迫综合征(COPD)，哮喘，吸入性肺炎，荨麻疹，慢性特发性荨麻疹，溶血性尿毒症综合征，子宫内膜异位症，心源性休克，缺血再灌注损伤和多发性硬化(MS)。
27.项25的方法，其中所述补体相关疾病选自下组：炎性肠病(IBD)，系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，青少年慢性关节炎，脊椎关节病，系统性硬化(硬皮病)，特发性炎性肌病(皮肌炎，多肌炎)，斯耶格伦氏综合征，系统性血管炎，结节病，自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少，阵发性睡眠性血红蛋白尿)，自身免疫性血小板减少(特发性血小板减少性紫癜，免疫介导的血小板减少)，甲状腺炎(格雷夫斯氏病，桥本氏甲状腺炎，青少年淋巴细胞性甲状腺炎，萎缩性甲状腺炎)，糖尿病，免疫介导的肾病(肾小球肾炎，小管间质性肾炎)，中枢和周围神经系统的脱髓鞘病诸如多发性硬化，特发性多神经病，肝胆病诸如传染性肝炎(甲型，乙型，丙型，丁型，戊型和其它非亲肝性病毒的肝炎)，自身免疫性慢性活动性肝炎，原发性胆汁性肝硬化，肉芽肿性肝炎和硬化性胆管炎，炎性和纤维化肺病(例如囊性纤维化病)，麸胶敏 感性肠病，惠普尔氏病，自身免疫或免疫介导皮肤病包括大疱性皮肤病，多形性红斑和接触性皮炎，银屑病，肺的变应性疾病诸如嗜曙红细胞性肺炎，特发性肺纤维化和超敏感性肺炎，移植相关疾病包括移植物排斥，移植物抗宿主病，阿尔茨海默氏病，阵发性睡眠性血红蛋白尿，遗传性血管水肿，动脉粥样硬化和II型膜性增生性肾小球肾炎。
28.项25的方法，其中所述补体相关疾病是类风湿性关节炎(RA)。
29.项25的方法，其中所述补体相关疾病是补体相关眼状况。
30.项29的方法，其中所述补体相关眼状况选自下组：所有阶段的年龄相关黄斑变性(AMD)，葡萄膜炎，糖尿病性和其它缺血相关视网膜病，眼内炎和其它眼内新血管疾病。
31.项30的方法，其中所述眼内新血管疾病选自下组：糖尿病黄斑水肿，病理性近视，von Hippel-Lindau病，眼的组织胞浆菌病，视网膜中央静脉阻塞(CRVO)，角膜新生血管形成和视网膜新生血管形成。
32.项29的方法，其中所述补体相关眼状况选自下组：年龄相关黄斑变性(AMD)，脉络膜新生血管形成(CNV)，糖尿病视网膜病(DR)和眼内炎。
33.项32的方法，其中所述AMD是湿性AMD。
34.项32的方法，其中所述AMD是干性或萎缩性AMD。
35.项24的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
36.项35的方法，其中所述哺乳动物是人。
37.一种用于在哺乳动物中抑制C3b变体片段生成的方法，包括对所述哺乳动物施用有效量的依照项1至17任一项的CRIg变体或包含所述变体的免疫粘附素。
38.一种用于在哺乳动物中选择性抑制旁路补体途径的方法，包括对所述哺乳动物施用有效量的依照项1至17任一项的CRIg变体或包含所述变体的免疫粘附素。
表1：噬菌体文库。设计了五个软随机化文库来覆盖CRIg与C3b之间的接触区。
表1：噬菌体文库
表2：较高亲和力CRIg my噬菌体展示的逐步生成。来自五个软随机化文库的选定CRIg抗C3b突变体。每组显示基于对C3b的结合亲和力自每个文库选出的克隆。序列以单字母氨基酸代码表示。每组比较各突变体与共有和亲本野生型(WT)序列。残基相应着色：蓝色–软随机化位置；灰色–未随机化；黄色–与野生型(WT)不同的选定的残基。表2以出现次序分别公开了SEQ ID NO:21-63和63-67。
表2：通过噬菌体展示逐步生成较高亲和力CRIG
表3：选定突变体的结合亲和力(通过竞争性ELISA测定)和体内溶血抑制的比较。结合亲和力或体内效力提高大于5倍的突变体标有黄色阴影。
表3
表4：第二代突变体的结合亲和力和体内溶血抑制的比较(亲本序列以灰色显示)。结合亲和力超出亲本突变体提高大于5倍的突变体以蓝色突出标示，结合亲和力提高大于90倍的突变体以黄色突出标示。类似地，体内效力比亲本序列大的突变体以橙色突出标示。
表4