川麦冬PCR鉴定试剂盒及鉴定方法.pdf

本发明公开了一种川麦冬PCR鉴定试剂盒及鉴定方法，所述试剂盒中的特异性引物为CM1和CM2：CM1：5'-GTTGGCATACCCCATGTTTT-3'，CM2：5'-CAGCAAGTCCAACACTAATG-3'；本发明提供了一种快速、准确鉴定川麦冬的方法，可以广泛应用于川麦冬中药选种育种、种植、采收储存、销售、临床应用各环节的品种鉴定，在鉴别中药真伪，打击伪品，加强中药质量监管，促进中药现代化发展方面具有重大意义。

权利要求书
1.  一种川麦冬PCR鉴定试剂盒，其特征在于所述试剂盒中的特异性引物为CM1和CM2：
CM1：5'-GTTGGCATACCCCATGTTTT-3'，
CM2：5'-CAGCAAGTCCAACACTAATG-3'。

2.  如权利要求1所述川麦冬PCR鉴定试剂盒，其特征在于所述的川麦冬PCR鉴定试剂盒的组成为：


3.  一种利用权利要求1所述川麦冬PCR鉴定试剂盒对川麦冬进行鉴定的方法，其特征在于所述方法为：
(1)模板DNA的提取和质量鉴定：提取供试品DNA作为PCR的模板；以电泳法检测模板DNA的质量，条带清晰无弥散的，即为符合PCR反应的模板DNA；
(2)PCR鉴定：利用川麦冬PCR鉴定试剂盒中的特异性引物CM1和CM2，进行PCR扩增：
PCR反应溶液：


将PCR反应溶液放入PCR自动扩增仪器中进行PCR扩增反应，反应程序设置为：94℃预变性3min，94℃变性15s，60～65℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸7min；
(3)PCR产物进行电泳检测：取出PCR扩增产物5μL与加样缓冲液1μL混合，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，在297bp处出现扩增条带的为川麦冬。

说明书川麦冬PCR鉴定试剂盒及鉴定方法
(一)技术领域
本发明涉及一种DNA分子鉴定方法，特别涉及中药川麦冬PCR鉴定试剂盒、特异性引物、模板及鉴定方法。
(二)背景技术
川麦冬(Ophiopogon japonicas)主产于四川省绵阳，是四川道地药材以及国家地理标志性产品，以块根入药，主要含有麦冬多糖、高异黄酮类等有效成分，临床上广泛应用于肺燥干咳、虚痨咳嗽、心烦失眠、心绞痛等症，疗效显著。川麦冬主产区目前种质资源混乱，大部分都是采用无性繁殖的方式进行麦冬种植，从而导致麦冬品种退化，如抗病能力减退，块根性状改变等。麦冬种质资源的混乱和退化导致了川麦冬药用价值和品质的下降。除了川麦冬外，麦冬主要品种包括药典记载的浙麦冬和湖北麦冬，以及药典记载外的以麦冬或野麦冬为名的沿阶草属18种和山麦冬属8种。我国麦冬类植物资源丰富，麦冬品种繁多，产地不一，各品种间的药效和价格差别较大，对麦冬主流产品川麦冬进行鉴定具有重要意义。川麦冬与其他麦冬品种的外观和性状相似，利用常规的中药鉴定方法较难进行鉴别。利用DNA分子鉴定方法能够解决川麦冬鉴别困难的问题，这种基于DNA序列的鉴定方法能够从基因水平上进行品种的甄别，具有准确、高效、重复性好的诸多优点，鉴定的结果不受样品产地、生长环境和来源的影响。
本发明提供的PCR检测法就是一种川麦冬的DNA分子鉴定方法，能够准确鉴定川麦冬。目前已有的对川麦冬做出准确鉴定的方法均为采用传统的中药鉴定手段，利用PCR检测法对川麦冬进行鉴定尚未见报道。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种能够准确鉴定中药川麦冬的PCR鉴定试剂盒和检测方法，包括PCR检测法关键试剂PCR引物、模板和PCR检测法的检测步骤。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种川麦冬PCR鉴定试剂盒，所述试剂盒中的特异性引物为CM1和CM2：
CM1：5'-GTTGGCATACCCCATGTTTT-3'(SEQ ID NO.2)
CM2：5'-CAGCAAGTCCAACACTAATG-3'(SEQ ID NO.3)。
进一步，所述的川麦冬PCR鉴定试剂盒的组成为：

本发明还涉及一种利用所述川麦冬PCR鉴定试剂盒对川麦冬进行鉴定的方法，所述方法为：
(1)模板DNA的提取和质量鉴定：采用常规提取法提取供试品DNA作为PCR的模板；以电泳法检测模板DNA的质量(检测方法同步骤(3))，条带清晰无弥散的，即为符合PCR反应的模板DNA；
(2)PCR鉴定：利用川麦冬PCR鉴定试剂盒中的特异性引物CM1和CM2，进行PCR扩增：
PCR反应溶液：


将PCR反应溶液放入PCR自动扩增仪器中进行PCR扩增反应，反应程序设置为：94℃预变性3min，94℃变性15s，60～65℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸7min；
(3)PCR产物进行电泳检测：取出PCR扩增产物(即扩增反应后的反应液)5μL与加样缓冲液1μL混合，用1.2％琼脂糖凝胶电泳(含0.5％溴化乙锭)检测扩增结果，在297bp处出现扩增条带的为川麦冬，在297bp处不出现扩增条带的不是川麦冬。
本发明所述川麦冬按照《中药大辞典》获取：川麦冬挖起后，剪下块根，洗净泥土，暴晒3～4天，堆通风处，使其反潮，蒸发水气，约3日，摊开再晒，如此反复2～3次。晒干后，除净须根杂质即可。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明根据凝胶电泳在297bp处有无扩增条带作为鉴定川麦冬的依据，可以检测单个或者混合麦冬DNA样品，检测准确、灵敏度高、操作简单、耗时短、重复性好；(2)利用川麦冬PCR鉴定试剂盒中引物CM1和CM2以及PCR反应溶液配方可以制造川麦冬鉴定试剂盒；(3)本发明提供了一种快速、准确鉴定川麦冬的方法，可以广泛应用于川麦冬中药选种育种、种植、采收储存、销售、临床应用各环节的品种鉴定，在鉴别中药真伪，打击伪品，加强中药质量监管，促进中药现代化发展方面具有重大意义。
(四)附图说明
图1为十四种供试品经PCR检测法鉴定后的电泳图，泳道1～14分别为川麦冬、湖北麦冬、浙麦冬、上海麦冬、蒜、小葱、洋葱、韭菜、黄精、吊兰、百合、万年青、浙贝母、白术，泳道M为marker。
图2为不同浓度的川麦冬经PCR检测法鉴定后的电泳图，泳道M为Marker，泳道1的川麦冬浓度为0.1ng/μL，泳道2的川麦冬浓度为1ng/μL，泳道3的川麦冬浓度为10ng/μL。
图3为混合样品经PCR检测法鉴定后的电泳图，泳道1为川麦冬、湖北麦冬和浙麦冬的DNA混合溶液，泳道2为湖北麦冬、浙麦冬的DNA混合溶液，泳道M为marker。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
1、川麦冬PCR检测法关键试剂PCR引物的获得
应用植物DNA快速提取试剂盒方法从湖北麦冬、川麦冬、浙麦冬中分别提取基因组DNA。使用RAPD扩增法对三种麦冬进行RAPD分析，筛选获得一条川麦冬特异性扩增条带，这条特异性扩增条带只出现在川麦冬品种中，在其他麦冬品种中没有，此条带中的DNA分子即是川麦冬特异性DNA分子标记。将川麦冬特异性DNA分子标记从琼脂糖凝胶中回收、克隆、测序，测序结果见SEQ ID NO.1所示，命名为CM503。
根据CM503序列，设计一对特异性引物CM1和CM2，引物序列为：
CM1：5'-GTTGGCATACCCCATGTTTT-3'，
CM2：5'-CAGCAAGTCCAACACTAATG-3'。
上下游引物选取的位点分别对应于CM503序列位点上的92～111和369～388。
SEQ ID NO.1为：
5’-AGCTTTTATATACCACCATATCAGTGTCTATGGACACACTTGACCATAGTTTGGCATATTGATAGATATGGACCCTTCTGACCATGTTTATGTTGGCATACCCCATGTTTTGGGATATGGACCATTTCTATACTGTTTTATGTGGATGTTTGACTCTACCACTCAGATATTTATTTATTCACCCTACGGATACCATGTTTACCCTTAGTGACTTGGTTTAGGGACATACCCTGATTACACCCTCTTTTATAGAACTGCTGATGCATGTTTCTTTATGCTTAGACATAGATGATAGATACTGGTTTGTCTTCACAAATGTACCCTCAACCTAGGACTGGGCCCTGCTCAGGTTCAAGGTGGGAGGAGGACATTAGTGTTGGACTTGCTGGCGTTTTGACGCAGTTGTTTTAATTCTTTTTCAGGTGGATTGATTCGCAGCGACAGTGTGCGACAGGGACAGGGTATATTACTTTATTTCTTAGACAGTTAGTCAGTACTCCATA-3’。
2、川麦冬的PCR检测法
(1)采用常规提取法提取供试品DNA作为PCR的模板；以电泳法(同步骤(3))检测模板DNA的质量，条带清晰无弥散的，即为符合PCR反应的模板DNA；
(2)按照CM1和CM2的序列用体外合成仪合成引物CM1和CM2。以CM1和CM2为引物进行PCR扩增。
按照下述配方配置PCR反应溶液：

将PCR反应溶液放入PCR自动扩增仪器中进行PCR扩增反应，反应程序设置为：
94℃预变性3min，94℃变性15s，60～65℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸7min。
(3)PCR产物进行电泳检测：取出PCR扩增后的反应液5μL与加样缓冲液1μL混合，用1.2％琼脂糖凝胶电泳(含0.5％溴化乙锭)检测扩增结果，在297bp处出现扩增条带的样品为川麦冬，在297bp处不出现条带的样品不是川麦冬。
实施例2：
1、川麦冬PCR检测法的准确性研究
从川麦冬、湖北麦冬、浙麦冬、上海麦冬、蒜、小葱、洋葱、韭菜、黄精、吊兰、百合、万年青、浙贝母、白术这14种植物中提取基因组DNA。以上述14种品种的基因组DNA为模板，利用特异性引物“CM1/CM2”进行PCR扩增，PCR反应液、扩增程序、检测方法同实施例1，只是更换DNA模板，以验证川麦冬PCR检测法的准确性和可靠性，结果见图1所示，泳道1～14分别为川麦冬、湖北麦冬、浙麦冬、上海麦冬、蒜、小葱、洋葱、韭菜、黄精、吊兰、百合、万年青、浙贝母、白术，泳道M为marker。
图1表明，川麦冬在297bp处具有特异性的扩增条带，而其他品种没有。本发明的川麦冬PCR检测法经实验证明可以用于川麦冬的鉴定，方法准确性高，简单、效率高、重复性好。
2、川麦冬PCR检测法的灵敏度研究
将原始川麦冬模板DNA浓度(100ng/μL)经三个梯度进行稀释，配置三份不同浓度的川麦冬基因组DNA溶液：一份浓度为原始川麦冬模板DNA浓度的10％，即10ng/μL；一份浓度为原始川麦冬模板 DNA浓度的1％，即1ng/μL；一份浓度为原始川麦冬模板DNA浓度的1‰，即0.1ng/μL。
分别以这三种不同浓度的川麦冬基因组DNA作为模板(1.2μL)，以“CM1/CM2”为引物进行PCR扩增，PCR反应液、扩增程序、检测方法同实施例1，以验证川麦冬PCR检测法的灵敏度，结果见图2所示，泳道M为Marker，泳道1为0.1ng/μL，泳道2为1ng/μL，泳道3为10ng/μL。
结果显示当川麦冬模板基因组DNA浓度为原始模板标准浓度的1‰，即含量仅为0.1ng时，在297bp处依然出现川麦冬的特异性条带，经过多次重复验证，结果保持稳定，证明本发明提供的川麦冬PCR检测法灵敏度很高，含量极微弱的川麦冬也能够鉴定出来。
3、川麦冬PCR检测法对混合样品的鉴定效果
配置两份不同的基因组DNA混合溶液：组1为川麦冬、浙麦冬、湖北麦冬的DNA混合溶液，三者等量加入，浓度各为原先浓度(100ng/μL)的三分之一；组2为湖北麦冬、浙麦冬的基因组DNA混合溶液，两者等量加入，浓度各为原先浓度(100ng/μL)的二分之一。
将这两份不同的DNA混合液分别作为模板，以“CM1/CM2”为引物进行PCR扩增，PCR反应液、扩增程序、检测方法同实施例1，以研究川麦冬PCR检测法对混合样品的鉴定效果。实验结果见图3，泳道M为Marker，泳道1为组1，泳道2为组2。
图3表明，组1加入川麦冬的混合样品经PCR检测后，结果显示在297bp处出现了明亮的条带。组2没有加入川麦冬的混合样品经PCR检测后，结果显示在297bp处没有出现扩增条带，川麦冬在三种麦冬的混合材料中被很好的鉴定了出来。经过多次重复验证，结 果保持稳定，这显示出本发明的川麦冬PCR检测法具有极高的准确性，能在混合药材样品中鉴定出川麦冬。实验证明这种方法不仅可以检测单个川麦冬样品，还可以在混合物中检测出川麦冬，应用范围较广。