一株地衣芽孢杆菌及其在降解高效氯氰菊酯中的应用.pdf

本发明公开了一株地衣芽孢杆菌，菌株名为BBCY-014，分类命名为：地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，已于2014年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9839。本发明的地衣芽孢杆菌，在实验室优化条件下对60mg/L浓度的高效氯氰菊酯降解率为95.10％；田间试验表明，对田间高效氯氰菊酯的残留，7d内的去除率达到90％以上。本发明的地衣芽孢杆菌具有降解农药高效氯氰菊酯的功能，地衣芽孢杆菌为益生菌，因此其菌悬液能直接用于受农药污染的菜园土壤生物修复，具有较好的修复效果，而且具有可持续、成本低的特点。

权利要求书
1.  一株地衣芽孢杆菌，其特征在于：菌株名为BBCY-014，分类命名为：地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，已于2014年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9839。

2.  权利要求1所述的地衣芽孢杆菌在降解高效氯氰菊酯中的应用。

3.  根据权利要求2所述的应用，其特征在于：具体应用时，培养地衣芽孢杆菌，制成菌悬液。

4.  根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述菌悬液是通过以下方法制备得到的：
将地衣芽孢杆菌接种于含100mg/L高效氯氰菊酯的改良LB培养液中，37℃、180r/min摇床培养至对数期，用无菌生理盐水在8000r/min、4℃条件下离心洗涤三次，重悬，调整细胞光密度OD600为1.0，即得；
所述含100mg/L高效氯氰菊酯的改良LB培养液是通过以下方法制备得到的：取(NH4)2SO41.5g，KH2PO40.5g，K2HPO41.5g，MgSO40.2g，NaCl 10.5g，胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5.0g，超纯水1000mL，混合混匀，调整pH至7.5，加入0.2％吐温80，100mg/L高效氯氰菊酯，即得。

说明书一株地衣芽孢杆菌及其在降解高效氯氰菊酯中的应用
技术领域
本发明涉及一株地衣芽孢杆菌，及其在降解高效氯氰菊酯中的应用。
背景技术
拟除虫菊酯类农药(Pyrethroid Insecticide)是一类模拟天然除虫菊素结构人工合成的高效低毒仿生型杀虫剂，以神经钠离子通道为作用靶标，具有用量低、药效高、杀虫谱广等优点。高效氯氰菊酯(Beta-cypermethrin)是拟除虫菊酯类杀虫剂中应用范围较广的农药之一，由氯氰菊酯的两对高效外消旋体混合物组成，其杀虫活性远高于氯氰菊酯，目前主要用于防治果蔬、茶叶、谷物等作物上的食叶或食果害虫，以及防治蚊蝇、牲畜寄生虫等。拟除虫菊酯类农药虽然低毒，使用剂量低，但随着频繁使用，有关该农药的残留问题及其危害性也日益暴露出来。已有研究显示，拟除虫菊酯类农药对某些有益昆虫及水生生物具有很高的毒性，对人体具有神经毒性、蓄积毒性及生殖毒性，高效氯氰菊酯已被美国环境保护局列为致癌物质，因此消除或减少农药残留是一大热点问题。生物降解是解决农药残留的新途径之一，目前对于降解高效氯氰菊酯的芽孢杆菌研究报道有限，且由于土壤环境复杂，菌种降解能力不能达到实验室水平，因此本研究不仅可以丰富高效氯氰菊酯降解菌群，而且为其在生物修复中的应用提供理论依据。
发明内容
针对上述现有技术，本发明通过富集培养、梯度驯化法筛选得到了一株地衣芽孢杆菌，其对高效氯氰菊酯的降解率可达95.10％。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一株地衣芽孢杆菌，菌株名为BBCY-014，分类命名为：地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，已于2014年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9839。
本发明的地衣芽孢杆菌BBCY-014菌株，于2014年3月10日采用富集培养、梯度驯化法分离于四川成都郫县菜园土壤，经16S rDNA鉴定为地衣芽孢杆菌，经对高效氯氰菊酯的生物降解实验研究，该菌在实验室优化条件下对60mg/L浓度的高效氯氰菊酯降解率为95.10％。
本发明所筛选到的地衣芽孢杆菌BBCY-014菌株有很强的生命活力，在环境的作用下具有产生各种酶的能力，兼有耐高温、耐酸碱等特性。其所产生的特异性酶与高效氯氰菊酯作用，使其酯键断裂，生成相应的中间产物，直到最后矿化。田间试验表明，地衣芽孢杆菌BBCY-014菌株对田间高效氯氰菊酯的残留，7d内的去除率达到90％以上。
本发明筛选的地衣芽孢杆菌BBCY-014新菌株具有降解农药高效氯氰菊酯的功能，地衣芽孢杆菌为益生菌，因此其菌悬液能直接用于受农药污染的菜园土壤生物修复，具有较好的修复效果，而且具有可持续、成本低的特点。
附图说明
一株地衣芽孢杆菌，菌株名为BBCY-014，分类命名为：地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，已于2014年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9839。保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实验1地衣芽孢杆菌BBCY-014在实验室条件下对高效氯氰菊酯的降解
①菌株保藏培养基：常规方法制作改良LB斜面[(NH4)2SO41.5g，KH2PO40.5g，K2HPO41.5g，MgSO40.2g，NaCl 10.5g，胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5.0g，超纯水1000mL，琼脂2％(w/v)，pH7.5，加入0.2％吐温80(w/v)]121℃灭菌20min后，加入一定体积高效氯氰菊酯母液配制为菌株保藏所需100mg/L浓度，以维持菌株降解能力。最后将培养的斜面菌苔置于20％的甘油管中-80℃下保藏。
②种子液/菌悬液的制备：将菌株接种于含100mg/L高效氯氰菊酯的改良LB培养液中[(NH4)2SO41.5g，KH2PO40.5g，K2HPO41.5g，MgSO40.2g，NaCl10.5g，胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5.0g，超纯水1000mL，pH7.5，加入0.2％吐温80(w/v)]，37℃摇床培养(180r/min)至对数期，用无菌生理盐水离心洗涤(8000r/min，4℃)三次，重悬，调整细胞光密度OD600约为1.0，制成种子液/菌悬液。
③液体培养基：(NH4)2SO41.5g，KH2PO40.5g，K2HPO41.5g，MgSO40.2g，NaCl 10.5g，胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5.0g，超纯水1000mL，pH7.5，加入0.2％吐温80(w/v)，高效氯氰菊酯浓度60mg/L，121℃灭菌20min。
配制如③液体培养基，高效氯氰菊酯浓度60mg/L，在无菌条件下添加按②种子液的制备方法制备的地衣芽孢杆菌BBCY-014菌悬液，接种量7.0％(v/v)，培养基初始pH7.5，液体培养基锥形瓶装液量为20mL/100mL，37℃摇床培养(180r/min)66h。
结果：66h后，高效氯氰菊酯浓度降为2.94mg/L，地衣芽孢杆菌BBCY-014的菌悬液对高效氯氰菊酯的降解率为95.10％。
实验2地衣芽孢杆菌BBCY-014在菜园土壤中对高效氯氰菊酯的降解
试验于2014年11月起在成都郫县红光镇某菜园，土壤作物为油白菜。土壤理化性质经测定为：砂质粘土，土壤pH6.7，有机质17.9g/kg，总氮含量2.3g/kg，总磷含量0.38g/kg。在菜园中划分4块面积约为10m2的土壤，其中两块土壤喷洒按实验1中②种子液的制备方法制备的菌悬液，菌悬液喷施量为4.5×108cfu/g。每天定时采土样，按5点采样法，用专用取土工具，取0～10cm地表土，一周后测定对照组(未喷施地衣芽孢杆菌菌悬液)和喷菌组(喷施地衣芽孢杆菌菌悬液)的高效氯氰菊酯的残留量，结果见表1，喷施菌悬液的土壤中高效氯氰菊酯残留浓度远远低于未喷菌的对照组，说明地衣芽孢杆菌BBCY-014能有效降解菜园土壤中的高效氯氰菊酯，对菜园土壤能起到生物修复的作用。
表1 菜园土壤修复过程中土壤中高效氯氰菊酯的残留量的变化