一种原位调节细菌纤维素结构的方法.pdf

本发明公开了一种原位调节细菌纤维素结构的方法。本方法所用细菌为木醋杆菌(Acetobacter xylinum)，具体步骤如下：在发酵培养基中加入羧甲基纤维素钠和碳酸钙，静态培养结束后，除去细菌及残留的发酵液，再用一定浓度的醋酸浸泡，最后用去离子水冲洗至中性即可。使用本方法制备的细菌纤维素孔径增大，持水量与复水率提高，同时本发明所述的胞外调控细菌纤维素结构的方法，具有原位调节、制备工艺简单、无毒、绿色环保等特点。

权利要求书
1.  一种原位调节细菌纤维素结构的方法，其特征在于，包括如下步骤：
第一步：木醋杆菌进行种子扩增培养；
第二步：发酵液中加入羧甲基纤维素钠及碳酸钙，灭菌，冷却至室温；
第三步：接种后，进行发酵静置培养；
第四步：发酵结束后，得到BC膜，除去残留的细胞及发酵液；
第五步：用浓度为20-100 g/L的醋酸浸泡BC膜，除去纤维孔洞间包埋的碳酸钙；
第六步：用去离子水冲洗BC膜，至中性即可。

2.  如权利要求1所述的原位调节细菌纤维素结构的方法，其特征在于，第一步中，种子液配方为：葡萄糖20 g/L、硫酸铵6 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、硫酸镁0.4 g/L、蛋白胨3 g/L、酵母浸粉2.25 g/L、羧甲基纤维素钠0.4 g/L。

3.  如权利要求1所述的原位调节细菌纤维素结构的方法，其特征在于，第二步中，发酵液配方为：葡萄糖22.5 g/L、蔗糖27.5 g/L、硫酸铵1 g/L、磷酸二氢钾5 g/L、硫酸镁0.7 g/L、乳酸钙0.2 g/L、 柠檬酸0.6 g/L、醋酸1.5 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉7.5 g/L；羧甲基纤维素钠在发酵液中的浓度为5-25 g/L，碳酸钙在发酵液中的浓度为1-10 g/L。

4.  如权利要求1所述的原位调节细菌纤维素结构的方法，其特征在于，第三步中，接种量为2-20%，在30℃条件下静态培养条件。

说明书一种原位调节细菌纤维素结构的方法
技术领域
本发明涉及一种原位调节细菌纤维素结构的方法，属于生物材料制备领域。
背景技术
细菌纤维素（Bacterial Cellulose，简称BC）是以木醋杆菌(Acetobacter xylinum)为代表的少数微生物合成分泌的一种胞外多糖，是一种天然形成的最细的纤维。由于其纯度高、结晶度高、持水量高、良好的三维结构、良好的生物相容性，使BC广泛用于制备生物医用材料，如慢性创伤敷料、种植牙、可再生软组织支架等，目前很多技术已实现商品化，使BC成为具有广阔应用前景的生物功能材料。
但对于一些特殊的医用材料，如植入式支架，用于BC表面纤维网络过于致密，细胞难以渗入材料中，细胞渗透进入支架的深度直接影响了组织的生长成形。目前已有文献报道(1Yin N, Stilwell M D, Santos T M A, et al. Agarose particle-templated porous bacterial cellulose and its application in cartilage growth in vitro. Acta biomaterialia, 2015, 12:129-138. 2Uraki Y, Nemoto J, Otsuka H, Tamai Y, Sugiyama J, Kishimoto T, et al. Honeycomb-like architecture produced by living bacteria Gluconacetobacter xylinus. Carbohydrate Polymers, 2007, 69:1–6. 3Zaborowska M, Bodin A, B?ckdahl H, Popp J, Goldstein A, Gatenholm P. Microporous bacterial cellulose as a potential scaffold for bone regeneration. Acta Biomater 2010;6:2540–7.)改变细菌纤维素孔结构的方法，但现有方法存在一定的缺陷，如：
1、发酵过程中加入固体石蜡，但固体石蜡不易去除，同时反复冲洗会破坏BC的三维结构；
2、发酵过程中加入淀粉颗粒，但淀粉颗粒会沉降在培养皿底部，不能被纤维素微纤丝包埋。
发明内容
本发明的目的是提供一种原位调节细菌纤维素结构的方法。
本发明的原理是：通过在发酵培养基中添加羧甲基纤维素钠及碳酸钙，碳酸钙是一种常见的无机化合物，几乎不溶于水，培养基含一定浓度的羧甲基纤维素钠能使碳酸钙在实验过程中保持悬浮状态，木醋杆菌在合成纤维素的过程中，将碳酸钙颗粒包裹进纤维素网络结构中，能较好地扩大BC的孔大小。同时木醋杆菌在发酵过程中会分泌酸性物质，使发酵环境pH下降，碳酸钙能与这类物质发生反应，维持发酵过程pH相对稳定，有利于代谢产物的积累。
实现本发明目的的技术解决方案为：一种原位调节细菌纤维素结构的方法，包括如下步骤：
第一步：木醋杆菌进行种子扩增培养；
第二步：发酵液中加入一定浓度的羧甲基纤维素钠及碳酸钙，灭菌，冷却至室温；
第三步：接种后，进行发酵静置培养；
第四步：发酵结束后，得到BC膜，除去残留的细胞及发酵液；
第五步：用浓度为20-100 g/L的醋酸浸泡BC膜，除去纤维孔洞间包埋的碳酸钙；
第六步：用去离子水冲洗BC膜，至中性即可。
第一步中，种子液配方为：葡萄糖20 g/L、硫酸铵6 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、硫酸镁0.4 g/L、蛋白胨3 g/L、酵母浸粉2.25 g/L、羧甲基纤维素钠0.4 g/L。
第二步中，发酵液配方为：葡萄糖22.5 g/L、蔗糖27.5 g/L、硫酸铵1 g/L、磷酸二氢钾5 g/L、硫酸镁0.7 g/L、乳酸钙0.2 g/L、 柠檬酸0.6 g/L、醋酸1.5 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉7.5 g/L；羧甲基纤维素钠在发酵液中的浓度为5-25 g/L，碳酸钙在发酵液中的浓度为1-10 g/L。
第三步中，接种量为2-20%，在30℃条件下静态培养条件。
本发明与现有技术相比其显著优点是：
1、发酵过程绿色环保，碳酸钙是常用的无机化合物，无毒无害，且颗粒尺寸大小分布均匀。
2、结构调节后的细菌纤维素后处理容易，直接用酸浸泡即可，不会对已经调节过的结构产生影响。
3、木醋杆菌在在发酵过程中会分泌酸性物质，碳酸钙能中和这些酸性物质，使环境pH维持在适宜的水平，有利于细菌纤维素的产生积累。
下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
附图说明
图1是胞外调节细菌纤维素结构的流程图。
图2是实施例1中使用的碳酸钙对应的粒径分布图。
图3是对比例结构未经调节的BC的扫描电镜图。
图4是实施例1结构经调节的BC的扫描电镜图。
具体实施方式
结合附图1，原位调节细菌纤维素结构的方法，步骤如下：
第一步：木醋杆菌进行种子扩增，摇床震荡培养，培养温度25-32℃，摇床转速90-250 rpm，培养时间6-72h；
第二步：发酵液配制时加入5-25 g/L 羧甲基纤维素钠；待羧甲基纤维素钠溶解完全后，加入1-10 g/L碳酸钙，115-121℃高温灭菌15-30 min后，冷却至室温；
第三步：木醋杆菌以2-20%的接种量进行接种（将第一步获得的种子液加入到第二步获得的发酵液中），接种后25-32℃静态培养；
第四步：发酵结束后，得到BC膜，用质量分数1-10 g/L的NaOH溶液和1-10 g/L的H2O2在70-100℃条件下处理0.5-3.0小时，除去残留的细胞及发酵液；
第五步：用浓度为20-100 g/L的醋酸浸泡BC膜，除去纤维素网络中包埋的碳酸钙；
第六步：用去离子水冲洗BC膜至中性。
在所有实施案例中，
种子液配方采用：葡萄糖22.5 g/L，蔗糖27.5 g/L，硫酸铵1 g/L，磷酸二氢钾5 g/L，硫酸镁0.7 g/L，乳酸钙0.2 g/L， 柠檬酸0.6 g/L，醋酸1.5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉7.5 g/L，羧甲基纤维素钠0.4 g/L。
发酵液配方采用：葡萄糖22.5 g/L，蔗糖27.5 g/L，硫酸铵1 g/L，磷酸二氢钾5 g/L，硫酸镁0.7 g/L，乳酸钙0.2 g/L， 柠檬酸0.6 g/L，醋酸1.5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉7.5 g/L，羧甲基纤维素钠5-25 g/L，碳酸钙1-10 g/L。
实施例1：
本发明为一种原位调节细菌纤维素结构的方法：
第一步：木醋杆菌进行种子扩增，摇床震荡培养，培养温度30℃，摇床转速160 rpm，培养时间36 h；
第二步：发酵液配制时加入10 g/L羧甲基纤维素钠；待羧甲基纤维素钠溶解完全后，加入3 g/L的碳酸钙，121℃高温灭菌20 min，冷却至室温；
第三步：木醋杆菌以8%的接种量进行接种，接种后静置培养，培养5天；
第四步：发酵结束后，用质量分数3 g/L的NaOH和3 g/L的H2O2在80℃条件下水浴3.0小时，除去残留的细胞及发酵液；
第五步：用20 g/L的醋酸浸泡BC膜24 h，除去纤维素网络中包埋的碳酸钙；
第六步：用去离子水冲洗BC膜至中性。
实施例2：
本发明为一种原位调节细菌纤维素结构的方法：
第一步：木醋杆菌进行种子扩增，摇床震荡培养，培养温度29℃，摇床转速160 rpm，培养时间36 h；
第二步：发酵液配制时加入10 g/L羧甲基纤维素钠；待羧甲基纤维素钠溶解完全后，加入3 g/L的碳酸钙，115℃高温灭菌25 min，冷却至室温；
第三步：木醋杆菌以8%的接种量进行接种，接种后静置培养，培养5天；
第四步：发酵结束后，用质量分数4 g/L的NaOH和4 g/L的H2O2在85℃条件下水浴2.0小时，除去残留的细胞及发酵液；
第五步：用30 g/L的醋酸浸泡BC膜24 h，除去纤维素网络中包埋的碳酸钙；
第六步：用去离子水冲洗BC膜至中性。
实施例3：
本发明为一种原位调节细菌纤维素结构的方法：
第一步：木醋杆菌进行种子扩增，摇床震荡培养，培养温度31℃，摇床转速160 rpm，培养时间42 h；
第二步：发酵液配制时加入15 g/L 羧甲基纤维素钠；待羧甲基纤维素钠溶解完全后，加入4 g/L的碳酸钙，121℃高温灭菌15 min，，冷却至室温；
第三步：木醋杆菌以10%的接种量进行接种，接种后静置培养，培养7天；
第四步：发酵结束后，用质量分数5 g/L的NaOH溶液和5 g/L的H2O2在75℃条件下水浴3.0小时，除去残留的细胞及发酵液；
第五步：用40 g/L的醋酸浸泡BC膜36 h除去纤维素网络中包埋的碳酸钙；
第六步：用去离子水冲洗BC膜至中性。
对比例：
未调节细菌纤维素结构的方法：
第一步：木醋杆菌进行种子扩增，摇床震荡培养，培养温度30℃，摇床转速160 rpm，培养时间36 h；
第二步：发酵液配制完成后，121℃高温灭菌20 min，冷却至室温；
第三步：木醋杆菌以8%的接种量进行接种，接种后静置培养，培养5天；
第四步：发酵结束后，用质量分数3 g/L的NaOH溶液和3 g/L的H2O2在80℃条件下水浴3.0小时，除去残留的细胞及发酵液；
第五步：用去离子水冲洗BC膜至中性。
图2是实施例1中使用的碳酸钙对应的粒径分布图。
图3是对比例中结构未经调节的BC的扫描电镜图。
图4是实施例1中细菌纤维素结构经原位调节后的扫描电镜图。
对比两图可以看出，在培养基中添加羧甲基纤维素钠及碳酸钙后，由于碳酸钙颗粒不溶于水，能均匀分散在发酵液中。待木醋杆菌分泌纤维素多糖，形成的三维纤维网络能包埋碳酸钙。在发酵完成后，除去碳酸钙，在原有碳酸钙的位置会形成孔洞。由图2、图4可以看出，碳酸钙的粒度主要分布在10-20 μm，碳酸钙在水溶液中存在溶解平衡，碳酸钙的掺入使孔的直径大小在4-5 μm，分布均匀。由对比例获得的BC，如图3，则没有明显的孔洞结构。
综上所述，通过向发酵液中添加羧甲基纤维素钠及碳酸钙，能实现原位调节细菌纤维素三维网络结构。