说明书白蛋白变体
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发明背景
发明领域
本发明涉及白蛋白变体或其片段或者包含变体白蛋白或其片段的融合多 肽，它们与白蛋白、其片段或包含白蛋白或其片段的融合多肽相比，具有在 对FcRn的结合亲和力方面的改变和/或在半衰期方面的改变。本发明允许根据 用户或应用的要求和愿望定制白蛋白的结合亲和力和/或半衰期。
相关技术说明
白蛋白是一种在哺乳动物血浆中天然发现的蛋白质，它是血浆中最丰富 的蛋白质。它在维持所希望的血液渗透压方面具有重要作用，并且在血流中 的各种物质的运输中也具有重要作用。白蛋白已经从包括人类、猪、小鼠、 大鼠、兔、以及山羊的许多物种中得以表征，并且它们享有高度的序列和结 构同源性。
白蛋白体内结合至它的受体，即新生儿Fc受体(FcRn)“布兰贝尔 (Brambell)”，并且已知这种相互作用对于白蛋白的血浆半衰期是重要的。 FcRn是一种膜结合蛋白，被表达在许多细胞和组织类型中。已经发现FcRn可 回收来自细胞内降解的白蛋白(罗帕宁(Roopenian)D.C.和阿基里奇 (Akilesh)，S.(2007)，《自然综述免疫学》(Nat.Rev.Immunol)7,715- 725.)。FcRn是一种双功能分子，有助于维持哺乳动物如人类的血浆中高水 平的IgG和白蛋白。
而FcRn-免疫球蛋白(IgG)相互作用已经得以在现有技术中表征， FcRn-白蛋白相互作用没有被较好地表征。主要的FcRn结合位点位于DIII内 (381-585)，(安徒生(Andersen)等人(2010)，《临床生物化学》 (Clinical Biochemistry)43,367-372)。多个关键氨基酸已经显示在结合中是 重要的，尤其是组氨酸H464、H510和H536以及Lys500(安徒生等人 (2010)，《自然通讯》(Nat.Commun.)3:610. DOI:10.1038/ncomms1607)。数据指示IgG和白蛋白非协作式地结合至FcRn上 的相异位点(安徒生等人(2006)，《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol) 36,3044-3051；乔杜里(Chaudhury)等人(2006)，《生物化学》 (Biochemistry)45,4983-4990.)。
已知的是FcRn结合来自小鼠和人类的IgG，然而人类FcRn显现是更有差 别的(奥伯(Ober)等人(2001)《国际免疫学》(Int.Immunol)13,1551- 1559)。安徒生等人(2010)《生物化学杂志》(Journal of Biological Chemistry)285(7):4826-36描述了人类和小鼠FcRn对于小鼠和人类各自的白蛋 白的亲和力(所有可能的组合)。在生理pH下观察到来自任一物种的白蛋白 对任一受体的非结合。在酸性pH下，观察到结合亲和力的100倍的区别。在所 有情况下，来自任一物种的白蛋白和IgG与两种受体的结合是附加的。
人血清白蛋白(HSA)已经被良好地表征为具有585个氨基酸的多肽， 它的序列可以发现于彼得斯(Peters)，T.,Jr.(1996)《关于白蛋白的全 部：生物化学，遗传学与医学应用》(All about Albumin:Biochemistry, Genetics and Medical,Applications)pp10，学术出版社公司(Academic Press, Inc.)，奥兰多(Orlando)(ISBN 0-12-552110-3)中。它对其受体FcRn具有 特征性结合，其中它在pH6.0而不是在pH7.4时结合。
已经发现HSA的血浆半衰期是大约19天。已经鉴定出具有更低血浆半衰 期的天然变体(皮奇(Peach)，R.J.和布伦南(Brennan)，S.0.，(1991) 《生物化学与生物物理学报》(Biochim Biophys Acta.)1097:49-54)，具有取 代D494N。在该变体中该取代产生了一个N-糖基化位点，该位点在野生型白 蛋白中是不存在的。不知道的是糖基化或氨基酸改变是否对血浆半衰期的改 变有贡献。
白蛋白具有长的血浆半衰期，并且由于此特性它已经被建议用于药物递 送中。已经将白蛋白轭合至药学上有益的化合物(WO 2000/69902)，并且发 现该轭合物维持白蛋白的长的血浆半衰期。通常认为所得的轭合物的血浆半 衰期显著长于单独的有益治疗化合物的血浆半衰期。
另外，已经将白蛋白从遗传学角度融合至治疗有益肽中(WO 2001/79271 A和WO 2003/59934)，伴随的典型结果是该融合物具有治疗有益 肽的活性以及比该单独的治疗有益肽的血浆半衰期显著更长的血浆半衰期。
小田切(Otagiri)等人(2009)，《生物与制药公报》(Biol.Pharm. Bull.)32(4),527-534披露了多于70种白蛋白变体中发现有25种在结构域III中 具突变。在羧基端缺乏最后175个氨基酸的天然变体已经显示具有减少的半衰 期(安徒生等人(2010)，《临床生物化学》(Clinical Biochemistry)43, 367-372)。岩夫(Iwao)等人(2007)使用小鼠模型研究了天然存在的人白 蛋白变体的半衰期，并且发现K541E和K560E具有减少的半衰期，E501K和 E570K具有最佳的半衰期，并且K573E对半衰期几乎没有影响(岩夫等人 (2007)B.B.A.《蛋白质与蛋白质组学》(Proteins and Proteomics)1774, 1582-1590)。
加利亚诺(Galliano)等人(1993)《生物化学与生物物理学报》 (Biochim.Biophys.Acta)1225,27-32披露了一种天然变体E505K。明基奥蒂 (Minchiotti)等人(1990)披露了一种天然变体K536E。明基奥蒂等人 (1987)《生物化学与生物物理学报》(Biochim.Biophys.Acta)916,411- 418披露了一种天然变体K574N。高桥(Takahashi)等人(1987)《美国国家 科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)84,4413-4417披露了一种天然变体 D550G。卡尔森(Carlson)等人(1992).《美国国家科学院院刊》(Proc. Nat.Acad.Sci.USA)89,8225-8229披露了一种天然变体D550A。
WO 2011/051489和WO 2012/150319(PCT/EP2012/058206)披露了在白 蛋白中的多个点突变，这些点突变调节白蛋白与FcRn的结合，WO 2010/092135披露了白蛋白中的多个点突变，这些点突变增加了可用于白蛋白 轭合的硫醇的数目，该披露没有记载关于突变对白蛋白与FcRn的结合的影 响。WO 2011/103076披露了白蛋白变体，各自包含HSA的结构域III中的取 代。WO 2012/112188披露了包含HSA的结构域III中的取代的白蛋白变体。
白蛋白具有结合多个配体的能力，并且这些配体变得与白蛋白缔合的 (缔合)。该特性已被用来延长具有非共价结合至白蛋白的能力的药物的血 浆半衰期。这还可以通过将具有很少或不具有白蛋白结合特性的药学上的有 益化合物结合至具有白蛋白结合特性的部分来实现，参见克拉茨(Kratz) (2008)《控制释放杂志》(Journal of Controlled Release)132,171-183其中 的综述文章和参考文献。
白蛋白用于药学上的有益化合物的制剂中，其中这种制剂可以是例如但 不限于白蛋白的纳米颗粒或微粒。在这些实例中，药学上的有益化合物或化 合物的混合物的递送可以受益于白蛋白与其受体的亲和力的改变，其中已经 显示有益化合物与白蛋白缔合以便用于递送手段。尚不清楚的是什么决定了 所形成缔合物(例如但不限于库尔茨斯(Kurtzhals)P等人《生物 化学杂志》(Biochem.J.)1995；312:725-731)、轭合物或融合多肽的血浆半 衰期，但显现出是白蛋白与所选择的药学上的有益化合物/多肽的组合的结 果。希望的是能够控制给定白蛋白轭合物、缔合物或白蛋白融合多肽的血浆 半衰期，从而可以实现与缔合物、轭合物或融合物的组分给出的血浆半衰期 相比更长或更短的血浆半衰期，以便能够根据意欲治疗的适应症的详情来设 计具体药物。
已知白蛋白可在肿瘤中积聚并且发生分解代谢，还显示白蛋白在类风湿 性关节炎患者的发炎关节中积聚。参见克拉茨(Kratz)(2008)《控制释放 杂志》(Journal of Controlled Release)132,171-183其中的综述文章和参考文 献。可以设想针对FcRn具有增加的亲和力的HSA变体对于药学上的有益化合 物的递送将是有利的。
甚至希望的是具有多种很少结合或不结合至FcRn的白蛋白变体，从而提 供更短的半衰期或受控制的血浆药物代谢动力学，如由科那诺娃 (Kenanova)等人(2009)《核医学杂志》(J.Nucl.Med.)；50(增刊 2):1582)所描述的。
科那诺娃等人(2010，《蛋白质工程、设计与选择》(Protein Engineering,Design&Selection)23(10):789-798；WO 2010/118169)披露了 一种对接模型，该对接模型包括HSA(在pH7至8溶解)结构域III的结构模型 以及FcRn(在pH6.4溶解)的结构模型。科那诺娃等人披露了潜在地与FcRn 相互作用的结构域III中的位置464、505、510、531和535。在位置464、510和 535处的组氨酸被乔杜里(Chaudhury)等人(2006,op.cit.)鉴定为特别感兴 趣的，并且科那诺娃(2010,op.cit.)显示这些在小鼠中具有亲和力方面的降 低和更短的半衰期。然而，科那诺娃等人的研究被限制于HSA的结构域III， 并且因此不认为HSA处于其天然原始构型中。并且，所鉴定的位置导致对于 FcRn受体的亲和力的降低。
本发明提供了具有对FcRn受体的调节的(即改变的)结合亲和力的另外 的变体。因此该白蛋白部分或这些白蛋白部分可以用于定制包含白蛋白部分 的融合多肽、轭合物、缔合物、纳米颗粒和组合物对FcRn的结合亲和力和/或 半衰期。
发明概述
本发明涉及白蛋白变体，这些白蛋白变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽 的结构域I中的一个或多个(若干个)改变以及结构域III中的一个或多个(若 干个)改变，或者其他白蛋白或其片段的等同位置中的一个或多个(若干 个)改变。
本发明还涉及白蛋白变体，这些白蛋白变体包含SEQ ID NO:2的成熟多 肽的结构域I中的或者其他白蛋白或其片段的等同位置中的一个或多个(若干 个)改变。
本发明还涉及白蛋白变体，这些白蛋白变体包含SEQ ID NO:2的成熟多 肽的结构域III中的或者其他白蛋白或其片段的等同位置中的一个或多个(若 干个)改变。
本发明还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核 酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生这些变体的方法。
本发明还涉及包含了根据本发明的变体白蛋白或其片段以及有益治疗部 分的轭合物或缔合物，或者涉及包含本发明的变体白蛋白或其片段以及融合 配伍多肽的融合多肽。
本发明进一步涉及组合物，这些组合物包含：变体白蛋白、其片段、含 有该变体白蛋白或其片段的融合多肽、或者含有根据本发明的该变体白蛋白 或其片段的轭合物、或者含有根据本发明的该变体白蛋白或其片段的缔合 物。这些组合物优选是药物组合物。
本发明进一步涉及一种药物组合物，该药物组合物包含：变体白蛋白、 其片段、含有该变体白蛋白或其片段的融合多肽、或者含有该变体白蛋白或 其片段的轭合物、或者含有该变体白蛋白或其片段的缔合物。
本发明还涉及变体、片段、融合多肽、轭合物、缔合物、纳米颗粒和微 粒的用途。
本发明还涉及用于制备一种变体白蛋白、其片段、含有变体白蛋白或其 片段的融合多肽、或者含有该变体白蛋白或其片段的轭合物、或者含有该变 体白蛋白或其片段的缔合物的方法。
附图简要说明
图1：以下氨基酸序列的多重对比：(i)全长成熟HSA(Hu_1_2_3)，(ii) 包含HSA的结构域I和结构域III的白蛋白变体(Hu_1_3)，(iii)包含HSA的结 构域II和结构域III的白蛋白变体(Hu_2_3)，(iv)全长恒河猴(Macaca mulatta)白蛋白(Mac_mul)，(v)全长褐家鼠(Rattus norvegicus)白蛋白 (大鼠)以及(vi)全长小家鼠(Mus musculus)白蛋白(小鼠)。位置500、 550和573(相对于全长HSA)由箭头指示。在图1中，结构域I、II和III称为 1、2和3(对应地)。
图2：来自人类、绵羊、小鼠、兔以及山羊的成熟白蛋白的，以及来自 黑猩猩(“chimpanzee或Chimp”)、猕猴、仓鼠、豚鼠(guinea pig)、大 鼠、牛、马、犬、鸡、和猪的非成熟白蛋白的氨基酸序列的多重比对。结构 域1、2和3的起始和结束氨基酸(如由多卡尔(Dockal)等人在《生物化学杂 志》(The Journal of Biological Chemistry)，1999，274卷(41)：29303- 29310中限定的)被相对于成熟人白蛋白来指示。
图3：氨基酸的基于其特性的保守组。
图4：shFcRn-HSA对接模型的图示。(A-B)显示复合物的两个取向。 白蛋白由空间填充图显示，FcRn显示为带状图。HSA的核心结合界面是粉色 高亮(就灰度而言，这被看作为最黑(几乎是黑色)的区域；DI(CBI))， 而位于界面远端的区域显示为DII(橙色)，并且DIII分为子结构域DIIIa(就 颜色而言为青色)和DIIIb(就颜色而言为蓝色)。
图5：在pH5.5时WT HSA、HSA K573P和HSA N111Q/K573P的shFcRn结 合，将样品注射在pH5.5的固定化的shFcRn-HIS(约1500-2500RU)上。
图6：提出的shFcRn-HSA对接模型，显示shFcRn(空间填充图)与HSA (带状图)DI、DII和DIII(包括含有位置78至88和108至112的HSA的环)之 间的空间关系。
定义
变体：术语“变体”意指通过在一个或多个(例如若干个)位置上的一 个或多个(若干个)改变，即取代、插入、和/或缺失而从亲本白蛋白衍生的 多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸被一个不同的氨基酸置换；缺失意指 除去占据一个位置的氨基酸；并且插入意指在与占据一个位置的氨基酸紧紧 相邻处添加1个或多个(若干个)氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9 或10个，优选1至3个氨基酸。关于取代，“紧紧相邻”可以是相邻于占据一 个位置的氨基酸(“指定的氨基酸”)的N-侧(‘上游’)或C-侧(‘下 游’)。因此，对于氨基酸命名的/编号的‘X’，插入可以是在位置‘X+1’ (‘下游’)或在位置‘X-1’(‘上游’)处。
突变体：术语“突变体”意指编码一种变体的多核苷酸。
野生型白蛋白：术语“野生型”(WT)白蛋白意指具有与天然发现于 动物或人类中的白蛋白相同的氨基酸序列的白蛋白。
亲本白蛋白：术语“亲本”或“亲本白蛋白”意指这样一种白蛋白，对 该白蛋白进行一个人工改变以产生本发明的白蛋白变体。亲本可以是天然存 在的(野生型)多肽和/或其等位体(allele)、或甚至是其本体。
白蛋白：白蛋白是蛋白质并且构成了哺乳动物血浆中最丰富的蛋白质， 并且来自许多哺乳动物的白蛋白已经由生物化学方法和/或序列信息表征。若 干白蛋白例如人血清白蛋白(HSA)也已经从结晶学上被表征，并且其结构 已被确定(HSA：He XM，卡特(Carter)DC(1992年7月)，“人血清白蛋 白的原子结构与化学”(“Atomic structure and chemistry of human serum albumin”)，《自然》(Nature)358(6383):209-15；马白蛋白：Ho,J.X.等 人(2001)，马血清白蛋白的在0.27-nm分辨率下的X射线和初级结构(X-ray and primary structure of horse serum albumin)(家马)，《欧洲生物化学杂 志》(Eur J Biochem.)215(1):205-12)。
术语“白蛋白”意指具有与HSA或HSA结构域相同和/或非常相似的三维 (三级)结构的蛋白质，并且具有与HSA或与相关结构域相似的特性。相似 的三维结构是例如来自在此所述的物种的白蛋白的结构。白蛋白的一些主要 特性是i)其调节血浆体积的能力(膨胀活性)，ii)大约19天±5天的长血浆 半衰期，iii)与FcRn的结合，iv)配体结合，例如内源性分子如酸性亲脂性化 合物的结合，这些化合物包括胆红素、脂肪酸、血红素和甲状腺素(还参见 克拉格-汉森(Kragh-Hansen)等人，2002，《生物与制药公报》(Biol. Pharm.Bull.)25,695的表1，通过引用特此结合)，v)小有机化合物与酸性 或负电性特征例如药物的结合，这些药物例如华法林、安定、布洛芬以及紫 杉醇(还参见克拉格-汉森等人，2002，《生物与制药公报》25,695的表1， 通过引用特此结合)。并不是所有这些特性都需要满足以将蛋白质或片段表 征为白蛋白。如果片段例如不包括贡献于某些配体或有机化合物的结合的结 构域，则也不会预期这种片段的变体具有这些特性。
白蛋白通常具有大约20天或更长的长的血浆半衰期，例如，HSA具有19 天的血浆半衰期。已知的是HSA的长的血浆半衰期是由与其受体FcRn的相互 作用介导的，然而，在HSA的长的半衰期背后的确切机制的理解或知识对于 本发明而言不是至关重要的。
因为根据本发明的白蛋白蛋白质的实例可以是提及的人血清白蛋白(例 如，AAA98797或P02768-1，SEQ ID NO:2(成熟)、SEQ ID NO:4(不成 熟))，灵长类血清白蛋白(例如黑猩猩血清白蛋白(例如，预计序列 XP_517233.2SEQ ID NO:5)、大猩猩血清白蛋白或猕猴血清白蛋白(例如 NP_001182578，SEQ ID NO:6))，啮齿类血清白蛋白(例如仓鼠血清白蛋 白(例如A6YF56，SEQ ID NO:7)、豚鼠血清白蛋白(例如Q6WDN9-1， SEQ ID NO:8)、小鼠血清白蛋白(例如AAH49971或P07724-1型式3，SEQ ID NO:9)以及大鼠血清白蛋白(例如，AAH85359或P02770-1型式2，SEQ ID NO:10))，牛(bovine)血清白蛋白(例如，牛(cow)血清白蛋白 P02769-1，SEQ ID NO:11)，马(equine)血清白蛋白如马(horse)血清白 蛋白(例如P35747-1，SEQ ID NO:12)或驴血清白蛋白(例如Q5XLE4-1， SEQ ID NO:13)，兔血清白蛋白(例如P49065-1型式2，SEQ ID NO:14)， 山羊血清白蛋白(例如ACF10391，SEQ ID NO:15)，绵羊血清白蛋白(例 如，P14639-1，SEQ ID NO:16)，犬血清白蛋白(例如P49822-1，SEQ ID NO:17)，鸡血清白蛋白(例如P19121-1型式2，SEQ ID NO:18)以及猪血清 白蛋白(例如P08835-1型式2，SEQ ID NO:19)或具有与这样一种白蛋白至 少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或至少99％的氨基酸一致性的多肽。亲本或参照白蛋白可以是人工 变体，例如HSA K573P(SEQ ID NO:3)或嵌合白蛋白(例如，HSA的N-端 和猕猴属白蛋白的C-端(SEQ ID NO:20)，HSA的N-端和小鼠白蛋白的C-端 (SEQ ID NO:21)，HSA的N-端和和兔白蛋白的C-端(SEQ ID NO:22)， HSA的N-端和绵羊白蛋白的C-端(SEQ ID NO:23)。
也被包含在本申请的范围内的白蛋白的其他实例包括卵白蛋白(例如 P01012.pro：鸡卵白蛋白；O73860.pro：火鸡卵白蛋白)。
如在SEQ ID NO:2中所披露的HSA或其任何天然存在的等位体是根据本 发明的优选白蛋白(亲本白蛋白)。HSA是由585个氨基酸残基构成的蛋白 质，并且具有67kDa的分子量。在其处于天然形式时它未被糖基化。本领域 的技术人员将理解具有与HSA基本相同特性的但与SEQ ID NO:2相比具有一 个或多个(若干个)氨基酸改变的天然等位体可以存在，并且诸位发明人还 考虑了此类天然等位体作为根据本发明的亲本白蛋白的用途。
亲本白蛋白、其片段、或含有根据本发明的白蛋白或其片段的融合多肽 的白蛋白部分优选具有与SEQ ID NO:2所示的HSA的序列至少60％、优选至少 70％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少86％、优选至少87％、优选至 少88％、优选至少89％、优选至少90％、优选至少91％、优选至少92％、优选 至少93％、优选至少94％、优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少 97％、更优选至少98％并且最优选至少99％的序列一致性。优选的是亲本白蛋 白维持白蛋白的主要特性的至少一个或与白蛋白如HSA类似的三级结构。序 列一致性可以是就SEQ ID NO:2全长而言的或就包含一个片段如SEQ ID NO: 2的一个或多个(若干个)结构域或由其组成的分子而言的，该分子例如包含 结构域III或由其组成的分子(例如SEQ ID NO:27)、包含结构域II和结构域 III或由其组成的分子(例如SEQ ID NO:25)、包含结构域I和结构域III或由其 组成的分子(例如SEQ ID NO:24)、包含两个拷贝的结构域III或由其组成的 分子(例如SEQ ID NO:26)、包含三个拷贝的结构域III或由其组成的分子 (例如SEQ ID NO:28)、或者包含结构域I和两个拷贝的结构域III或由其组成 的分子(例如SEQ ID NO:29)。
亲本优选包括SEQ ID NO:4(HSA的非成熟序列)或SEQ ID NO:2 (HSA的成熟序列)的氨基酸序列或由其组成。
在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个等位基因 变体。
亲本白蛋白可以是由一种多核苷酸编码，该多核苷酸在非常低严谨度条 件、低严谨度条件、中严谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件或非常 高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或者(ii)(i)的全长 互补链杂交(J.萨拉布鲁克(Sambrook)、E.F.弗里奇(Fritsch)以及T.马 尼亚蒂斯(Maniatis)，1989，《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)。
可以使用SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列、连同SEQ ID NO:2的氨 基酸序列或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆对 来自不同属或种的菌株的亲本进行编码的DNA。具体而言，这类探针可以用 于按照标准DNA印迹程序与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以便鉴定 并分离其中的相应基因。这类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至 少14，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针的长 度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至 少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、 至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针都可使用。典型地 将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检 测相应的基因。本发明涵盖此类探针。
可以针对与上文所述的探针杂交并编码一个亲本的DNA来筛选由这类其 他生物制备的基因组DNA或cDNA文库。可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电 泳、或其他分离技术分离其他生物的基因组或其他DNA。可将来自文库的 DNA或分离的DNA转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为 鉴定与SEQ ID NO:1或其子序列同源的克隆或DNA，在DNA印迹法中使用载 体材料。
为了本发明的目的，杂交指示多核苷酸与对应于SEQ ID NO:1中所示的 多核苷酸、其互补链或其子序列的标记核酸探针在低严谨度条件至非常高严 谨度条件下杂交。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手 段来检测该探针所杂交的分子。
核酸探针可以包括SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列即SEQ ID NO:1的 核苷酸1至1785，或由其组成。核酸探针可以包括编码SEQ ID NO:2的多肽或 其一个片段的多核苷酸或由其组成。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针而言，非常低至非常高严谨度条 件定义为最佳地按照标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、 200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA中，以及对于非常低和低严谨度在 25％甲酰胺中，对于中和中-高严谨度在35％甲酰胺中，或对于高和非常高严 谨度在50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。将载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS在45℃(非常低严谨度)、50℃(低严谨度)、55℃(中严 谨度)、60℃(中-高严谨度)、65℃(高严谨度)、或70℃(非常高严谨 度)洗涤三次，每次持续15分钟。
对于长度为大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针而言，严谨度条 件被定义为最佳地按照标准DNA印迹程序，在使用根据博尔顿(Bolton)和 麦卡锡(McCarthy)(1962，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA) 48:1390)的计算法所计算的Tm以下大约5℃至大约10℃，在每毫升0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl pH7.6、6mM EDTA、0.5％NP-40、1X登哈特 (Denhardt)溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP和0.2mg 酵母RNA中预杂交和杂交12至24小时。最后将载体材料在计算的Tm以下5℃至 10℃，在6X SCC加0.1％SDS中洗涤1次持续15分钟并且使用6X SSC洗涤2 次，每次15分钟。
该亲本可以由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多 肽编码序列具有至少60％、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、 至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少 99％、或100％的序列一致性，该成熟多肽编码序列对能够发挥白蛋白功能的 多肽进行编码。在一个实施例中，该亲本是由包含SEQ ID NO:1或由其组成 的多肽编码的。
白蛋白部分：包含根据本发明的白蛋白变体或其片段的融合多肽、轭合 物、缔合物、纳米颗粒或组合物的白蛋白部分可以称为‘白蛋白部分’或 ‘白蛋白组分’。根据本发明的多肽可以包括白蛋白部分或由其组成。
FcRn和shFcRn：术语“FcRn”意指人类新生儿Fc受体(FcRn)。 shFcRn是FcRn的可溶性重组形式。hFcRn是SEQ ID NO:30(主要组织相容性 复合体I类样Fc受体的截短的重链(FCGRT))与SEQ ID NO:31(β-2-微球蛋 白)的异二聚体。SEQ ID NO:30和31一起形成hFcRn。
分离的变体：术语“分离的变体”意指由人工修饰的并且与至少一种与 其天然一起存在的组分完全或部分分离的变体。术语“分离的变体”意指在 自然界中不存在的一种形式或环境中的一种变体。分离的物质的非限制性实 例包括(1)任何非天然存在的变体，(2)至少部分地从与其天然缔合的天然存 在的组分中的一个或多个(若干个)或全部中去除的任何变体；(3)通过相对 于衍生出它的多肽进行人工修饰的任何变体(例如如在自然界中发现的衍生 出它的多肽)；或(4)通过相对于与其天然缔合的其他组分而增加变体的量来 修饰的任何变体(例如，编码该物质的基因的多重拷贝；使用比与编码该物 质的基因天然缔合的启动子更强的启动子)。分离的变体可以存在于发酵液 样品中。变体可以是至少1％纯的，例如至少5％纯的、至少10％纯的、至少 20％纯的、至少40％纯的、至少60％纯的、至少80％纯的、以及至少90％纯 的，如通过SDS-PAGE或GP-HPLC确定的。
基本上纯的变体：术语“基本上纯的变体”意指包含按重量计至多 10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、 以及至多0.5％的其他多肽材料的制剂，这些其他多肽材料是与其天然或重组 地相关的。优选地，该变体按存在于制剂中的总多肽材料的重量计是至少 92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯 的、至少98％纯的、至少99％纯的、至少99.5％纯的、以及100％纯的。可以通 过SDS-PAGE或GP-HPLC确定纯度。本发明的这些变体优选地处于一种基本 上纯的形式。这可例如通过用熟知的重组方法和纯化方法来制备该变体来完 成。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰(例如N-端 加工、C-端截短、糖基化、磷酸化等)之后处于其最终形式的多肽。成熟多 肽可以是SEQ ID NO:2的氨基酸1至585，例如具有根据本发明的改变，和/或 包括任何翻译后修饰。
成熟多肽编码序列:术语“成熟多肽编码序列”意指编码一种成熟白蛋白 多肽的一种多核苷酸。成熟多肽编码序列可以是SEQ ID NO:1的核苷酸1至 1758，例如，包含编码根据本发明的变体所需要的核苷酸。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参 数“序列一致性”描述。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德 曼&翁施，1970，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两 个氨基酸序列之间的序列一致性程度，该算法如EMBOSS软件包 (EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，《遗传学趋势》(Trends Genet.)16:276-277)(优选3.0.0版或更新版本，更优选5.0.0版或更新版本) 的尼德尔(Needle)程序所实施的。所使用的这些任选参数是空位开放罚分 10、空位延伸罚分0.5，及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代 矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用 作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(尼德曼(Needleman)和翁 施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列 一致性的程度，如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件 套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice) 等人，2000，见上文)(优选3.0.0版或更新版本，更优选5.0.0版或更新版 本)的尼德尔程序中所实施的。使用的任选参数是空位开放罚分10，空位延 伸罚分0.5及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔 标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致 性，并且如下计算：
(一致的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
片段：术语“片段”意指其中一个或多个(若干个)氨基酸从白蛋白和/ 或已保留了结合至FcRn的能力的白蛋白内部区域的氨基和/或羧基端缺失的多 肽。片段可以由一个从HSA衍生的未中断的序列组成，或者它可以包括两个 或更多个(若干个)从HSA衍生的序列。根据本发明的片段具有的大小为大 于大约20个氨基酸残基，优选大于30个氨基酸残基，更优选大于40个氨基酸 残基，更优选大于50个氨基酸残基，更优选大于75个氨基酸残基，更优选大 于100个氨基酸残基，更优选大于200个氨基酸残基，更优选大于300个氨基酸 残基，甚至更优选大于400个氨基酸残基，并且最优选大于500个氨基酸残 基。一个片段可以包括一个或多个白蛋白结构域或由其组成，例如DI+DII、 DI+DIII、DII+DIII、DIII+DIII、DI+DIII+DIII、DIII+DIII+DIII，或具 有此类结构域或结构域的组合的片段。
结构域I、II和III可以参照HSA(SEQ ID NO:2)来定义。例如，HSA结 构域I可以包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至194(±1至15个氨基酸)或由其组 成，HSA结构域II可以包括SEQ ID NO:2的氨基酸192(±1至15个氨基酸)至 387(±1至15个氨基酸)或由其组成，并且结构域III可以包括SEQ ID NO:2的 氨基酸残基381(±1至15个氨基酸)至585(±1至15个氨基酸)或由其组成。 “±1至15个氨基酸”意指残基数目可以到所指定氨基酸位置的C-端和/或到N- 端偏离1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个氨基酸。 结构域I、II和III的实例由多卡尔(Dockal)等人(《生物化学杂志》， 1999，274卷(41)：29303-29310)以及凯尔森(Kjeldsen)等人(《蛋白质 表达与纯化》(Protein Expression and Purification)，1998，13卷：163-169) 描述，并且如以下列表所示。
本领域的技术人员可以通过与HSA进行的氨基酸序列比对来鉴别非人类 白蛋白中的结构域I、II和III，例如使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算 法(尼德曼和翁施，1970，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)48:443- 453)，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件 (The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等 人，2000，《遗传学趋势》(Trends Genet.)16:276-277)(优选3.0.0版或更 新版本，更优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序所实施的。所使用的这些 任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，及EBLOSUM62 (BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。其他合适的软件包括MUSCLE (通过对数预期的多重序列比较(Multiple sequence comparison by log- expectation)，罗伯特(Robert)C.埃德加(Edgar)，3.6版本， http://www.drive5.com/muscle；埃德加(Edgar)(2004)《核酸研究》 (Nucleic Acids Research)32(5)，1792-97以及埃德加(Edgar)(2004) 《BMC生物信息学》，5(1):113)，可以使用缺省设置，如在用户指南中所述 的(3.6版本，2005年9月)。MUSCLE的高于3.6的版本也可以用于本发明的 任何方面。合适的比对的实例提供于图1和图2中。
优选的是结构域具有与HSA(SEQ ID NO:2)的结构域I、II或III至少 70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％的一 致性或100％的一致性。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的一种 基因的两个或更多个(若干个)替代形式中的任一种。等位基因变异由突变 天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是静默的(在所编 码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位 基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指明其翻译的多肽产物的氨基酸 序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框 架通常以ATG起始密码子或替代性起始密码子(例如GTG和TTG)开始，并 且以终止密码子(例如TAA、TAG、和TGA)结束。编码序列可以是DNA、 cDNA、合成或重组的多核苷酸。
cDNA:术语“cDNA”意指可以通过从成熟的剪接的mRNA分子逆转录制 备的DNA分子，该mRNA分子是从真核细胞中获得。cDNA缺少可存在于相应 基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在 呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
核酸构建体：术语“核酸构建体”是指从天然存在的基因中分离的、或 以自然中不会另外出现的方式被修饰成包含核酸区段的、或合成的单链或双 链的核酸分子。当核酸构建体含有表达本发明编码序列所需要的控制序列 时，术语核酸构建体与术语“表达盒”含义相同。
控制序列：术语“控制序列”意指为编码本发明的一种变体的一种多核 苷酸的表达所需的所有组分(例如核酸序列)。每个控制序列对于编码该变 体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自 不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于 前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终 止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有 利于将这些控制序列连接进编码一种变体的多核苷酸的编码区中的特异性限 制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构造，其中控制序列相 对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置，这样使得控制序列指导编码序列 的表达。
表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于：转 录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指一种直链或环状DNA分子，该分子包 括编码一种变体的一种多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的另外 的核苷酸(例如控制序列)。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包括本发明的一种多核苷酸的 一种核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导和/或其他过程的任何细胞 类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的 亲本细胞的任何后代。
血浆半衰期：理想地血浆半衰期是在合适的个体中体内确定的。然而， 由于那是费时并昂贵的并且不可避免地存在与在动物或人类中做实验相关的 道德问题，所希望的是使用体外测定来确定血浆半衰期是否是预期的或减少 的。已知的是白蛋白与其受体FcRn的结合对于血浆半衰期是重要的，并且在 受体结合与血浆半衰期之间的相关性是白蛋白与其受体亲和力越高导致血浆 半衰期越长。因此，对于本发明，白蛋白与FcRn的较高的亲和力被认为指示 增加的血浆半衰期，并且白蛋白与其受体的较低的亲和力被认为指示减少的 血浆半衰期。
在本申请和权利要求书中，使用术语亲和力和表述“更强”或“更弱” 来描述白蛋白与其受体FcRn的结合。因此，应理解与HSA相比，对FcRn具有 更高亲和力的分子被认为与HSA相比与FcRn的结合更强，并且与HSA相比， 对FcRn具有更低亲和力的分子被认为与HSA相比与FcRn的结合更弱。
术语“更长的血浆半衰期”或“更短的血浆半衰期”以及类似的表述被 理解为相对于相应的亲本或参照或相应的白蛋白分子的关系。因此，关于本 发明的变体白蛋白而言更长的血浆半衰期意指与除了在此所述的一个或多个 改变(例如，在SEQ ID NO:2中，例如在结构域I中的一个或多个(若干个) 位置处，以及在结构域III中的一个或多个(若干个)位置处)之外具有相同 序列的相应白蛋白相比，该变体具有更长的血浆半衰期。
参照物：参照物是白蛋白变体、融合物、轭合物、组合物、缔合物或纳 米颗粒与其进行比较的白蛋白、融合物、轭合物、组合物、缔合物或纳米颗 粒。参照物可以包括全长白蛋白(例如HSA或其天然等位体)或其片段，或 者由它们组成。参照物还可以称为白蛋白变体、融合物、轭合物、组合物、 缔合物或纳米颗粒与其进行比较的“相应的”白蛋白、融合物、轭合物、组 合物、缔合物或纳米颗粒。参照物可以包括HSA(SEQ ID NO:2)或其片 段、融合物、轭合物、缔合物、纳米颗粒或微粒，或者由它们组成。优选 地，除了白蛋白部分以外，该参照物与根据本发明(“正研究的”)的多 肽、融合多肽、轭合物、组合物、缔合物、纳米颗粒或微粒是相同的。优选 地，该参照物的白蛋白部分包括白蛋白(例如HSA，SEQ ID NO:2)或其片 段，或者由它们组成。参照物的白蛋白部分的氨基酸序列可以比根据本发明 的多肽、融合多肽、轭合物、组合物、缔合物、纳米颗粒或微粒的白蛋白部 分的氨基酸序列在长度上更长、更短或优选相同(±1至15个氨基酸)。
等同的氨基酸位置：贯穿本说明书，氨基酸位置是相对于全长成熟人血 清白蛋白(即，没有前导序列，SEQ ID NO:2)来限定的。然而，技术人员 理解本发明还涉及非人类白蛋白的变体，例如在此披露的那些，和/或人类白 蛋白或非人类白蛋白的片段。可以通过使用成对(例如ClustalW)或多重(例 如MUSCLE)比对来比较氨基酸序列从而鉴别在人血清白蛋白片段中、在动 物白蛋白中以及在其片段、融合物和其他衍生物或变体中的等同位置。例 如，图1显示等同于全长人血清白蛋白的500、550和573的位置是易于在人血 清白蛋白的片段中以及在其他物种的白蛋白中鉴别的。位置500、550和573是 由箭头指示。进一步的细节提供于下表中。
鉴别在HSA、动物白蛋白和白蛋白片段中的等同位置的实例
图1是通过MUSCLE使用包括以ClustalW1.81格式输出的缺省参数而生成 的。将原始输出数据使用BoxShade3.21进行遮掩(shade) (http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)，使用输出格式： RTF_new；字体大小：10；一致行(consensus line)：无一致行；序列分数 (必须服从遮掩)：0.5；输入序列格式：ALN。因此，贯穿本说明书，在人 血清白蛋白中限定的氨基酸位置还适用于人血清白蛋白的片段、衍生物或变 体以及融合物，来自其他物种的动物以及其片段和融合物中的等同位置。此 类等同位置可以具有(i)在其天然蛋白质中的不同的残基数和/或(ii)在其天然 蛋白质中不同的天然氨基酸。
同样，图2显示等同位置可以被鉴别为参照SEQ ID NO:2(HSA)的白蛋 白的片段(例如，结构域)。
变体命名惯例
出于本发明的目的，将SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽用以确定另一种 白蛋白中的对应的氨基酸残基。将另一种白蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO: 2中披露的成熟多肽比对，并且基于该比对，使用如EMBOSS软件包 (EMBOSS：欧洲分子生物学开发软件套件，赖斯等人，2000，《遗传学趋 势》16:276-277)(优选版本3.0.0或更新版本，更优选版本5.0.0或更新版 本)的尼德尔程序所实施的尼德曼-翁施算法(尼德曼和翁施，1970，《分子 生物学杂志》48:443-453)确定与SEQ ID NO:2中所披露的成熟多肽的任何氨 基酸残基相对应的氨基酸位置号。
可以通过使用一种合适的计算机程序、使用其对应缺省参数比对多个多 肽序列来确定或确认在另一种白蛋白中的相应氨基酸残基的鉴别，所述计 算机程序包括但不限于“ClustalW”(拉金(Larkin)等人，2007，《生物 信息学》23:2947-2948)，MUSCLE(通过对数预期的多重序列比较；版 本3.5或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，《核酸研究》(Nucleic Acids Research)32:1792-1797)、MAFFT(版本6.857或更新版本；加藤 (Katoh)和库马(Kuma)，2002，《核酸研究》30:3059-3066；加藤等 人，2005，《核酸研究》33:511-518；加藤和都(Toh)，2007，《生物信 息学》23:372-374；加藤等人，2009，《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biology)537:39-64；加藤和都，2010，《生物信息学》26:1899- 1900)、以及采用ClustalW(1.83或更新版本；汤姆斯(Thompson)等人， 1994，《核酸研究》22:4673-4680)的EMBOSS EMMA。
当其他多肽(或蛋白质)与SEQ ID NO：2的成熟多肽相背离使得传统的 基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛弗松 (Elofsson)，2000，《分子生物学杂志》)295：613-615)，可应用其他成 对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获 得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(谱)来搜索数据库。例如，PSI- BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同 源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，《核酸研究》25:3389-3402)。如 果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个(若干个)代 表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序如GenTHREADER(琼斯 (Jones)，1999，《分子生物学杂志》287:797-815；麦古芬(McGuffin)和 琼斯，2003，《生物信息学》19:874-881)利用来自不同来源(PSI- BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询 序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000， 《分子生物学杂志》313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在 于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模 型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定这类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例 如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并 且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(奥尔姆(Holm)和桑德 (Sander)，1998，《蛋白质》(Proteins)33:88-96)或者组合延伸(山的 亚罗夫(Shindyalov)和伯恩(Bourne)，1998，《蛋白质工程》11:739- 747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询 具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，奥尔姆 和帕克(Park)，2000，《生物信息学》16:566-567)。
在描述本发明的白蛋白变体中，以下所述的命名法适于方便参考。使用 公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。术语‘点突变’和/或‘改变’包 括缺失、插入和取代。
取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的 氨基酸。因此，例如在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为 “Thr226Ala”或者“T226A”。多重突变(或改变)由加号(“+”)分开， 例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表分别在位置205和 位置411处甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代，并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸 (F)取代。图中还使用(“/”)例如“E492T/N503D”，这应该被视为与 (“+”)是可互换的。
缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置*。因 此，在位置195处的甘氨酸缺失表示为“Gly195*”或者“G195*”。多重缺失 通过加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+ S411*”。
插入。如上所披露的，插入可以是在占据一个位置的氨基酸(‘指定 (或原始)氨基酸’，‘X’)的N-侧(‘上游’，‘X-1’)或C-侧(‘下 游’，‘X+1’)。
对于向原始氨基酸(‘X’)的C-侧(‘下游’，‘X+1’)的氨基酸 插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。 因此，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸被表示为“Gly195GlyLys”或者 “G195GK”。多重氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基 酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，在位置195处的甘氨酸 之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为“Glyl95GlyLysAla”或“G195GKA”。
在这类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残 基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行 编号。在以上实例中，该序列因此将是：
亲本： 变体：
195 195 195a 195b
G G-K-A
对于向原始氨基酸(X)的N-侧(‘上游’，‘X-1’)的氨基酸插入， 使用以下命名法：原始氨基酸、位置、插入的氨基酸、原始氨基酸。因此， 在位置195处的甘氨酸(G)之前插入赖氨酸(K)被表示为 “Gly195LysGly”或者“G195KG”。多重氨基酸的插入被表示为[原始氨基 酸、位置、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等，原始氨基酸]。例如，在 位置195处的甘氨酸之前插入赖氨酸(K)和丙氨酸(A)被表示为 “Gly195LysAlaGly”或“G195KAG”。在这类情况下，通过将具有角分符 号的小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之后的氨基酸残基的 位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中， 该序列因此将是：
亲本： 变体：
195 195a’ 195b’ 195
G K-A-G
多重改变。包含多重改变的变体由加号(“+”)分开，例如 “Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195 处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
不同的改变(例如取代)。在可以在一个位置处引入不同改变(例如取 代)的情况下，这些不同的改变(例如取代)由逗号分开，例如 “Arg170Tyr,Glu”代表在位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此， “Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：
“Tyrl67Gly+Argl70Gly”、“Tyrl67Gly+Argl70Ala”、 “Tyrl67Ala+Argl70Gly”、以及“Tyrl67Ala+Argl70Ala”。
发明详细说明
本发明涉及白蛋白变体，这些白蛋白变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽 的结构域I中位置处的改变以及结构域III中位置处的改变，或者其他白蛋白或 其片段的等同位置处的改变。
变体
本发明的第一方面提供了是亲本白蛋白的变体白蛋白或其片段的多肽、 或者包含变体白蛋白或其片段的融合多肽，包含在白蛋白(例如HSA(SEQ ID NO:2))的结构域I中的一个或多个(若干个)改变、以及在白蛋白(例 如HSA(SEQ ID NO:2))的结构域III中的一个或多个(若干个)改变。
优选的是亲本白蛋白和/或变体白蛋白包括以下项或由以下项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列一致性的一种多肽；
(b)由在低严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或 者(ii)(i)的全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一种多肽；
(c)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％一致性的一种 多核苷酸编码的一种多肽；和/或
(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个片段。
白蛋白变体或其片段、或者包含白蛋白或其片段的融合多肽包括：在 SEQ ID NO:2的成熟多肽的结构域I中位置处的一个或多个(若干个)改变例 如取代、缺失或插入，以及在结构域III中位置处的一个或多个(若干个)改 变例如取代、缺失或插入，或者在其他白蛋白或其变体或片段的等同位置处 的改变。除了在此所述的改变之外，还可以引入终止密码子，并且是在位置 574处或更下游处(例如，在SEQ ID NO:2中，它被引入在位置574至585)引 入。
根据本发明的变体白蛋白、其片段、或包含变体白蛋白或其片段的融合 多肽的白蛋白部分大体上具有与SEQ ID NO:2所示的HSA的序列至少60％、优 选至少70％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少90％、更优选至少 95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％并且最优选至少 99％的序列一致性。该变体具有与SEQ ID NO:2的少于100％的一致性。
根据本发明的变体白蛋白、其片段、或包含变体白蛋白或其片段的融合 多肽的白蛋白部分大体上具有与亲本白蛋白的序列至少60％、优选至少70％、 优选至少80％、优选至少85％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少 96％、更优选至少97％、更优选至少98％并且最优选至少99％的序列一致性。 该变体具有与亲本白蛋白的序列少于100％的一致性。
在一个方面，相对于SEQ ID NO:2或相对于亲本白蛋白的序列，在本发 明的变体中的改变数目是1至20个，例如1至10个和1至5个，例如1、2、3、 4、5、6、7、8、9或10个改变。
在结构域I中的一个或多个(若干个)改变可以选自相应于HSA(SEQ ID NO:2)的78至88(即78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88)和 /或105至120(即105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、 115、116、117、118、119、120)的位置的位置。在HSA中，位置78至88形 成一个环，并且位置105至120形成一个环。因此，在其他白蛋白的等同环中 的位置也被包含于本发明中。优选的残基是残基81至85，特别是82和83，以 及残基110至114，特别是111和112。
在SEQ ID NO:2的位置82(或其他白蛋白或其片段变体的等同位置) 处，优选的是该改变是一个取代，例如，从天然氨基酸成为A、C、D、E、 F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y，更优选的是成为 Q、D或A，甚至更优选的是成为D或A，并且最优选的是成为A。在SEQ ID NO:2中，在位置82处的天然氨基酸是谷氨酸，因此到谷氨酸的取代不是优选 的。
在SEQ ID NO:2的位置83(或其他白蛋白或其片段变体的等同位置) 处，优选的是该改变是一个取代，例如，从天然氨基酸成为A、C、D、E、 F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y，更优选的是成为 N、K或S，甚至更优选的是成为N或K，并且最优选的是成为N。在SEQ ID NO:2中，在位置82处的天然氨基酸是苏氨酸，因此到苏氨酸的取代不是优选 的。
在SEQ ID NO:2的位置111(或其他白蛋白或其片段变体的等同位置) 处，优选的是该改变是一个取代，例如，从天然氨基酸成为A、C、D、E、 F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y，更优选的是成为 N、E、Q、D、G或H，甚至更优选的是成为E或Q，并且最优选的是成为E。 在SEQ ID NO:2中，在位置111处的天然氨基酸是天冬酰胺，因此到天冬酰胺 的取代不是优选的。
在SEQ ID NO:2的位置112(或其他白蛋白或其片段变体的等同位置) 处，优选的是该改变是一个取代，例如，从天然氨基酸成为A、C、D、E、 F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y，更优选的是成为 F、Y或W，甚至更优选的是成为F或Y，并且最优选的是成为F。在SEQ ID NO:2中，在位置112处的天然氨基酸是亮氨酸，因此到亮氨酸的取代不是优 选的。
在SEQ ID NO:2的位置573(或其他白蛋白或其片段变体的等同位置) 处，优选的是该改变是一个取代，例如，从天然氨基酸成为A、C、D、E、 F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y，更优选的是成为 P、Y、W、H、F、T、I或V，甚至更优选的是成为P、Y或W，并且最优选的 是成为P。在SEQ ID NO:2中，在位置573处的天然氨基酸是赖氨酸，因此到 赖氨酸的取代不是优选的。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置82和83(或其他白蛋白或其片段变体的等同位置)处 的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置82和111(或其他白蛋白或其片段变体的等同位置)处 的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置82和112(或其他白蛋白或其片段变体的等同位置)处 的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置82和573(或其他白蛋白或其片段变体的等同位置)处 的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置83和111(或其他白蛋白或其片段变体的等同位置)处 的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置83和112(或其他白蛋白或其片段变体的等同位置)处 的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置83和573(或其他白蛋白或其片段变体的等同位置)处 的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置111和112(或其他白蛋白或其片段变体的等同位置) 处的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置111和573(或其他白蛋白或其片段变体的等同位置) 处的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置112和573(或其他白蛋白或其片段变体的等同位置) 处的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置82、83和111(或其他白蛋白或其片段变体的等同位 置)处的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置82、83、112(或其他白蛋白或其片段变体的等同位 置)处的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置82、83和573(或其他白蛋白或其片段变体的等同位 置)处的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置82、111和112(或其他白蛋白或其片段变体的等同位 置)处的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置82、111和573(或其他白蛋白或其片段变体的等同位 置)处的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置82、112和573(或其他白蛋白或其片段变体的等同位 置)处的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置83、111和112(或其他白蛋白或其片段变体的等同位 置)处的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置83、111和573(或其他白蛋白或其片段变体的等同位 置)处的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置83、112和573(或其他白蛋白或其片段变体的等同位 置)处的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置111、112和573(或其他白蛋白或其片段变体的等同位 置)处的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置82、83、111、和112(或其他白蛋白或其片段变体的 等同位置)处的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置82、83、111、和573(或其他白蛋白或其片段变体的 等同位置)处的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置82、83、112、和573(或其他白蛋白或其片段变体的 等同位置)处的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置82、111、112、和573(或其他白蛋白或其片段变体的 等同位置)处的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置83、111、112、和573(或其他白蛋白或其片段变体的 等同位置)处的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置82、83、111、112、和573(或其他白蛋白或其片段变 体的等同位置)处的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置425和573(或其他白蛋白或其片段变体的等同位置) 处的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置505和573(或其他白蛋白或其片段变体的等同位置) 处的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置527和573(或其他白蛋白或其片段变体的等同位置) 处的改变，例如取代。
白蛋白变体可以包含白蛋白、其变体或片段的SEQ ID NO:2(尤其是 SEQ ID NO:2)的位置534和573(或其他白蛋白或其片段变体的等同位置) 处的改变，例如取代。
特别优选的白蛋白变体包括取代T83N/N111E(例如SEQ ID NO:32)； T83N/N111E/K573P(例如SEQ ID NO:33)；T83N/K573P(例如SEQ ID NO: 34)；T83K/K573P(例如SEQ ID NO:38)；E82A/K573P(例如SEQ ID NO: 39)；L112F/K573P(例如SEQ ID NO:40)；E82D/K573P(例如SEQ ID NO: 43)；P110G/K573P(例如SEQ ID NO:44)；N111D/K573P(例如SEQ ID NO:60)；N111G/K573P(例如SEQ ID NO:61)；N111H/K573P(例如SEQ ID NO:62)；E425A/K573P(例如SEQ ID NO:64)；E505Q/K573P(例如 SEQ ID NO:65)；T527M/K573P(例如SEQ ID NO:66)；N111E/K573P(例 如SEQ ID NO:68)；K534V/K573P(例如SEQ ID NO:73)；N111Q/K573P (例如SEQ ID NO:74)，是参照HSA(SEQ ID NO:2)描述的。其他优选的 白蛋白变体包括不是HSA(SEQ ID NO:2)的白蛋白中的等同取代。
另外，根据本发明的白蛋白变体可以包括在选自以下的位置处的一个或 多个(若干个)改变：HSA(SEQ ID NO:2)的78至88(78、79、80、81、 82、83、84、85、86、87、88、89、90、91)和/或105至120(105、106、 107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、 120)和/或425、505、510、512、524、527、531、534、569、575或其他白蛋 白的等同位置。优选的改变是取代，例如在本发明的第一方面中针对这些位 置描述的那些。特别优选的取代包括：D108A(SEQ ID NO:59)；D108E (例如SEQ ID NO:70)；N109K(例如SEQ ID NO:69)；P110G(例如SEQ ID NO:42)；N111D(例如SEQ ID NO:46)；N111E(例如SEQ ID NO: 67)；N111G(例如SEQ ID NO:48)；N111H(例如SEQ ID NO:49)； N111K(例如SEQ ID NO:54)；L112F(例如SEQ ID NO:37)；E425A(例 如SEQ ID NO:63)；E425K(例如SEQ ID NO:55)；E505Q(例如SEQ ID NO:45)；H510D(例如SEQ ID NO:57)；D512E(例如SEQ ID NO:50)； K524A(例如SEQ ID NO:51)；T527A(例如SEQ ID NO:52)；T527M(例 如SEQ ID NO:47)；E531H(例如SEQ ID NO:53)；K534V(例如SEQ ID NO:56)；A569S(例如SEQ ID NO:58)；L575F(例如SEQ ID NO:72)； E82A(例如SEQ ID NO:36)；E82D(例如SEQ ID NO:41)；T83K(例如 SEQ ID NO:35)；T83N(例如SEQ ID NO:71)，是参照HSA(SEQ ID NO: 2)描述的。其他优选的包括一个或多个(若干个)改变的白蛋白变体可以包 括不是HSA(SEQ ID NO:2)的白蛋白中的等同取代。
优选的是，与相应的亲本或参照白蛋白、其片段、或包含变体白蛋白或 其片段的融合多肽相比，变体白蛋白、其片段、或包含该变体白蛋白或其片 段的融合多肽对FcRn具有改变的结合亲和力和/或具有改变的血浆半衰期和/或 对FcRn的改变的结合亲和力。
在一个特别优选的实施例中，亲本或参照白蛋白是HSA(SEQ ID NO: 2)，并且与HSA、相应的片段、或包含HSA或其片段的融合多肽相比，变体 白蛋白、其片段、或包含该变体白蛋白或其片段的融合多肽对FcRn具有改变 的结合亲和力和/或具有改变的血浆半衰期和/或对FcRn的改变的结合亲和力。
在白蛋白和其受体的结合与血浆半衰期之间的相关性已经由诸位发明人 基于HSA D494N的天然存在的等位体提出。先前诸位发明人已经分析了该等 位体并且发现，与WT HSA对FcRn的亲和力相比，它具有与其受体FcRn的更 低的亲和力。
另外，已经披露了其天然小鼠FcRn被人类FcRn替换的转基因小鼠具有比 正常小鼠更高的血清白蛋白水平(《实验医学杂志》(J Exp Med.)(2003) 197(3):315-22)。先前诸位发明人已经发现与小鼠FcRn对小鼠血清白蛋白的 亲和力相比，人类FcRn具有对小鼠血清白蛋白的更高的亲和力，并且因此， 在转基因小鼠中观察到的血清白蛋白的增加相对应于血清白蛋白与其受体之 间的更高的亲和力，确认了在白蛋白结合FcRn与血浆半衰期之间的相关性。 此外，已经显示在小鼠模型中，很少或不结合至FcRn的白蛋白变体具有减少 的半衰期，科那诺娃(Kenanova)等人(2009)《核医学杂志》(J.Nucl. Med.)50(增刊2):1582)。
确定变体白蛋白对FcRn的亲和力是否高于或低于亲本或参照白蛋白的一 种方式是使用如下所述的表面等离振子共振测定(SPR)。技术人员将理解其 他方法可以用于确定变体白蛋白对FcRn的亲和力是否高于或低于亲本或参照 白蛋白FcRn的亲和力，例如确定和比较结合常数KD。在第一分子(例如配 体)与第二分子(例如受体)之间的结合亲和力(KD)是针对缔合(结合速 率，ka)和解离(解离速率，kd)的动力学常数的函数，依据KD＝kd/ka。因 此，根据本发明，认为具有比对于天然HSA的KD更低的KD的变体白蛋白具 有比HSA更高的血浆半衰期，并且认为具有比对于天然HSA的KD更高的KD 的变体白蛋白具有比HSA更低的血浆半衰期。
在本发明的一个实施例中，与亲本或参照白蛋白、其片段或包含该亲本 或参照白蛋白或其片段的融合多肽的血浆半衰期相比，根据本发明的白蛋白 变体或其片段、或包含变体白蛋白或其片段的融合多肽具有更长的血浆半衰 期和/或对FcRn的更强的结合亲和力。
在另外一个实施例中，与亲本或参照白蛋白、其片段或包含该亲本或参 照白蛋白或其片段的融合多肽的血浆半衰期相比，根据本发明的白蛋白变体 或其片段、或包含变体白蛋白或其片段的融合多肽具有更短的血浆半衰期和/ 或对FcRn的更弱的结合亲和力。
除了在结构域I(例如如在此所述的在环78至88内和/或在环105至120 内)和III(或其他白蛋白或其片段变体的等同位置)中的位置处的改变之 外，根据本发明的变体白蛋白或其片段、或包含变体白蛋白或其片段的融合 多肽还可以包含在分子的其他位置中的另外的取代、缺失或插入。此类另外 的取代、缺失或插入可以是有用的，以便改变分子的其他特性，例如但不限 于改变的糖基化，引入表面的反应性基团如巯基，去除/生成氨甲酰化位点 等。
可以被改变以提供表面上的反应性残基并且可以有利地应用于本发明的 残基已经披露于WO 2010/092135中(通过引用结合在此)中。特别优选的残 基包括相应于SEQ ID NO:2中的位置的位置。
可以在SEQ ID NO:2中或在其他白蛋白的相应位置中作出改变以便提供 表面上的反应性巯基的实例包括相应于SEQ ID NO:2中的以下改变的改变： L585C、D1C、A2C、D562C、A364C、A504C、E505C、T79C、E86C、 D129C、D549C、A581C、D121C、E82C、S270C、A578C、L595LC、 D1DC、A2AC、D562DC、A364AC、A504AC、E505EC、T79TC、E86EC、 D129DC、D549DC、A581AC、A581AC、D121DC、E82EC、S270SC、 S579AC、C360*、C316*、C75*、C168*、C558*、C361*、C91*、C124*、 C169*和C567*。可替代地，可以将半胱氨酸残基添加至白蛋白的N端或C端。 术语‘反应性硫醇’意指和/或包括由Cys提供的尚未通过二硫键与一个半胱氨酸 键合的巯基和/或空间上可获得用于结合至一个配伍物例如轭合配伍物的巯 基。
融合多肽
本发明的第二方面涉及融合多肽。因此，根据本发明的白蛋白变体或其 片段可以与非白蛋白多肽融合配伍物融合。在原则上融合配伍物可以是任何 多肽，但通常优选的是该融合配伍物是一种具有治疗、预防(包括疫苗)、 诊断、成像或其他有益特性的多肽。此类特性可以指的是‘药学上有益的特 性’。包含白蛋白或其片段的融合多肽在本领域中是已知的。已经发现与单 独的未融合的融合配伍物多肽相比，包含白蛋白或其片段以及融合配伍物多 肽的此类融合多肽具有更长的血浆半衰期。根据本发明，有可能相比于现有 技术的相应融合多肽改变根据本发明的融合多肽的血浆半衰期。‘改变’包 括增加血浆半衰期和减少血浆半衰期两者。增加血浆半衰期是优选的。本发 明允许将半衰期定制到一个所希望的期限。
一种或多种(若干种)治疗的、预防(包括疫苗)的、诊断的、成像的 或其他有益的可以融合至白蛋白的N-端、C-端，插入到白蛋白结构中的环 中，或其任何组合。它可以包括或可以不包括将融合多肽的不同组分分离的 接头序列。
与白蛋白或其片段的融合物相关的传授在本领域中是已知的，并且技术 人员将理解此类传授也可以适用于本发明。WO 2001/79271 A(特别是第9页 和/或表1)、WO 2003/59934(特别是表1、WO 03/060071(特别是表1)和 WO 01/079480(特别是表1)(各自通过引用以其全文结合于此)还包含可以 融合至白蛋白或其片段的治疗的、预防的(包括疫苗)、诊断的、成像的或 其他有益的多肽的实例，并且这些实例也适用于本发明。
对于本发明的第二方面的进一步的优选方面包括本发明的第一方面的那 些和在下文本发明的第十二方面提供的那些。技术人员理解本发明的任何方 面可以与本发明的其他一方面或多方面和/或与本发明的多方面的一个或多个 (若干个)优选方面和/或在此作出的其他披露组合。
多核苷酸
本发明的第三方面涉及对本发明的变体或融合多肽进行编码的分离的多 核苷酸。该多核苷酸可以是一种分离的多核苷酸。该多核苷酸可以被包含在 载体(例如质粒)中和/或宿主细胞中。
对于本发明的第三方面的进一步的优选方面包括本发明的第一方面的那 些和在下文本发明的第十二方面提供的那些。技术人员理解本发明的任何方 面可以与本发明的其他一方面或多方面和/或与本发明的多方面的一个或多个 (若干个)优选方面和/或在此作出的其他披露组合。
核酸构建体
本发明的第四方面涉及包括对可操作地连接至一个或多个(若干个)控 制序列上的本发明的一种变体或融合多肽的进行编码的一种多核苷酸的核酸 构建体，这些控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在一种合适 的宿主细胞中的表达。
可以按多种方式来操纵多核苷酸以提供一种变体的表达。取决于表达载 体，在插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组 DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是一个启动子序列，即由一个宿主细胞识别用于表达该多 核苷酸的一种序列。启动子序列包含介导变体表达的转录控制序列。该启动 子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何核酸序列，包括突变体、截短 的及杂合启动子，并且可以是从编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细 胞内多肽的基因获得。
在酵母宿主中，有用的启动子是获得自酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿 酒酵母蛋白酶A(PRA1)、酿酒酵母蛋白酶B(PRB1)、酿酒酵母翻译延伸 因子(TEF1)、酿酒酵母翻译延伸因子(TEF2)、酿酒酵母半乳糖激酶 (GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1， ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸甘油醛异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白 (CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因。用于酵母宿主细胞的其 他有用的启动子由罗马努斯(Romanos)等人，1992，《酵母》(Yeast) 8:423-488描述。
技术人员知道用于水稻和哺乳动物细胞(例如CHO或HEK)中有用的启 动子。在水稻宿主中，有用的启动子获得自花椰菜花叶病毒35S RNA基因 (CaMV35S)、玉米醇脱氢酶(Adh1)和αAmy3。
在哺乳动物宿主细胞中，例如CHO或HEK中，有用的启动子是获得自巨 细胞病毒(CMV)和CAG杂合启动子(CMV早期增强子元件与鸡β-肌动蛋白 启动子的杂合体)、猴空泡病毒40(SV40)。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的合适的转录终止子序 列。该终止子序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’-端。可以使 用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。
用于酵母宿主细胞的优选终止子获得自酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞 色素C(CYC1)、酿酒酵母醇脱氢酶(ADH1)以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸 脱氢酶的基因。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马努斯等人， 1992，见上文描述。技术人员知道用于水稻和哺乳动物细胞(例如CHO或 HEK)中有用的终止子。例如，在水稻宿主中，优选的终止子是获得自根瘤 土壤杆菌胭脂碱合酶(Nos)和花椰菜花叶病毒35S RNA基因 (CaMV35S)。
控制序列还可以是合适的前导序列，即对宿主细胞翻译而言重要的 mRNA的非翻译区。前导序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’- 端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导序列。
适用于酵母宿主细胞的前导子是从酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵 母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸 脱氢酶(ADH2/GAP)的基因获得。
该控制序列还可以是一种多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体 编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所 转录的mRNA上的一个信号的一种序列。在宿主细胞中起作用的任何多腺苷 酸化序列都可以使用。
可用于酵母宿主细胞的多腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼 (Sherman)，1995，《分子细胞生物学》(Mol.Cellular Biol.)15:5983- 5990中得以描述。
该控制序列还可以是信号肽编码区，编码与变体的N-端连接的信号肽， 并且引导该变体进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有 地包含信号肽编码区，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编 码区的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5’-端可包含对编码序 列而言为外来的信号肽编码区。当编码序列天然地不包含信号肽编码区时， 外源信号肽编码区可能是需要的。可替代地，外源信号肽编码区可简单地替 换天然信号肽编码区以增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进 入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区。
用于酵母宿主细胞的有用的信号肽是从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化 酶的基因获得。其他有用的信号肽编码序列由罗马努斯等人，1992，见上文 描述。技术人员知道用于水稻和哺乳动物细胞(例如CHO或HEK)中有用的 信号肽。
在变体的N-端处信号肽区和前肽区都存在的情况下，前肽区被定位成紧 邻变体的N-端并且信号肽区被定位成紧邻前肽区的N-端。
对于本发明的第四方面的进一步的优选方面包括本发明的第一方面的那 些和在下文本发明的第十二方面提供的那些。技术人员理解本发明的任何方 面可以与本发明的其他一方面或多方面和/或与本发明的多方面的一个或多个 (若干个)优选方面和/或在此作出的其他披露组合。
变体的制备
本发明的第五方面涉及一种用于制备或获得变体白蛋白或其片段、或包 含变体白蛋白或其片段的融合多肽、或变体白蛋白或其片段的缔合物的方 法，该方法包括：
(a)向亲本白蛋白或其片段、或包含亲本白蛋白或其片段的融合多肽引入 在结构域I中的一个或多个(若干个)改变以及在结构域III中的一个或多个 (若干个)改变；并且
(b)回收变体白蛋白或其片段、或包含变体白蛋白或其片段的融合多肽。
优选的改变是如关于本发明的第一方面中描述的。与参照物(例如不包 含改变的亲本白蛋白或片段)的FcRn-结合亲和力相比，所得变体白蛋白或其 片段可以具有改变的FcRn-结合亲和力。更优选地，所得变体白蛋白或其片段 具有更强的FcRn-结合亲和力。
本发明包括一种用于制备一种多肽的方法，该多肽是白蛋白的一种变 体、其片段、或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，该多肽与参照 白蛋白、其片段或融合物对FcRn的结合亲和力相比具有对FcRn的改变的结合 亲和力，该方法包括：
(a)提供对一种亲本白蛋白进行编码的一种核酸，该亲本白蛋白例如是 一种具有与SEQ ID NO:2至少60％的序列一致性的白蛋白；
(b)修饰步骤(a)的序列以编码一种多肽，该多肽是一种变体白蛋白、 其片段、或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，包括：
(i)在相应于该亲本白蛋白的结构域I中的一个或多个(若干个)位置以 及结构域III(结构域3)中的一个或多个(若干个)位置的位置处的改变；或
(ii)在相应于SEQ ID NO:2的结构域I的位置78至120中的任一个的一个或 多个(若干个)的位置处或相应于SEQ ID NO:2的结构域III的位置425、 505、510、512、524、527、531、534、569、573、575中的任一个的一个或 多个(若干个)的位置处的改变；
(c)可任选地将步骤(b)的修饰序列引入一种合适的宿主细胞中；
(d)可任选地使这些细胞在一种合适的生长培养基中在导致该多肽表达的 条件下生长；并且
(e)可任选地将该多肽从该生长培养基中进行回收；
其中该多肽具有对FcRn改变的结合亲和力，和/或与一种亲本白蛋白、参 照白蛋白、其片段、或者包含所述亲本白蛋白、参照白蛋白或其片段或融合 物的融合多肽的半衰期相比具有改变的血浆半衰期。
优选的是亲本白蛋白和/或变体白蛋白包括以下项或由以下项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列一致性的一种多肽；
(b)由在低严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或者 (ii)(i)的全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一种多肽；
(c)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％一致性的一种多 核苷酸编码的一种多肽；和/或
(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个片段。
这些变体可以由技术人员使用本领域已知的任何诱变程序来制备，例如 定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是这样一种技术，该技术是在编码亲本的多核苷酸中的一个或 多个(若干个)定义的位点上创造一个或多个(例如若干个)突变(改 变)。
通过涉及含有所希望的突变的寡核苷酸引物的使用的PCR可以体外实现 定点诱变。还可以通过以下方式在体外进行定点诱变：涉及由一种限制性内 切酶在包含编码该亲本的多核苷酸的质粒的一个位点处进行切割的盒式诱 变，并且随后连接一种包含该多核苷酸中的突变的寡核苷酸。通常，消化该 质粒与该寡核苷酸的限制性内切酶是相同的，以允许该质粒与另一者连接以 及插入另一者中。参见，例如，谢勒(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979， 《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76:4949-4955；以及巴 顿(Barton)等人，1990，《核酸研究》18:7349-4966。
还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见，例如，美国专 利申请公开号2004/0171154；斯道瑞希(Storici)等人，2001，《自然生物技 术》(Nature Biotechnol.)19:773-776；卡伦(Kren)等人，1998，《自然医 学》(Nat.Med.)4:285-290；以及凯利萨诺(Calissano)和马奇诺 (Macino)，1996，《真菌遗传学简讯》(Fungal Genet.Newslett.)43:15- 16。
在本发明中可以使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的很多可 商购的试剂盒。
合成基因构建需要体外合成一种设计的多核苷酸分子以编码一种所感兴 趣的多肽。可以利用多种技术进行基因合成，如由田(Tian)等人(2004， 《自然》432:1050-1054)描述的基于多重微芯片的技术以及其中在光可编程 的微流体芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和 /或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森 (Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，《科学》(Science)241:53- 57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl. Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。 其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如洛曼(Lowman)等 人，1991，《生物化学》30:10832-10837；美国专利号5,223,409、WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，《基 因》46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA7:127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达 的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯等人，1999，《自然生物技术》17:893- 896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领 域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸 残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的 多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是，利用合成的多核苷 酸片段的一个过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而 其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以经受易 错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
对于本发明的第五方面的进一步的优选方面包括本发明的第一方面的那 些和在下文本发明的第十二方面提供的那些。技术人员理解本发明的任何方 面可以与本发明的其他一方面或多方面和/或与本发明的多方面的一个或多个 (若干个)优选方面和/或在此作出的其他披露组合。
产生方法
本发明的第六方面涉及制备根据本发明的变体的方法。本发明的变体可 以使用对于技术人员熟知的技术来制备。一个便利的方式是通过克隆编码亲 本白蛋白或其片段、或包含白蛋白或其片段的融合多肽的核酸，修饰所述核 酸以在SEQ ID NO:2的成熟多肽的结构域I和结构域III中的位置处(或在其他 白蛋白或其片段中的等同位置处)引入所希望的一个或多个取代，制备一种 合适的基因构建体(其中修饰的核酸被放置为与合适的调节基因元件如启动 子、终止子、活性位点、核糖体结合位点等操作性地连接)，将该基因构建 体引入合适的宿主生物中，将经转化的宿主生物在导致变体表达的条件下进 行培养，并且回收变体。所有的这些技术在本领域中均是已知的，并且设计 一种合适的制备根据本发明的特定变体的方法是在普通从业者的技术之内。
本发明的变体多肽还可以连接至信号序列，以便使得变体多肽在培养经 转化的宿主生物的过程中分泌进生长培养基中。通常有利的是使变体多肽分 泌进生长培养基中以便回收和纯化。
用于制备变体多肽的技术还披露于WO 2009019314(通过引用被包括) 中，并且这些技术还可以适用于本发明。
白蛋白已经被成功地在一系列宿主中表达为重组蛋白质，这些宿主包括 真菌(包括但不限于曲霉属(WO 06066595)，克鲁维酵母菌属(弗列尔 (Fleer)1991，《生物/技术》(Bio/technology)9,968-975)、毕赤酵母属 (小林(Kobayashi)1998《治疗性成分单采》(Therapeutic Apheresis)2, 257-262)和酵母属(斯利普(Sleep)1990，《生物/技术》 (Bio/technology)8,42-46))，细菌(Pandjaitab2000，《变态临床免疫学 杂志》(J.Allergy Clin.Immunol.)105,279-285)，动物(巴拉什(Barash) 1993，《转基因研究》(Transgenic Research)2,266-276)和植物(包括但不 限于马铃薯和烟草(西蒙斯(Sijmons)1990，《生物/技术》 (Bio/technology)8,217和法兰(Farran)2002，《转基因研究》(Transgenic Research)11,337-346)以及水稻例如稻(Oryza sativa))以及哺乳动物细胞 例如CHO和HEK。本发明的变体多肽优选是重组地产生于合适的宿主细胞 中。原则上，可以使用任何能够以合适的量产生多肽的宿主细胞，并且选择 根据本发明的合适的宿主细胞是在普通从业者的技术之内。优选的宿主生物 是酵母，优选选自酵母菌属，更优选酿酒酵母。
可以使用已知的分离技术例如过滤、离心、色谱、以及亲和分离技术等 的组合，将本发明的变体多肽从生长培养基中进行回收并且纯化。将本发明 的变体使用此类已知的分离步骤的特定组合进行纯化是在普通从业者的技术 之内。作为一个可以应用于本发明的变体的纯化技术的实例，可提及WO 00/44772的传授。
本发明的变体多肽可以用于将治疗上有益的化合物(包括预防上有益的 化合物，例如疫苗)递送至对其有需要的动物或人类个体中。此类治疗上有 益的化合物包括但不限于用于诊断(例如各种成像技术)的标记和易于检测 的化合物；药学上的活性化合物，例如药物，或特异性结合部分例如抗体。 本发明的变体甚至可以连接至两种或更多种(若干种)不同的治疗上有益的 化合物，例如抗体和药物，这给予所组合的分子以特异性结合至所希望的靶 标并由此在该特定靶标处提供高浓度的连接药物的能力。
对于本发明的第六方面的进一步的优选方面包括本发明的第一方面的那 些和在下文本发明的第十二方面提供的那些。技术人员理解本发明的任何方 面可以与本发明的其他一方面或多方面和/或与本发明的多方面的一个或多个 (若干个)优选方面和/或在此作出的其他披露组合。
轭合物
本发明的第七方面涉及轭合物(轭合)。因此，使用本领域内已知的技 术，可将根据本发明的白蛋白变体或其片段或融合多肽轭合至第二分子 (‘轭合配伍物’)。轭合配伍物可以是治疗的、预防的(包括疫苗)、诊 断的、成像的或其他有益的部分。所述轭合配伍物可以是多肽或非多肽化学 品。轭合配伍物可以是多肽、化学品(例如，化学合成的药物)或核酸(例 如DNA、RNA、siRNA)。
所述第二分子可以包括诊断或成像部分，并且在此实施例中，轭合物可 以用作诊断工具，例如成像；或该第二分子可以是治疗或预防(例如疫苗) 化合物，并且在此实施例中，该轭合物可以用于治疗或预防(例如疫苗)目 的，其中该轭合物将具有该治疗或预防化合物的治疗或预防特性连同由轭合 物的白蛋白部分提供的希望的血浆半衰期。白蛋白和治疗分子的轭合物在本 领域中是已知的，并且已经证实与非轭合的游离治疗分子本身相比，此类轭 合物具有长的血浆半衰期。根据本发明，有可能相比于现有技术的相应轭合 物改变根据本发明的轭合物的对FcRn的结合亲和力和/或血浆半衰期。‘改变’ 包括增加血浆半衰期和减少血浆半衰期两者，和/或增加对FcRn的结合亲和力 和降低对FcRn的结合亲和力两者。优选的是增加血浆半衰期和/或对FcRn的结 合亲和力。使用熟知的化学法，轭合物可以便利地经由HSA的表面上存在的 游离巯基(成熟HSA的氨基酸残基34)来连接。
在一个特别优选的方面，变体白蛋白或其片段轭合至有益的治疗或预防 (包括疫苗)化合物，并且该轭合物用于治疗有需要的患者中的病症，该病 症对具体选择的治疗化合物有反应。用于将这种治疗上有用的化合物轭合至 变体白蛋白或其片段的技术是本领域中已知的。WO 2009/019314(通过引用 以其全文结合于此)披露了适合用于将治疗化合物轭合至多肽的技术的实 例，这些技术也可以适用于本发明。另外WO 2009/019314披露了可以轭合至 被取代的转铁蛋白的化合物和部分的实例，并且这些实例也可以适用于本发 明。WO 2009/019314的传授通过引用包括于此。
HSA包含处于其天然形式的一个游离巯基(在Cys34处)，该游离巯基 可以便利地用于轭合。作为在该方面内的具体实施例，变体白蛋白或其片段 可以包括被提供来产生表面上的其他游离巯基的另外的修饰。这具有以下益 处：变体白蛋白或其片段的有效载荷增加从而使得治疗(例如预防)化合物 的多于一个分子可以轭合至变体白蛋白或其片段的每个分子，或者两种或更 多种(若干种)不同的治疗化合物可以轭合至变体白蛋白或其片段的每个分 子，例如具有靶向特性的化合物(如针对例如肿瘤具有特异性的抗体)、以 及轭合至变体白蛋白或其片段由此创造一种针对肿瘤的高特异性药物的细胞 毒药物。可以被修饰来提供表面上的另外的游离巯基的具体残基的传授可以 发现于悬而未决专利申请WO 2010/092135中，将其通过引用结合。
轭合配伍物可以可替代地轭合至融合多肽(在此所述的)，以产生这样 一种分子，该分子包含融合至白蛋白的融合配伍物、连同轭合至相同白蛋白 的或甚至轭合至融合配伍物的轭合配伍物。
对于本发明的第七方面的进一步的优选方面包括本发明的第一方面的那 些和在下文本发明的第十二方面提供的那些。技术人员理解本发明的任何方 面可以与本发明的其他一方面或多方面和/或与本发明的多方面的一个或多个 (若干个)优选方面和/或在此作出的其他披露组合。
缔合物
本发明的第八方面涉及缔合物。因此，可以进一步以“缔合物”的形式 使用白蛋白变体或其片段或融合多肽。在这一点上，术语“缔合物”旨在意 指一种包含白蛋白变体或其片段以及通过非共价结合而结合或缔合至变体白 蛋白或其片段的其他化合物的化合物。作为这种缔合物的一个实例，可以提 及的是通过疏水作用由变体白蛋白和缔合至白蛋白的脂质组成的缔合物。此 类缔合物在本领域中是已知的，并且它们可以使用熟知的技术来制备。作为 优选的根据本发明的缔合物的实例，可以提及的是包含变体白蛋白和紫杉 烷、紫杉酚或紫杉酚衍生物(例如紫杉醇)的缔合物。缔合物的另外实例包 括治疗的、预防的(包括疫苗)、诊断的、成像的或其他有益的部分。
根据本发明的白蛋白缔合物的半衰期可以比单独的‘其他化合物’的半 衰期更长或更短。根据本发明的白蛋白缔合物的半衰期可以比类似的/等同的 白蛋白缔合物(包括参照白蛋白如天然HSA(而不是根据本发明的白蛋白变 体或衍生物)或由其组成)以及‘其他化合物’的半衰期更长或更短。同样 地，根据本发明的白蛋白缔合物对FcRn的结合亲和力可以比类似的/等同的白 蛋白缔合物(包括参照白蛋白如天然HSA(而不是根据本发明的白蛋白变体 或衍生物)或由其组成)以及‘其他化合物’对FcRn的结合亲和力更强或更 弱。用于制备缔合物的方法对于技术人员而言是熟知的，例如，HSA与脂-化 合物的配制(通过缔合)描述于侯赛因(Hussain)，R.和西利加尔迪 (Siligardi)，G.(2006)《肽研究与治疗国际杂志》(International Journal of Peptide Research and Therapeutics)，12卷，3期，311-315页。
对于本发明的第八方面的进一步的优选方面包括本发明的第一方面的那 些和在下文本发明的第十二方面提供的那些。技术人员理解本发明的任何方 面可以与本发明的其他一方面或多方面和/或与本发明的多方面的一个或多个 (若干个)优选方面和/或在此作出的其他披露组合。
组合物
本发明的第九方面涉及组合物。因此，本发明还针对白蛋白变体或其片 段、或包含变体白蛋白或其片段的融合多肽、或包含白蛋白变体或其片段的 轭合物、或包含白蛋白变体或其片段的缔合物用于制造一种药物组合物的用 途，其中与HSA或其相应片段、或包含HSA或其片段的融合多肽、或包含 HSA的轭合物相比，白蛋白变体或其片段、或包含变体白蛋白或其片段的融 合多肽、或包含白蛋白变体或其片段的轭合物、或包含白蛋白变体或其片段 的缔合物对FcRn具有改变的结合亲和力和/或改变的血浆半衰期。
在这一点上，HSA的相应片段旨在意指与待比较的变体白蛋白片段比对 的并且具有与待比较的变体白蛋白片段相同数目氨基酸的HSA片段。类似 地，包含HSA的相应融合多肽或包含HSA的轭合物旨在意指具有与待比较的 包含变体白蛋白的轭合物的融合多肽相同大小和氨基酸序列的分子。
该组合物可以包含药学上可接受的载体或赋形剂，例如水、聚山梨酯80 或在美国药典中针对人白蛋白指定的那些。
对于本发明的第九方面的进一步的优选方面包括本发明的第一方面的那 些和在下文本发明的第十二方面提供的那些。技术人员理解本发明的任何方 面可以与本发明的其他一方面或多方面和/或与本发明的多方面的一个或多个 (若干个)优选方面和/或在此作出的其他披露组合。
纳米颗粒
本发明的第十方面涉及包含如在此披露的变体、融合物、轭合物、缔合 物、纳米颗粒、组合物或多核苷酸的纳米颗粒。
将一种分子掺入纳米颗粒或微粒中的技术在本领域中是已知的。用于制 备可以应用于根据本发明的白蛋白、其变体、片段、融合物、轭合物或缔合 物的纳米颗粒或微粒的优选方法披露于WO 2004/071536或WO 2008/007146或 奥内尔(Oner)&格罗夫斯(Groves)(《药物研究》(Pharmaceutical Research)，10卷(9)，1993，1387至1388页)，将这些文献通过引用结合 于此。优选地，纳米颗粒的平均直径是从5至1000nm，更优选5、10、20、 30、40、50、80、100、130、150、200、300、400、500、600、700、800、 900、或999至5、10、20、30、40、50、80、100、130、150、200、300、 400、500、600、700、800、900、或1000nm。直径小于200nm并且更特别地 小于130nm的微粒的优点是经得起通过0.2μm(微米)过滤器的过滤除菌。 优选地，微粒的平均直径是从1000nm(1μm(微米))至100μm(微米)、 更优选从1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100至1、2、5、 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μm(微米)。
对于本发明的第十方面的进一步的优选方面包括本发明的第一方面的那 些和在下文本发明的第十二方面提供的那些。技术人员理解本发明的任何方 面可以与本发明的其他一方面或多方面和/或与本发明的多方面的一个或多个 (若干个)优选方面和/或在此作出的其他披露组合。
用途
本发明的第十一方面涉及变体白蛋白、其片段、融合物、或轭合物或其 纳米颗粒或缔合物的用途。用途可以是例如用于治疗、预防、诊断或成像的 方法中。根据本发明的变体白蛋白或其片段、或包含变体白蛋白或其片段的 融合多肽具有以下益处：与亲本或参照白蛋白或其片段、或包含亲本或参照 白蛋白或其片段的融合多肽相比，它们对FcRn的结合亲和力和/或血浆半衰期 得以改变。这具有以下优点：可以根据具体的治疗目的来选择根据本发明的 包含变体白蛋白或其片段的轭合物、或包含变体白蛋白或其片段的融合多 肽、或包含变体白蛋白或其片段的缔合物对FcRn的结合亲和力和/或血浆半衰 期。
在一些情况下，有利的是使用比参照分子或组合物具有更长血浆半衰期 的白蛋白、其变体、片段、融合物、轭合物、或缔合物或组合物，因为这可 以具有以下益处：与使用参照分子或组合物的情况下相比，白蛋白、其变 体、片段、融合物、轭合物或缔合物或组合物的给予将仅需要更少的频率或 降低的剂量(并且因此具有更少的副作用)。就变体、融合物、轭合物、缔 合物、纳米颗粒、组合物或多肽的用途而言，白蛋白部分可以包括如在此披 露的一个或多个改变。
在其他情况下，有利的是使用比参照分子或组合物具有更短血浆半衰期 的白蛋白、其变体、片段、融合物、轭合物、或缔合物或组合物，因为这可 以具有以下益处：与使用参照分子或组合物的情况下相比，白蛋白、其变 体、片段、融合物、轭合物或缔合物或组合物的给予可以按更高的剂量进 行，而伴随的益处是与如果使用参照分子或组合物的情况相比给予的化合物 更快速地从接受者清除。就变体、融合物、轭合物、缔合物、纳米颗粒、组 合物或多肽的用途而言，白蛋白部分可以包括如在此披露的一个或多个改 变。
例如，对用于动物或人类中的成像目的的轭合物、缔合物或融合多肽而 言，其中成像部分具有很短的半衰期并且包含HSA的轭合物或融合多肽具有 远远长于用于成像目的所需的血浆半衰期，有利的是使用与亲本或参照白蛋 白或其片段相比具有更短血浆半衰期的本发明的变体白蛋白或其片段，以提 供具有足够长的用于成像目的但足够短以便从特定施用患者体内清除的血浆 半衰期的融合多肽的轭合物。
在另一个实例中，对于包含有效治疗或缓解需要这种治疗的患者中的具 体病症的治疗化合物的轭合物、缔合物或融合多肽而言，有利的是使用与亲 本或参照白蛋白或其片段相比具有更长血浆半衰期的变体白蛋白或其片段， 以提供具有更长血浆半衰期的缔合物或轭合物或融合多肽，这将具有以下益 处：与使用亲本或参照白蛋白或其缔合物或其片段的情况下相比，本发明的 缔合物或轭合物或融合多肽的给予将仅需更少的频率或降低的剂量同时伴随 更少的副作用。例如，本发明提供了一种治疗个体中的增生性疾病的方法， 包括给予个体有效量的根据本发明的缔合物，其中该缔合物包括紫杉烷、紫 杉酚或紫杉酚衍生物(例如紫杉醇)。
在另外一方面，本发明涉及包含根据本发明的变体白蛋白、其缔合物或 其片段、变体白蛋白片段或其缔合物、或包含变体白蛋白或其片段的融合多 肽的组合物。这些组合物优选是药物组合物。该组合物可以使用领域中已知 的技术来制备，例如在制药领域内认可的手册中披露的。因为与参照分子的 相比，白蛋白、其变体、片段、融合物、轭合物或缔合物具有受调节的(即 更强的或更弱的和/或更长的或更短的)对FcRn的结合亲和力和/或血浆半衰 期，相对于包含参照分子(取代如在此所述的白蛋白、其变体、片段、融合 物、轭合物或缔合物)的等同组合物，该组合物还具有对FcRn的结合亲和力 和/或调节的(即改变的)血浆半衰期。该组合物可以是一种疫苗。根据本发 明的多肽可以是一种活性药物或赋形剂。可任选地，该组合物是以单位剂型 提供。
优选地，白蛋白、其变体、片段、融合物、轭合物或缔合物具有比参照 分子的血浆半衰期更长的血浆半衰期，例如除了白蛋白组分(例如白蛋白、 变体、片段、融合物、轭合物或缔合物)之外的相同的组合物是野生型白蛋 白(例如，HSA)、或变体、片段、融合物、轭合物或缔合物。
在一个具体实施例中，组合物包括根据本发明的变体白蛋白或其片段、 以及包含药学上的有益部分和白蛋白结合结构域(ABD)的化合物。根据本 发明，ABD意指这样的一个位点、部分或结构域，它能够结合至体内的循环 白蛋白并且由此赋予在ABD以及任何结合至所述ABD的化合物或部分的循环 中的运输。ABD是本领域中已知的，并且已经显示它非常紧密地结合至白蛋 白，所以包含结合至白蛋白的ABD的化合物将在一定程度上作为单一分子活 动。诸位发明人已经意识到，通过使用根据本发明的变体白蛋白或其片段连 同包含药学上的有益部分和ABD的化合物，使得有可能与将所述化合物本身 注射进有需要的患者中或以包含天然白蛋白或其片段的制剂给予的情况相比 而言改变化合物(包含药学上的有益部分和ABD)的对FcRn的结合亲和力和/ 或血浆半衰期。
还可以使用本领域中熟知的技术，将根据本发明的变体白蛋白或其片 段、包含变体白蛋白或其片段的轭合物、或包含变体白蛋白或其片段的融合 多肽、或包含变体白蛋白或其片段的缔合物掺入纳米颗粒或微粒中。用于制 备可以应用于根据本发明的变体白蛋白或其片段的纳米颗粒或微粒的优选方 法披露于WO 2004/071536或WO 2008/007146或奥内尔(Oner)&格罗夫斯 (Groves)(《药物研究》(Pharmaceutical Research)，10卷(9)，1993， 1387至1388页)，将这些文献通过引用结合于此。
对于本发明的第十一方面的进一步的优选方面包括本发明的第一方面的 那些和在下文本发明的第十二方面提供的那些。技术人员理解本发明的任何 方面可以与本发明的其他一方面或多方面和/或与本发明的多方面的一个或多 个(若干个)优选方面和/或在此作出的其他披露组合。
用于改变分子的FcRn-结合亲和力或半衰期的方法
本发明的第十二方面提供了一种用于改变分子的FcRn-结合亲和力或半 衰期的方法，包括：
(a)在该分子是多肽时，将该分子融合或轭合至在此披露的多肽或在此披 露的轭合物；将该分子缔合至在此披露的多肽或在此披露的轭合物；将该分 子掺入在此披露的纳米颗粒或在此披露的组合物中；
(b)在该分子不是多肽时，将该分子轭合至在此披露的多肽或在此披露的 轭合物；将该分子缔合至在此披露的多肽或在此披露的轭合物；将该分子掺 入在此披露的纳米颗粒或在此披露的组合物中。
‘分子’的实例包括在治疗、预防(包括在疫苗中作为活性药物成分或 作为赋形剂使用的那些)、成像和诊断中有用的那些，例如在此所述的那 些。
对于本发明的第十二方面的进一步的优选方面包括本发明的第一方面的 那些和在下文本发明的第十二方面提供的那些。技术人员理解本发明的任何 方面可以与本发明的其他一方面或多方面和/或与本发明的多方面的一个或多 个(若干个)优选方面和/或在此作出的其他披露组合。
本发明的所有方面的优选方面提供如下。技术人员理解本发明的任何方 面可以与本发明的其他一方面或多方面和/或与本发明的多方面的一个或多个 (若干个)优选方面和/或在此作出的其他披露组合。
与相应白蛋白或其片段或者包含白蛋白或其片段的融合多肽、其片段、 轭合物、纳米颗粒、缔合物或组合物的血浆半衰期相比，白蛋白变体或其片 段、或包含变体白蛋白或其片段的融合多肽、其片段、轭合物、纳米颗粒、 缔合物或组合物可以具有更长或更短的半衰期，优选更长，或者与FcRn的结 合更强或更弱，优选更弱。优选地，与HSA或相应白蛋白或其片段或者包含 白蛋白或其片段的融合多肽、其片段、轭合物、纳米颗粒、缔合物或组合物 的血浆半衰期相比，白蛋白变体或其片段、或包含变体白蛋白或其片段的融 合多肽、其片段、轭合物、纳米颗粒、缔合物或组合物具有更长的半衰期。
可替代地，这可以表述为：与HSA或其相应片段、或包含HSA或其片段 的融合多肽针对FcRn的相应KD相比，白蛋白变体或其片段或者包含变体白蛋 白或其片段的融合多肽、其片段、轭合物、纳米颗粒、缔合物或组合物具有 更低的、针对FcRn(例如shFcRn)的KD。优选地，关于白蛋白变体或其片 段、或包含变体白蛋白或其片段的融合多肽、其片段、轭合物、纳米颗粒、 缔合物或组合物的KD小于HSA对FcRn的0.9×KD，更优选小于HSA对FcRn的 0.5×KD，更优选小于HSA对FcRn的0.1×KD，甚至更优选小于HSA对FcRn 的0.05×KD，甚至更优选小于HSA对FcRn的0.02×KD，并且最优选小于HSA 对FcRn的0.01×KD(其中×意为‘乘以’)。白蛋白变体或其片段、或包含 变体白蛋白或其片段的融合多肽、其片段、轭合物、纳米颗粒、缔合物或组 合物的KD可以是在WT白蛋白(例如SEQ ID No.2)对FcRn的KD与HSA K573P(SEQ ID No.3)对FcRn的KD之间。此类KD表示高于HSA和FcRn之间 的结合亲和力的结合亲和力。较高的结合亲和力指示较长的半衰期，例如血 浆半衰期。
可替代地，与HSA或其相应片段、或者包含HSA或其片段的融合多肽的 血浆半衰期相比，白蛋白变体或其片段、或包含变体白蛋白或其片段的融合 多肽、其片段、轭合物、纳米颗粒、缔合物或组合物具有更短的血浆半衰 期。
这可以表述为：与HSA或相应白蛋白或其片段、或者包含白蛋白或其片 段的融合多肽、其片段、轭合物、纳米颗粒、缔合物或组合物对FcRn的相应 KD相比，白蛋白变体或其片段、或包含变体白蛋白或其片段的融合多肽、其 片段、轭合物、纳米颗粒、缔合物或组合物具有对FcRn更高的KD。优选地， 关于白蛋白变体或其片段、或包含变体白蛋白或其片段的融合多肽、其片 段、或包含白蛋白变体或其片段的轭合物的KD大于HSA对FcRn的2×KD，更 优选大于HSA对FcRn的5×KD，更优选大于HSA对FcRn的10×KD，甚至更 优选大于HSA对FcRn的25×KD，甚至最优选大于HSA对FcRn的50×KD。白 蛋白变体或其片段、或包含变体白蛋白或其片段的融合多肽、其片段、轭合 物、纳米颗粒、缔合物或组合物可以是针对FcRn的无效结合者(null binder)。
白蛋白变体或其片段、或包含变体白蛋白或其片段的融合多肽、其片 段、或包含白蛋白变体或其片段的轭合物、纳米颗粒、或缔合物或组合物优 选是根据本发明的白蛋白变体或其片段、或包含变体白蛋白或其片段的融合 多肽、其片段、或包含白蛋白变体或其片段的轭合物或纳米颗粒或缔合物或 组合物。较低的结合亲和力指示较短的半衰期，例如血浆半衰期。
本发明的一个优点是它允许白蛋白、白蛋白变体或其片段、或包含变体 白蛋白或其片段的融合多肽、其片段、轭合物、纳米颗粒、缔合物或组合物 被定制为实现满足用户需求的结合亲和力或半衰期。
当确定和/或比较KD时，可以使用以下参数中的一个或多个(并且优选 全部)：
仪器：Biacore3000仪器(GE医疗)
流动池：CM5传感器芯片
FcRn：人类FcRn，优选可溶性人类FcRn，可任选地偶联至标签例如GST 或His，最优选His，例如在β-2-微球蛋白(SEQ ID NO:31)的C-端处的6个组 氨酸。
FcRn的量：1200-2500RU
偶联化学：胺偶联化学(例如，如在仪器制造商提供的方案中所述)。
偶联方法：偶联可以通过注射10mM乙酸钠pH5.0(GE医疗)中的20 μg/ml蛋白质来进行。pH5.5的磷酸盐缓冲液(67mM磷酸盐缓冲液，0.15M NaCl，0.005％吐温20)可以用作运行缓冲液和稀释缓冲液。可以使用pH7.4 的HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％表面 活性剂P20)的注射液(Biacore AB)来进行表面的再生。
测试分子(例如HSA或变体)的注射量20-0.032μM
注射液流速：恒定，例如30μl/ml
注射温度：25℃
数据评估软件：BIAevaluation4.1软件(BIAcore AB)。
用于确定KD的优选方法提供于实例2中。
本发明披露了可以对在SEQ ID NO:2中的结构域I中的一个或多个(若干 个)位置与结构域III中的一个或多个(若干个)位置的组合(以及由此在来 自人血清白蛋白和非人血清白蛋白的白蛋白和片段中的等同位置)进行改 变，从而调节(增加或降低)白蛋白、片段、融合物、轭合物、缔合物、纳 米颗粒或组合物的结合亲和力和/或半衰期例如血浆半衰期。改变可以是取 代、插入或缺失。取代是优选的。
取代或插入可以包括或可以不包括保守氨基酸的引入，即关于感兴趣位 置处的氨基酸为保守的。保守氨基酸的实例由图3的组显示：脂肪族、芳香 族、疏水的、带电荷的、极性的、正电荷的、微小的和小的氨基酸。
在SEQ ID NO:2的位置82(或其他白蛋白或其片段变体的等同位置) 处，优选的是该改变是一个取代，例如，从天然氨基酸成为A、C、D、E、 F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y，更优选的是成为 Q、D、A，甚至更优选的是成为D、A，并且最优选的是成为A。在SEQ ID NO:2中，在位置82处的天然氨基酸是谷氨酸，因此到谷氨酸的取代不是优选 的。
在SEQ ID NO:2的位置83(或其他白蛋白或其片段变体的等同位置) 处，优选的是该改变是一个取代，例如，从天然氨基酸成为A、C、D、E、 F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y，更优选的是成为 N、K、S，甚至更优选的是成为N、K，并且最优选的是成为N。在SEQ ID NO:2中，在位置83处的天然氨基酸是苏氨酸，因此到苏氨酸的取代不是优选 的。
在SEQ ID NO:2的位置111(或其他白蛋白或其片段变体的等同位置) 处，优选的是该改变是一个取代，例如，从天然氨基酸成为A、C、D、E、 F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y，更优选的是成为 N、E、Q、D、G、H，甚至更优选的是成为E、Q，并且最优选的是成为E。 在SEQ ID NO:2中，在位置111处的天然氨基酸是天冬酰胺，因此到天冬酰胺 的取代不是优选的。
在SEQ ID NO:2的位置112(或其他白蛋白或其片段变体的等同位置) 处，优选的是该改变是一个取代，例如，从天然氨基酸成为A、C、D、E、 F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y，更优选的是成为 F、Y、W，甚至更优选的是成为F、Y，并且最优选的是成为F。在SEQ ID NO:2中，在位置112处的天然氨基酸是亮氨酸，因此到亮氨酸的取代不是优 选的。
在SEQ ID NO:2的位置573(或其他白蛋白或其片段变体的等同位置) 处，优选的是该改变是一个取代，例如，从天然氨基酸成为A、C、D、E、 F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y，更优选的是成为 P、Y、W、H、F、T、I或V，甚至更优选的是成为P、Y或W，并且最优选的 是成为P。在SEQ ID NO:2中，在位置573处的天然氨基酸是赖氨酸，因此到 赖氨酸的取代不是优选的。
优选的是在位置82处的改变是相对于A保守的。优选的是在位置83处的 改变是相对于N保守的。优选的是在位置111处的改变是相对于E保守的。优 选的是在位置112处的改变是相对于F保守的。优选的是在位置573处的改变是 相对于P保守的。
特别优选的白蛋白变体包括取代T83N/N111E(例如SEQ ID NO:32)； T83N/N111E/K573P(例如SEQ ID NO:33)；T83N/K573P(例如SEQ ID NO: 34)；T83K/K573P(例如SEQ ID NO:38)；E82A/K573P(例如SEQ ID NO: 39)；L112F/K573P(例如SEQ ID NO:40)；E82D/K573P(例如SEQ ID NO: 43)；P110G/K573P(例如SEQ ID NO:44)；N111D/K573P(例如SEQ ID NO:60)；N111G/K573P(例如SEQ ID NO:61)；N111H/K573P(例如SEQ ID NO:62)；E425A/K573P(例如SEQ ID NO:64)；E505Q/K573P(例如 SEQ ID NO:65)；T527M/K573P(例如SEQ ID NO:66)；N111E/K573P(例 如SEQ ID NO:68)；K534V/K573P(例如SEQ ID NO:73)；N111Q/K573P (例如SEQ ID NO:74)，是参照HSA(SEQ ID NO:2)描述的。其他优选的 白蛋白变体包括不是HSA(SEQ ID NO:2)的白蛋白中的等同取代。
另外，根据本发明的白蛋白变体可以包括选自在HSA(SEQ ID NO:2) 的78至88和/或105至120和/或425、505、510、512、524、527、531、534、 569、575的位置处或其他白蛋白等同位置处的一个或多个(若干个)改变。 优选的改变是取代，例如在本发明的第一方面中针对这些位置描述的那些。 特别优选的取代包括：D108A(SEQ ID NO:59)；D108E(例如SEQ ID NO: 70)；N109K(例如SEQ ID NO:69)；P110G(例如SEQ ID NO:42)； N111D(例如SEQ ID NO:46)；N111E(例如SEQ ID NO:67)；N111G(例 如SEQ ID NO:48)；N111H(例如SEQ ID NO:49)；N111K(例如SEQ ID NO:54)；L112F(例如SEQ ID NO:37)；E425A(例如SEQ ID NO:63)； E425K(例如SEQ ID NO:55)；E505Q(例如SEQ ID NO:45)；H510D(例 如SEQ ID NO:57)；D512E(例如SEQ ID NO:50)；K524A(例如SEQ ID NO:51)；T527A(例如SEQ ID NO:52)；T527M(例如SEQ ID NO:47)； E531H(例如SEQ ID NO:53)；K534V(例如SEQ ID NO:56)；A569S(例 如SEQ ID NO:58)；L575F(例如SEQ ID NO:72)；E82A(例如SEQ ID NO: 36)；E82D(例如SEQ ID NO:41)；T83K(例如SEQ ID NO:35)；T83N (例如SEQ ID NO:71)，是参照HSA(SEQ ID NO:2)描述的。其他优选的 包括一个或多个(若干个)改变的白蛋白变体可以包括不是HSA(SEQ ID NO:2)的白蛋白中的等同取代。
有利的是，多肽保持了与参照或亲本白蛋白如HSA基本上相同的三级结 构(或，对于一个片段，该结构的相关部分)。技术人员理解所铭记的术语 ‘基本上相同的三级结构’为三级结构中的某种程度的变化被预期，因为所有的 蛋白质均具有某种程度的结构柔性。这特别适用于与亲本或参照白蛋白(例 如，HSA)具有的对FcRn的结合亲和力相比具有对FcRn更高结合亲和力的多 肽。
可以或不可以相对于亲本白蛋白而保留一个或多个(若干个)His残基。 例如，参照SEQ ID NO:2，可以保留以下一个或多个(若干个)His残基： 3、9、39、67、105、128、146、242、247、288、338、367、440、464、 510、和/或535。在结构域I中的His残基的一个或多个(若干个)，优选全部 被保留(即3、9、39、67、105、128、146)。在结构域II中的His残基的一个 或多个(若干个)，优选全部被保留(即242、247、288、338、367)。在结 构域III中的His残基的一个或多个(若干个)，优选全部被保留(即440、 464、510、535)。可以保留His464、510、535的一个或多个(若干个)或全 部三个。
优选的是将白蛋白的二硫键的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16或17个保留在多肽中。对于衍生自全长白蛋白的多 肽，优选的是保留所有的通常存在于该白蛋白中的二硫键。对于衍生自白蛋 白片段的多肽，优选的是保留所有的通常存在于该片段中的二硫键。优选的 是保留Cys34(或在非人类白蛋白中的等同物)。
对于本发明的所有方面，融合配伍多肽和/或轭合物可以包括以下项的一 个或多个(若干个)：4-1BB配体、5-螺旋、人类C-C趋化因子、人类L105趋 化因子、人类L105趋化因子指定的huL105_3.、由γ-干扰素诱导的单核因子 (MIG)、部分CXCR4B蛋白、血小板碱性蛋白(PBP)、α1-抗胰蛋白酶、 ACRP-30同系物；补体组分C1q C、腺状体表达的趋化因子(ADEC)、 aFGF；FGF-1、AGF、AGF蛋白、白蛋白、依托泊苷、血管抑素、炭疽疫 苗、特异性针对脑衰蛋白的抗体、安逖斯塔辛(antistasin)、抗-TGFβ家族抗 体、抗凝血酶III、APM-1；ACRP-30；法莫新(Famoxin)、载脂蛋白种类、 芳基硫酸酯酶B、b57蛋白、BCMA、β-血小板球蛋白(β-TG)、bFGF； FGF2、凝血因子、BMP加工酶弗林蛋白酶、BMP-10、BMP-12、BMP-15、 BMP-17、BMP-18、BMP-2B、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-9、骨形态发 生蛋白-2、降钙素、钙蛋白酶-10a、钙蛋白酶-10b、钙蛋白酶-10c、癌症疫 苗、羧肽酶、C-C趋化因子、MCP2、CCR5变体、CCR7、CCR7、CD11a Mab、CD137；4-1BB受体蛋白、CD20Mab、CD27、CD27L、CD30、CD30 配体、CD33免疫毒素、CD40、CD40L、CD52Mab、赛贝罗斯蛋白、趋化因 子嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)、趋化因子hIL-8、趋化因子hMCP1、趋 化因子hMCP1a、趋化因子hMCP1b、趋化因子hMCP2、趋化因子hMCP3、趋 化因子hSDF1b、趋化因子MCP-4、趋化因子TECK和TECK变体、全长和成熟 的趋化因子样蛋白IL-8M1、全长和成熟的趋化因子样蛋白IL-8M10、趋化因 子样蛋白IL-8M3、全长和成熟的趋化因子样蛋白IL-8M8、全长和成熟的趋化 因子样蛋白IL-8M9、全长和成熟的趋化因子样蛋白PF4-414、全长和成熟的趋 化因子样蛋白PF4-426、全长和成熟的趋化因子样蛋白PF4-M2、霍乱疫苗、软 骨调节素样蛋白、c-kit配体；SCF；肥大细胞生长因子；MGF；纤维肉瘤衍生 的干细胞因子、CNTF和其片段(例如CNTFAx15`(阿索开TM(AxokineTM))、凝血因子前体形式和活性形式两者、胶原蛋白、补体C5 Mab、结缔组织激活蛋白-III、CTAA16.88Mab、CTAP-III、CTLA4-Ig、 CTLA-8、CXC3、CXC3、CXCR3；CXC趋化因子受体3、蓝藻抗病毒蛋白- N、达贝泊汀、指定的埃克索德斯(exodus)、指定的huL105_7.、DIL-40、 DNA酶、EDAR、EGF受体Mab、ENA-78、内皮他丁、嗜酸性粒细胞趋化因 子(Eotaxin)、上皮中性粒细胞激活蛋白-78、EPO受体；EPOR、促红细胞 生成素(EPO)和EPO模拟物、优托品(Eutropin)、埃克索德斯蛋白、因子 IX、因子VII、因子VIII、因子X和因子XIII、FAS配体抑制蛋白(DcR3)、 FasL、FasL、FasL、FGF、FGF-12；成纤维细胞生长因子同源因子-1、FGF- 15、FGF-16、FGF-18、FGF-3；INT-2、FGF-4；白树毒素(gelonin)、HST- 1；HBGF-4、FGF-5、FGF-6；肝素结合分泌转化因子-2、FGF-8、FGF-9；神 经胶质(Glia)激活因子、纤维蛋白原、flt-1、flt-3配体、促卵泡激素α亚基、 促卵泡激素β亚基、促卵泡素、不规则趋化因子(Fractalkine)、片段.肌原纤 维蛋白肌钙蛋白I、FSH、半乳糖苷酶、半乳糖凝集素-4、G-CSF、GDF-1、 基因疗法、神经胶质瘤衍生的生长因子、胰高血糖素、胰高血糖素样肽、葡 糖脑苷脂酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、胎盘蛋白-A；孕酮相关的子宫内膜 蛋白、GM-CSF、促性腺激素、粒细胞趋化蛋白-2(GCP-2)、粒细胞-巨噬 细胞集落刺激因子、生长激素、生长相关性致癌基因-α(GRO-α)、生长相 关性致癌基因-β(GRO-β)、生长相关性致癌基因-γ(GRO-γ)、hAPO-4； TROY、hCG、乙肝病毒表面抗原、乙肝疫苗、HER2受体Mab、水蛭素、HIV gp120、HIV gp41、HIV抑制肽、HIV抑制肽、HIV抑制肽、HIV蛋白酶抑制 肽、HIV-1蛋白酶抑制剂、HPV疫苗、人类6CKine蛋白、人类Act-2蛋白、人 类脂肪生成抑制因子、人类B细胞刺激因子-2受体、人类β-趋化因子H1305 (MCP-2)、人类C-C趋化因子DGWCC、人类CC趋化因子ELC蛋白、人类 CC型趋化因子白介素C、人类CCC3蛋白、人类CCF18趋化因子、人类CC-型 趋化因子蛋白指定的SLC(次级淋巴趋化因子)、人类趋化因子β-8短形式、 人类趋化因子C10、人类趋化因子CC-2、人类趋化因子CC-3、人类趋化因子 CCR-2、人类趋化因子Ckβ-7、人类趋化因子ENA-78、人类趋化因子嗜酸性粒 细胞趋化因子(Eotaxin)、人类趋化因子GROα、人类趋化因子GROα、人 类趋化因子GROβ、人类趋化因子HCC-1、人类趋化因子HCC-1、人类趋化因 子I-309、人类趋化因子IP-10、人类趋化因子L105_3、人类趋化因子L105_7、 人类趋化因子MIG、人类趋化因子MIG-β蛋白、人类趋化因子MIP-1α、人类 趋化因子MIP1β、人类趋化因子MIP-3α、人类趋化因子MIP-3β、人类趋化因 子PF4、人类趋化因子蛋白331D5、人类趋化因子蛋白61164、人类趋化因子 受体CXCR3、人类趋化因子SDF1α、人类趋化因子SDF1β、人类趋化因子 ZSIG-35、人类Chr19Kine蛋白、人类CKβ-9、人类CKβ-9、人类CX3C111氨基 酸趋化因子、人类DNAX白介素-40、人类DVic-1C-C趋化因子、人类EDIRF I 蛋白序列、人类EDIRF II蛋白序列、人类嗜酸性细胞CC型趋化因子嗜酸性粒 细胞趋化因子(Eotaxin)、人类嗜酸性细胞-表达的趋化因子(EEC)、人类 快速抽搐骨骼肌肌钙蛋白C、人类快速抽搐骨骼肌肌钙蛋白I、人类快速抽搐 骨骼肌肌钙蛋白亚基C、人类快速抽搐骨骼肌肌钙蛋白亚基I蛋白、人类快速 抽搐骨骼肌肌钙蛋白亚基T、人类快速抽搐骨骼肌肌钙蛋白T、人类胎儿脾表 达的趋化因子、FSEC、人类GM-CSF受体、人类gro-α趋化因子、人类gro-β趋 化因子、人类gro-γ趋化因子、人类IL-16蛋白、人类IL-1RD10蛋白序列、人类 IL-1RD9、人类IL-5受体α链、人类IL-6受体、人类IL-8受体蛋白hIL8RA、人 类IL-8受体蛋白hIL8RB、人类IL-9受体蛋白、人类IL-9受体蛋白变体#3、人类 IL-9受体蛋白变体片段、人类IL-9受体蛋白变体片段#3、人类白介素1δ、人类 白介素10、人类白介素10、人类白介素18、人类白介素18衍生物、人类白介 素-1β前体、人类白介素-1β前体、人类白介素-1受体辅助蛋白、人类白介素- 1受体拮抗剂β、人类白介素-1型-3受体、人类白介素-10(前体)、人类白介 素-10(前体)、人类白介素-11受体、人类白介素-1240kD亚基、人类白介素 -12β-1受体、人类白介素-12β-2受体、人类白介素-12p35蛋白、人类白介素- 12p40蛋白、人类白介素-12受体、人类白介素-13α受体、人类白介素-13β受 体、人类白介素-15、来自克隆P1的人类白介素-15受体、人类白介素-17受 体、人类白介素-18蛋白(IL-18)、人类白介素-3、人类白介素-3受体、人类 白介素-3变体、人类白介素-4受体、人类白介素-5、人类白介素-6、人类白介 素-7、人类白介素-7.、人类白介素-8(IL-8)、人类细胞内IL-1受体拮抗剂、 人类IP-10和HIV-1gp120高变区融合蛋白、人类IP-10和人类Muc-1核心表位 (VNT)融合蛋白、人类肝脏和活化作用调节的趋化因子(LARC)、人类 Lkn-1全长和成熟蛋白、全长和成熟的人类乳腺相关的趋化因子(MACK)蛋 白、人类成熟趋化因子Ckβ-7、人类成熟gro-α、用于治疗败血症的人类成熟 gro-γ多肽、人类MCP-3和人类Muc-1核心表位(VNT)融合蛋白、人类MI10 蛋白、人类MI1A蛋白、人类单核细胞化学吸引因子hMCP-1、人类单核细胞 化学吸引因子hMCP-3、人类单核细胞趋化性原蛋白(MCPP)序列、人类神 经趋化因子(neurotactin)样结构域、人类非-ELR CXC趋化因子H174、人类 非-ELR CXC趋化因子IP10、人类非-ELR CXC趋化因子Mig、人类PAI-1突变 体、具有IL-16活性的人类蛋白质、具有IL-16活性的人类蛋白质、人类次级淋 巴趋化因子(SLC)、人类SISD蛋白、人类STCP-1、人类基质细胞衍生的趋 化因子、SDF-1、人类T细胞混合的淋巴细胞反应表达的趋化因子 (TMEC)、人类胸腺和活化作用调节的细胞因子(TARC)、人类胸腺表达 的、人类TNF-α、人类TNF-α、人类TNF-β(LT-α)、人类CC型趋化因子嗜酸 性粒细胞趋化因子(Eotaxin)3蛋白序列、人类II型白介素-1受体、人类野生 型白介素-4(hIL-4)蛋白、人类ZCHEMO-8蛋白、人源化抗-VEGF抗体、及 其片段、人源化抗-VEGF抗体、及其片段、透明质酸酶、ICE10kD亚基、 ICE20kD亚基、ICE22kD亚基、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、艾杜糖醛酸、IL- 1α、IL-1β、IL-1抑制剂(IL-1i)、成熟IL-1、IL-10受体、IL-11、IL-11、IL- 12p4亚基、IL-13、IL-14、IL-15、IL-15受体、IL-17、IL-17受体、Il-17受 体、Il-17受体、IL-19、IL-1i片段、IL1-受体拮抗剂、IL-21(TIF)、包含IL-3 的融合蛋白.、IL-3突变体蛋白、IL-3变体、IL-3变体、IL-4、IL-4突变蛋白、 IL-4突变蛋白Y124G、IL-4突变蛋白Y124X、IL-4突变蛋白、Il-5受体、IL-6、 Il-6受体、IL-7受体克隆、IL-8受体、IL-9成熟蛋白变体(Met117型式)，免 疫球蛋白或基于免疫球蛋白的分子或片段(例如小模块免疫药物(Small Modular ImmunoPharmaceutical)TM(“SMIP”)或dAb、Fab’片段、F (ab’)2、scAb、scFv或scFv片段)，包括但不限于纤溶酶原、流感疫苗、抑 制素α、抑制素β、胰岛素、胰岛素样生长因子、整合素Mab、内-α胰蛋白酶抑 制剂、内-α胰蛋白酶抑制剂、干扰素γ-诱导蛋白(IP-10)、干扰素(例如干 扰素α种类和亚类、干扰素β种类和亚类、干扰素γ种类和亚类)、干扰素(例 如干扰素α种类和亚类、干扰素β种类和亚类、干扰素γ种类和亚类)、白介素 6、白介素8(IL-8)受体、白介素8受体B、白介素-1α、白介素-2受体相关蛋 白p43、白介素-3、白介素-4突变蛋白、白介素-8(IL-8)蛋白、白介素-9、白 介素-9(IL-9)成熟蛋白(Thr117型式)、白介素(例如IL10、IL11和 IL2)、白介素(例如IL10、IL11和IL2)、日本脑炎疫苗、激肽释放酶 (Kalikrein)抑制剂、角质细胞生长因子、库尼茨结构域(Kunitz domain)蛋 白(例如抑肽酶、淀粉样前体蛋白以及描述于WO 03/066824中的那些，具有 或不具有白蛋白融合物)、库尼茨结构域蛋白(例如抑肽酶、淀粉样前体蛋 白以及描述于WO 03/066824中的那些，具有或不具有白蛋白融合物)、 LACI、乳铁蛋白、潜在TGF-β结合蛋白II、瘦素、肝脏表达的趋化因子-1 (LVEC-1)、肝脏表达的趋化因子-2(LVEC-2)、LT-α、LT-β、黄体化激 素(Luteinization Hormone)、莱姆疫苗、淋巴细胞趋化因子、巨噬细胞衍生 的趋化因子类似物MDC(n+1)、巨噬细胞衍生的趋化因子类似物MDC- eyfy、巨噬细胞衍生的趋化因子类似物MDC-yl、巨噬细胞衍生的趋化因子、 MDC、巨噬细胞衍生的趋化因子(MDC)、乳腺丝抑蛋白；蛋白酶抑制剂 5、MCP-1受体、MCP-1a、MCP-1b、MCP-3、MCP-4受体、M-CSF、黑色素 瘤抑制蛋白、膜结合蛋白、Met117人类白介素9、MIP-3α、MIP-3β、MIP-γ、 MIRAP、修饰的Rantes、单克隆抗体、MP52、突变体白介素6S176R、肌原 纤维收缩蛋白肌钙蛋白I、利尿钠肽、神经生长因子-β、神经生长因子-β2、神 经纤毛蛋白-1、神经纤毛蛋白-2、神经趋化因子、神经营养因子-3、神经营养 因子-4、神经营养因子-4a、神经营养因子-4b、神经营养因子-4c、神经营养因 子-4d、中性粒细胞激活肽-2(NAP-2)、NOGO-66受体、NOGO-A、NOGO- B、NOGO-C、新颖的β-趋化因子指定的PTEC、N-端修饰的趋化因子 GroHEK/hSDF-1α、N-端修饰的趋化因子GroHEK/hSDF-1β、N-端修饰的趋化 因子met-hSDF-1α、N-端修饰的趋化因子met-hSDF-1β、OPGL、成骨蛋白- 1；OP-1；BMP-7、成骨蛋白-2、OX40；ACT-4、OX40L、催产素(后叶激素 运载蛋白I)、甲状旁腺激素、碎片蛋白(Patched)、碎片蛋白-2、PDGF- D、百日咳类毒素(Pertussis toxoid)、垂体表达的趋化因子(PGEC)、胎盘 生长因子、胎盘生长因子-2、纤溶酶原活化剂抑制剂-1；PAI-1、纤溶酶原活 化剂抑制剂-2；PAI-2、纤溶酶原活化剂抑制剂-2；PAI-2、血小板衍生的生长 因子、血小板衍生的生长因子Bv-sis、血小板衍生的生长因子前体A、血小板 衍生的生长因子前体B、血小板Mab、血小板衍生的内皮细胞生长因子(PD- ECGF)、血小板衍生的生长因子A链、血小板衍生的生长因子B链、用于治 疗败血症的多肽、前原载脂蛋白(Preproapolipoprotein)“米兰”变体、前原 载脂蛋白“巴黎”变体、前凝血酶、灵长类CC趋化因子“ILINCK”、灵长类 CXC趋化因子“IBICK”、胰岛素原、催乳素、催乳素2、神经营养肽 (prosaptide)、蛋白酶抑制肽、蛋白C、蛋白S、凝血酶原、尿激酶原、 RANTES、RANTES8-68、RANTES9-68、RANTES肽、RANTES受体、重组 白介素-16、抵抗素、局限曲菌素(restrictocin)、逆转录病毒蛋白酶抑制 剂、蓖麻毒素、轮状病毒疫苗、RSV Mab、皂草素、次黄嘌呤(sarcin)、分 泌型和跨膜型多肽、分泌型和跨膜型多肽、血清胆碱酯酶、血清蛋白(例如 血液凝固因子)、可溶性BMP受体激酶蛋白-3、可溶性VEGF受体、干细胞抑 制因子、金黄色葡萄球菌疫苗、基质衍生的因子-1α、基质衍生的因子-1β、 物质P(速激肽)、T1249肽、T20肽、T4核酸内切酶、TACI、Tarc、TGF-β 1、TGF-β2、Thr117人类白介素9、凝血酶、促血小板生成素、促血小板生成 素衍生物1、促血小板生成素衍生物2、促血小板生成素衍生物3、促血小板生 成素衍生物4、促血小板生成素衍生物5、促血小板生成素衍生物6、促血小板 生成素衍生物7、胸腺表达的趋化因子(TECK)、促甲状腺激素、蜱抗凝血 肽、Tim-1蛋白、TNF-α前体、TNF-R、TNF-RII；TNF p75受体；死亡受体、 tPA、转铁蛋白、转化生长因子β、肌钙蛋白肽、截短的单核细胞趋化蛋白2 (6-76)、截短的单核细胞趋化蛋白2(6-76)、截短的RANTES蛋白(3- 68)、肿瘤坏死因子、尿酸氧化酶、尿激酶、加压素(后叶激素运载蛋白 II)、VEGF R-3；flt-4、VEGF受体；KDR；flk-1、VEGF-110、VEGF-121、 VEGF-138、VEGF-145、VEGF-162、VEGF-165、VEGF-182、VEGF-189、 VEGF-206、VEGF-D、VEGF-E；VEGF-X、温韦伯氏(von Willebrand’s)因 子、野生型单核细胞趋化蛋白2、野生型单核细胞趋化蛋白2、ZTGF-β9，替 代抗体支架例如一个或多个anticalin、一个或多个adnectin、一个或多个纤维 蛋白原片段，纳米抗体例如骆驼纳米抗体、infestin、和/或在WO 01/79271 (具体在第9页和/或表1)、WO 2003/59934(具体在表1)、WO 03/060071 (具体在表1)或WO 01/079480(具体在表1)(各自通过引用以其全文结合 于此)中提及的任何分子。
并且，轭合物可以包含化疗药物中的一种或多种(若干种)，例如：13- 顺式-视黄酸、2-CdA、2-氯脱氧腺苷、5-阿扎胞苷、5-氟尿嘧啶、5-FU、6-巯 嘌呤、6-MP、6-TG、6-硫鸟嘌呤，A，紫杉醇(Abraxane)、阿克唐丸 放线菌素-D、阿霉素氟尿嘧啶阿那格雷阿地白介素、阿仑单抗、ALIMTA、 阿利维A酸(Alitretinoin)、艾尔卡巴(Alkaban)美法仑全反式视黄酸、α干扰素、六甲蜜胺、氨甲喋呤、氨磷汀、氨鲁米特、阿 那格雷、尼鲁米特阿那曲唑、阿糖胞嘧啶、Ara-C、安然爱 斯阿可安美达锭阿诺新奈拉滨 三氧化二砷、天冬酰胺酶、ATRA、阿瓦斯阿扎胞苷、 BCG、BCNU、贝伐珠单抗、蓓萨罗丁、比卡鲁胺、BiCNU、博 莱霉素争光霉素(Bleomycin)、硼替佐米、白消安 (Busulfan)、白舒非C225、甲酰四氢叶酸钙、坎帕斯 伊立替康喜树碱-11、卡培他滨、CaracTM、 卡铂、卡莫司汀、卡莫司汀圆片、康士CC-5013、CCNU、CDDP、 CeeNU、柔红霉素西妥昔单抗、苯丁酸氮芥 (Chlorambucil)、顺铂、嗜橙菌因子、克拉屈滨、可的松、可美CPT- 11、环磷酰胺、氨鲁米特阿糖胞苷(Cytarabine)、阿糖胞苷 脂质体、赛德萨癌得星达卡巴嗪、达克金、更生霉素 (Dactinomycin)、阿法达贝泊汀、达沙替尼、道诺霉素(Daunomycin)、 佐柔比星(Daunorubicin)、盐酸佐柔比星(Daunorubicin Hydrochloride)、 佐柔比星脂质体(Daunorubicin Liposomal)、枸橼酸柔红霉素脂质体 德沙美松(Decadron)、地西他滨、δ-氢化可的松 强的松地尼白介素(Denileukin diftitox)、 DepoCytTM、地塞米松(Dexamethasone)、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸 钠、Dexasone、右雷佐生、DHAD、DIC、Diodex、多西他赛、盐酸多柔比星 多柔比星(Doxorubicin)、多柔比星脂质体(Doxorubicin liposomal)、DroxiaTM、DTIC、DTIC-多姆甲泼尼龙 醋酸亮丙瑞林(Eligard)TM、表柔比星(Ellence) TM、乐沙定(Eloxatin)TM、爱施巴表阿霉素 (Epirubicin)、阿法依泊汀、爱必妥TM、埃罗替尼(Erlotinib)、欧文氏菌L- 天冬酰胺酶、雌莫司汀、阿米福汀、凡毕复依托泊苷 (Etoposide)、磷酸依托泊甙、氟他胺雷洛昔芬依西美坦、法乐通氟维司群弗隆非格司亭(Filgrastim)、氟尿苷(Floxuridine)、福达华氟达拉滨、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、氟尿嘧啶(膏)、氟甲 睾酮(Fluoxymesterone)、氟他米特、亚叶酸、氟维司群 (Fulvestrant)、G-CSF、吉非替尼(Gefitinib)、吉西他滨 (Gemcitabine)、吉妥珠单抗奥唑米星、健择格列卫 (Gleevec)TM、圆片、GM-CSF、戈舍瑞林、粒细胞集落刺激因子、 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、氟甲睾酮赫赛Hexadrol、克瘤灵六甲蜜胺(Hexamethylmelamine)、 HMM、癌康定羟基脲醋酸氢化可的氢 化可的松、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、磷酸氢化可通、羟基 脲(Hydroxyurea)、替伊莫单抗、替坦替伊莫单抗(Ibritumomab Tiuxetan)、伊达比星伊达比星(Idarubicin)、IFN- α、异环磷酰胺(Ifosfamide)、IL-11、IL-2、甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate)、咪唑甲酰胺、阿尔法干扰素、阿尔法干扰素-2b(PEG轭合物)、 白介素-2、白介素-11、Intron(阿尔法干扰素-2b)、易瑞沙爱莱诺迪肯(Irinotecan)、异维A酸(Isotretinoin)、拉帕替尼(Lapatinib)、L-天冬酰胺酶、LCR、来那度胺、来曲 唑、甲酰四氢叶酸(Leucovorin)、瘤可宁(Leukeran)、LeukineTM、亮丙瑞 林(Leuprolide)、闻克斯丁(Leurocristine)、克拉屈滨(Leustatin)TM、脂 质体Ara-C、液体泼尼松洛莫司汀、L-PAM、L-沙可来新、 利普安储库型利普安M，甲基苄肼 地塞米松(Maxidex)、甲氮芥(Mechlorethamine)、盐酸 甲氮芥(Mechlorethamine Hydrochloride)、美卓乐美可治甲地孕酮(Megestrol)、醋酸甲地孕酮、美法仑、 乐疾宁(Mercaptopurine)、美司钠、美司钠克斯(Mesnex)TM、氨甲喋呤 (Methotrexate)、氨甲喋呤钠、甲基强的松龙(Methylprednisolone)、梅特 克汀丝裂霉素、丝裂霉素-C、米托蒽醌、M-泼尼松MTC、MTX、慕斯塔净盐酸氮芥(Mustine)、密吐霉素 马利MylocelTM、麦罗诺维奈拉滨、尼欧 萨培非格司亭TM、尼美佳优保多吉美 尼兰德龙尼鲁米特、尼喷氮芥 (Nitrogen Mustard)、诺瓦德克米托蒽醌奥曲肽、 醋酸奥曲肽、安可安塔克安克萨尔(Onxal) TM、欧普瑞维尔金(Oprevelkin)、欧瑞普瑞德欧瑞松 奥沙利铂、紫杉酚或紫杉酚衍生物(例如紫杉醇或紫杉醇蛋 白质结合的)、帕米膦酸盐、帕尼单抗、潘瑞汀伯尔定 佩蒂普瑞德PEG干扰素、培门冬酶、培非 格司亭、PEG-INTRONTM、PEG-L-天冬酰胺酶、PEMETREXED、喷司他丁 (Pentostatin)、苯丙氨酸氮芥(Phenylalanine Mustard)、顺铂顺铂(Platinol)泼尼松龙(Prednisolone)、泼尼松 (Prednisone)、普瑞龙丙卡巴肼、阿地白介素 带有卡莫司汀植入的Prolifeprospan20、巯基嘌呤 R，雷洛昔芬、来那度胺甲氨蝶呤 美罗利妥昔单抗、罗扰素(阿尔法干扰素-2a)、 如贝克斯盐酸柔红霉素(Rubidomycin hydrochloride)、善得定 善得定沙格司亭(Sargramostim)、甲强龙索拉非尼、施达赛(SPRYCEL)TM、STI-571、链佐星 (Streptozocin)、SU11248、舒尼替尼、索它莫西芬、它赛蓓萨 罗丁紫杉他克唑泰尔替莫达 替莫唑胺(Temozolomide)、替尼泊苷(Teniposide)、 TESPA、沙利度胺(Thalidomide)、撒利多迈硫鸟嘌呤、硫鸟嘌呤药片硫磷酰胺 (Thiophosphoamide)、噻欧普勒克斯噻替派(Thiotepa)、 托泼萨拓扑特肯(Topotecan)、托瑞米芬、托西莫单 抗、曲妥珠单抗、翠提娜茵(Tretinoin)、TrexallTM、三氧化二砷 TSPA、泰克博VCR、维克替比TM、长春花 碱万珂凡毕士维萨诺德 维阿德(Viadur)TM、维达扎长春花碱 (Vinblastine)、硫酸长春花碱、维卡萨(Vincasar)长春新碱 (Vincristine)、长春瑞滨(Vinorelbine)、酒石酸长春瑞滨、VLB、VM- 26、伏立诺他、VP-16、威希罗泽钠萨泽娃灵TM、 泽尼卡德诺雷德唑来磷酸、伏立诺他、择泰 放射性药物例如：碳-11、碳-14、铬-51、钴-57、钴-58、铒- 169、氟-18、镓-67、金-198、铟-111、铟-113m、碘-123、碘-125、碘-131、 铁-59、氪-81m、氮-13、氧-15、磷-32、铼-186、铷-82、钐-153、硒-75、锶- 89、锝-99m、铊-201、氚、氙-127、氙-133、钇-90；成像剂，例如钆、磁铁 (magnetite)、锰、锝、I125、I131、P32、TI201、碘帕醇、PET-FDG。
另外的用于被包含在根据本发明的纳米颗粒、缔合物或组合物中的融合 配伍物、轭合配伍物和/或分子包括：肢端肥大症药物，例如索马杜林、兰瑞 肽、奥曲肽、善得定；抗血栓形成剂，例如比伐卢定、安格奥麦克斯 (Angiomax)、达肝素钠(dalteparin)、片段化蛋白、依诺肝素、克赛 (Lovenox)、阿尔法德特瑞克净(Drotrecogin alfa)(例如活化的)、奇格 瑞、肝素；辅助生殖治疗化合物，例如绒毛膜促性腺激素、破卵针、促卵泡 素、α/β；酶，例如透明质酸酶、重组人类透明质酸酶(Hylenex)；糖尿病药 物，例如艾塞那肽、百泌达、胰高血糖素(glucagon)、胰岛素、利拉鲁肽、 阿必鲁泰、GLP-1拮抗剂、依森泰德(exendin)或依森泰德类似物；用于诊 断中的化合物，例如普罗瑞林、蒂雷尔(Thyrel)TRH普罗瑞林 (Thypinone)、分泌素(例如合成的、人类的)、克瑞侯斯缇姆 (Chirhostim)、促甲状腺素(例如α)、适谪进(Thyrogen)红细胞生成药 物，例如阿尔法促红细胞生成素(Darbepoetin alfa)、安然爱斯普 (Aranesp)、阿尔法依泊汀(epoetin alfa)、依泊汀(Epogen)、埃普莱克 斯(Eprex)，用于治疗基因缺陷的药物，例如培加酶(pegademase)、用于 治疗生长不足的药物，例如腺苷脱氨酶(Adagen)、美卡舍明 (mecasermin)、瑞恩法贝特(rinfabate)，用于治疗囊性纤维化的药物，例 如阿尔法链道酶、百慕时(Pulmozyme)，用于治疗代谢失调的药物，例如β 半乳糖苷酶、重组半乳糖苷酶(Fabrazyme)、阿尔法阿糖苷酶、孤儿药 (Myozyme)、拉罗尼酶(Laronidase)、阿尔图拉酶(Aldurazyme)，用于 治疗生殖器疣病灶的药物，例如阿尔法干扰素-n3、阿尔费隆N，用于治疗肉 芽肿病的药物，例如干扰素γ-1b、爱克汀穆恩(Actimmune)；用于治疗生长 不足的药物，例如培维索孟、索马威特(Somavert)、索马特罗滨 (somatropin)、健豪宁(Genotropin)、优茁滨(Nutropin)、优猛茁 (Humatrope)、萨瑞斯亭(Serostim)、硝甲阿托品丙酸酯(Protropin)； 用于治疗心力衰竭的药物，例如奈西立肽、奈特瑞科尔(Natrecor)；用于治 疗血友病的药物，例如凝血因子，如因子VIII、Helixate FS、拜科奇 (Kogenate)FS、因子IX、BeneFIX、因子VIIa、诺其(Novoseven)、去氨 加压素(desmopressin)、斯代米特(Stimate)、DDAVP；造血药物，例如 非格司亭(Filgrastim)(G-CSF)、优保津(Neupogen)、奥普瑞白介素 (Oprelvekin)、优美佳(Neumega)、培非格司亭(Pegfilgrastim)、优拉斯 塔(Neulasta)、沙格司亭(Sargramostim)、沙格司亭(Leukine)；用于治 疗丙肝的药物，例如阿尔法干扰素-2a、罗扰素A、阿尔法干扰素-2b、甘乐能 (Intron)A、阿尔法康干扰素(Interferon alfacon)-1、干复津、阿尔法聚乙 二醇干扰素-2a、派罗欣、阿尔法聚乙二醇干扰素-2b、PEG-甘乐能；用于治 疗HIV的药物，例如恩夫韦地、恩夫韦；Fab例如Fab(抗凝血酶)、阿昔单抗 (Abciximab)、阿昔单抗(ReoPro)；单克隆抗体，例如达利珠单抗、赛尼 哌；抗病毒单克隆抗体，例如帕利珠单抗、塞那吉斯(Synagis)；用于治疗 哮喘的单克隆抗体，例如奥马珠单抗、索雷尔；用于诊断性成像的单克隆抗 体，例如阿西莫单抗、CEA-Scan、卡罗单抗喷地肽、ProstaScint、沙妥莫单 抗喷地肽、OncoScint CR/OV，用于诊断性成像的Fab，例如诺非单抗 (Nofetumomab)、巯诺莫单抗(Verluma)；免疫抑制单克隆抗体，例如巴 利昔单抗、舒莱(Simulect)、莫罗莫那(Muromonab)-CD3、正克隆 (Orthoclone)OKT3；用于治疗恶性肿瘤的单克隆抗体，例如阿仑单抗、坎 帕斯、替坦替伊莫单抗、泽娃灵、利妥昔单抗、美罗华、曲妥珠单抗、赫塞 汀；用于治疗类风湿性关节炎(RA)的药物，例如阿达木单抗、修美乐、英 利昔单抗、瑞米凯德；用于用作放射免疫治疗剂的单克隆抗体，例如托西莫 单抗和碘I131、托西莫单抗、百克沙；用于治疗黄斑变性的药物，例如哌加 他尼钠、哌加他尼；用于治疗恶性肿瘤的药物，例如阿地白介素 (aldesleukin)、阿地白介素(Proleukin)、白介素-2、天冬酰胺酶、爱施巴 (Elspar)、拉布立酶(Rasburicase)、埃立特(Elitek)、地尼白介素 (Denileukin diftitox)、安塔克(Ontak)、培门冬酶、培加帕酶 (Oncaspar)、戈舍瑞林、亮丙瑞林；用于治疗多发性硬化症(MS)的药 物，例如醋酸格拉替雷(Glatiramer acetate)(例如共聚物-1)、克帕松、β干 扰素-1a、阿沃纳斯、β干扰素-1a、利比(Rebif)、β干扰素-1b、倍泰龙 (Betaseron)；用于治疗粘膜炎的药物，例如帕利夫明、科皮维斯 (Kepivance)；用于治疗肌张力障碍的药物，例如神经毒素、A型肉毒杆菌 毒素、BOTOX、BOTOX化妆品、B型肉毒杆菌毒素、MYOBLOC；用于治疗 骨质疏松症的药物，例如特立帕肽、骨稳(Forteo)；用于治疗银屑病的药 物，例如阿法赛特、阿密凡夫；用于治疗RA的药物，例如阿巴西普、恩瑞 舒、阿那白滞素、加利利(Kineret)、依那西普、恩博(Enbrel)；溶栓剂， 例如阿替普酶、阿克伐司(Activase)、重组组织纤溶酶原激活剂(rtPA)、 阿尼普酶(Anistreplase)、依米那酶(Eminase)、瑞替普酶(Reteplase)、 瑞替伐酶(Retavase)、链球菌激酶(Streptokinase)、链激酶(Streptase)、 替奈普酶(Tenecteplase)、TNK酶(替奈普酶)、尿激酶、雅激酶 (Abbokinase)、Kinlytic；用于治疗骨质疏松症的药物，例如降血钙素(例 如鲑鱼)、鲑鱼降钙素(Miacalcin)、复能素，用于治疗皮肤溃疡的药物， 例如贝卡普勒明、瑞格瑞尼克斯(Regranex)、胶原酶、水杨酸檀香酯 (Santyl)。
此类多肽和化学化合物可以称为诊断部分、治疗部分、预防部分或有益 部分。
优选地，融合配伍物和/或轭合配伍物不是白蛋白、其变体或片段。
一种或多种(若干种)治疗的或预防的多肽可以融合至白蛋白的N-端、 C-端，插入到白蛋白结构中的环中，或其任何组合。它可以包括或可以不包 括将融合多肽的不同组分分离的接头序列。
与白蛋白或其片段的融合物相关的传授在本领域中是已知的，并且技术 人员将理解此类传授也可以适用于本发明。WO 2001/79271 A和WO 2003/59934(通过引用结合于此)还包含可以融合至白蛋白或其片段的治疗和 预防多肽的实例，并且这些实例也适用于本发明。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的 范围。
实例
实例1：HSA突变蛋白表达质粒的制备
使用标准的分子生物学技术，例如描述于萨拉布鲁克，J.和D.W.拉塞尔 (Russell)，2001(《分子克隆实验指南》，第3版，冷泉港实验室出版社， 冷泉港，纽约)的，来表达HSA变体。
K573P表达质粒的构建描述于WO 2011/051489(通过引用结合于此)。 其余表达质粒的构建是如WO 2012/150319(PCT/EP12/058206，通过引用结合 于此)中所描述的进行。变体HSA T83K、HSA E82A、HSA E82D、HSA P110G、HSA L112F和HSA T83N/N111E是如WO 2012/150319 (PCT/EP12/058206，通过引用结合于此)方法2实例6中所描述的产生。包含 K573P取代的组合突变体是如在“具有K573P的组合突变体的产生”(WO 2012/150319(PCT/EP12/058206))中描述的来产生，其中将所需要的片段 插入适当指定的pDB4852中(描述于WO 2012/150319(PCT/EP12/058206，通 过引用结合于此))。经由指示的限制性位点(表1)将包含T83N/N111E、 T83K、E82A、E82D、P110G和L112F的片段从合成构建体去除。将包含T83N 取代的片段从pDB4874去除(描述于WO 2012/150319(PCT/EP12/058206，通 过引用结合于此))。编码HSA变体的多核苷酸与质粒pDB3964/pDB4852的 连接产生了用于表达所希望的突变体的质粒(表1)。所有的质粒被测序为确 认HSA序列是唯一在所希望的一个或多个位置处突变的。
HSA T83N、HSA N111E和HSA N111E/K573P的构建描述于WO 2012/150319(PCT/EP12/058206，通过引用结合于此)。
酿酒酵母的转化是如在WO 2012/150319(PCT/EP12/058206，通过引用 结合于此)中描述的进行，采用描述于WO 2011/051489中的24小时储存方 法，除了宿主菌株是酿酒酵母DYB7(佩恩(Payne)等人(2008)《应用与 环境微生物学》(Applied and Environmental Microbiology)74卷(24)： 7759-7766)之外，其中有四个拷贝的PDI整合进该酵母的基因组中。
表1：HSA突变蛋白表达质粒的构建
实例2：白蛋白变体对FcRn的结合亲和力的SPR分析
SPR分析是如WO 2012/150319(PCT/EP12/058206，通过引用结合于 此)中所描述的进行。
这些变体是各自具有选自以下项的一个点突变的白蛋白(SEQ ID NO: 2)：D108A、N111D、N111G、N111H、N111K、K190A、R197A、 K276N、R410A、Y411A、P416A、E425A、E425K、K466A、D471A、 R472A、N503D、N503K、E505K、E505Q、H510D、H510E、D512A、 D512E、K524A、K525A、T527A、T527D、T527M、E531A、E531H、 K534V、H535F、E565V、A569L、A569S、A569V、和V576F。
首先，通过SPR来分析这些变体，以确定它们对shFcRn的结合反应 (RU)。仅对显示高于或低于野生型白蛋白的结合反应的大于20％的结合反 应的变体进行分析来鉴定KD(下表2)。野生型HSA和具有突变K573P的HSA 用作对照。
表2：白蛋白变体对shFcRn的结合亲和力
*五个重复的平均值，因此不提供Ka和Kd
具有比野生型HSA更低的KD的变体具有对shFcRn的更高的结合亲和 力。相反地，具有比野生型HSA更高的KD的变体具有对shFcRn的更低的结合 亲和力。
对于位置108和111的数据证明了涉及到包含位置105至120的环与FcRn的 相互作用，并且因此在该环内的任何位置处的该改变将调节白蛋白对FcRn的 结合亲和力。
实例3.白蛋白变体对FcRn的结合亲和力的SPR分析
这些变体是各自具有选自以下项的一个点突变的白蛋白(SEQ ID NO: 2)：N111D、N111G、N111H、N111D/K573P、N111G/K573P、 N111H/K573P、E505Q、E425A、T527M、E505Q/K573P、E425A/K573P和 T527M/K573P，如上所述的进行制备。
表3：白蛋白变体对shFcRn-HIS的结合亲和力
*8个的平均值以及标准偏差**5个的平均值以及标准偏差。
具有比野生型HSA更低的KD的变体具有对shFcRn的更高的结合亲和 力。相反地，具有比野生型HSA更高的KD的变体具有对shFcRn的更低的结合 亲和力。
对于包含K573P的变体的数据得出了亲和力的增加，与仅具有K573P取 代是一致的。
实例4.白蛋白变体对FcRn的结合亲和力的SPR分析
这些变体是各自具有选自以下项的一个点突变的白蛋白(SEQ ID NO: 2)：N111R、N111Q、N111E、N111R/K573P、N111Q/K573P、 N111E/K573P、N109D、N109E、N109Q、N109R、N109K、N109H、 N109G、D108E、T83N、L575F和K534V/K573P，如上所述的进行制备。
表4a：白蛋白变体对shFcRn-HIS的结合亲和力
*11个的平均值以及标准偏差**5个的平均值以及标准偏差。
表4b
*8个的平均值以及标准偏差**5个的平均值以及标准偏差。
数据证实108至111环在HSA结合至FcRn中的作用，其中在D108A和 N111K变体中观察到降低的结合亲和力(表2)。在位置111处的另外突变证 实了结合亲和力的范围，与WT HSA相比，从对于N111K变体观察到的降低的 亲和力，直到展现出对于FcRn的增加的亲和力的N111E变体(表4)。变体 N111Q/K573P(图5，SEQ ID NO:74)显示了与wt HSA相比具有增加的反应 的结合曲线，以及与wt HSA相比更慢的缔合，这与K573P取代是一致的。 HSA的环区域108至112与FcRn的相对位置(图6)表明该区域具有贡献于 FcRn结合的潜力，如在实例2中所预示的。另外关于图5和6的细节提供于WO 2012/150319(PCT/EP12/058206，通过引用结合于此)中。
结构域I(结构域1)的邻接环区(包括残基78至88)的相对位置(图6) 表明该区域具有贡献于FcRn结合的潜力。这由观察到T83N变体显示相比于 WT HSA的对FcRn的增加的亲和力所证实(表4)。
将预示邻接残基特别是E82、P110和L112的突变(图6)会改变HSA对 FcRn的结合亲和力。
实例5：白蛋白变体对FcRn的结合亲和力的SPR分析
在Biacore3000仪器(GE医疗)上进行SPR分析。按照生产商说明书使用 GE医疗胺偶联化学，在偶联shFcRn(GeneArt1177525)的CM5芯片上进行固 定化。shFcRn-HIS(shFcRn与在β-2-微球蛋白的C-端上的6-His尾)的固定化 水平是约1200RU，并且是通过注射20μg/mL shFcRn于乙酸钠pH4.5(GE医 疗)中来实现。留置芯片表面以将其用恒定流速(5μL/min)的运行缓冲液 (即双碱性/单碱性磷酸缓冲液pH5.5)在25℃过夜稳定。在配体稳定后，将 芯片表面通过以下方式来调节：以30μL/min注射3×45μL双碱性/单碱性磷 酸缓冲液，随后注射pH7.4的HBS_EP(0.01M HEPES，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P20)(GE医疗)在各个注射之间再生步骤 (12s)。然后通过以30μL/min注射3×45μL阳性对照、随后12s的再生脉 冲，来针对活性对表面进行检查。
pH5.5结合分析：通过一式两份地以30μL/min将45μL的20μM(稀释于 pH5.5缓冲液中)的分析物注射入pH5.5的运行缓冲液中来获得对于结合数据 的传感图。注射后进行2×12s再生脉冲，以恢复基线(HBS-EP pH7.4；10 μL，以50μL/min)。然后将对照减去，并且使用BiaEvaluation软件4.1来获得 结合分析数据。
pH5.5动力学分析：对于动力学数据的传感图是通过在注射后90s延迟之 内(以允许动力学模型的平缓的解离)以30μL/min将45μL的五个浓度即20 μM、4μM、0.8μM、0.16μM和0.032μM的分析物注射入pH5.5的运行缓冲液 中来获得的。注射后进行2×12s再生脉冲，以恢复基线(HBS-EP pH7.4； 10μL，以50μL/min)。对两种分开的情况进行分析。然后将参照细胞值减 去，并且使用Biaevaluation软件4.1来获得动力学数据并且确认KD值。
使用SPR鉴定变体对FcRn的结合反应，结果显示在表5a和5b中。
表5a：
分子 SEQ ID NO 结合反应(RU)
WT rHSA 2 229
HSA K573P 3 300
HSA T83K 35 194
HSA T83K/K573P 38 285
HSA E82A 36 221
HSA E82A/K573P 39 275
HSA E82D 41 227
HSA E82D/K573P 43 269
HSA P110G 42 235
HSA P110G/K573P 44 284
HSA L112F 37 253
HSA L112F/K573P 40 290
显示的值是两次运行的平均值。
表5b：
分子 SEQ ID NO 结合反应(RU)
WT rHSA 2 148
HSA K573P 3 181
HSA T83N/N111E 32 167
显示的值是两次运行的平均值。
对变体进行KD分析以评定相对于HSA-K573-FcRn结合亲和力的变体- FcRn结合亲和力。这些结果示于表6中。进行进一步的分析以计算结合亲和力 (表7)。
表6：
表7
数据显示HSA T83N/N111E/K573P和HSA T83N/K573P相对于野生型HSA 具有高的FcRn结合亲和力。与野生型HSA与FcRn的结合相比，HSA E82A和 HSA L112F两者显示与FcRn的改进的结合，并且这表明包含HSA(SEQ ID NO:2)的氨基酸78至88以及HSA(SEQ ID NO:2)的氨基酸105至120的环参 与HSA与FcRn的结合。
在位置L112或T83处具有单一突变的HSA显示与彼此相似的FcRn结合亲 和力。然而，与T83和K573的双重突变相比，L112和K573的双重突变具有对 FcRn的更强的结合亲和力。
表8
表8的数据显示HSA-E82D相对于野生型白蛋白具有低的FcRn结合亲和 力，并且HSA-K573P相对于野生型白蛋白具有高的FcRn结合。然而，双重突 变体HSA-E82D/K573P显示与HSA-K573P相同的FcRn结合亲和力，即E82D取 代的包含不会不利地影响FcRn结合。
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