一种源于带鱼鱼肉蛋白的铁螯合肽及其制备方法和用途.pdf

本发明涉及一种源于带鱼鱼肉蛋白的铁螯合肽的制备方法，具体讲是以带鱼鱼肉为原料，利用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶对带鱼鱼肉蛋白进行酶解，采用超滤、大孔树脂柱层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到铁螯合肽Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met，ESI/MS测定分子量为1045.18Da。带鱼鱼肉蛋白铁螯合肽由于其独特的螯合和转运机制，吸收利用度高，又可同时补充多肽/氨基酸和铁，是一种理想的补铁物质。

权利要求书
1.  一种源于带鱼鱼肉蛋白的铁螯合肽，其特征在于该铁螯合肽的氨基酸序列为Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met，ESI/MS测定分子量为1045.18 Da。

2.  一种权利要求1所述的一种源于带鱼鱼肉蛋白的铁螯合肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）带鱼鱼肉的预处理：将洗净、去骨和皮的带鱼鱼肉按照固液比1 g:2 mL ~3mL放入缓冲液中，用高速组织捣碎机将其处理成匀浆，然后按照体积比1:3~ 5mL放入乙醚中脱脂4 ~ 6 h，4 ℃、5000 ~ 6000 rpm，15 ~ 20 min离心除去乙醚，沉淀物冷冻干燥即为脱脂带鱼鱼肉；
按照料液比1g:20~25 mL向脱脂带鱼鱼肉中加入磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L，pH 6.5），按照脱脂带鱼鱼肉质量的1.5~2.5%向溶液中加入木瓜蛋白酶（酶活力≥2.0×104 U/g），于温度55~65℃下酶解4~6 h后，将溶液升温至90 ℃~ 95℃，并于此温度保持10~15min后，冷却至室温；用NaOH调溶液pH到7.5~8.5，按照蛋白质量的1.5 ~2.0%向溶液中加入胰蛋白酶（酶活力≥2.5×104 U/g），于温度35~45℃下酶解3~4 h，得酶解产物；
3）带鱼鱼肉蛋白铁螯合肽的制备：将制备的带鱼鱼肉蛋白酶解产物采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有10～15倍AB-8大孔树脂的层析柱中，用3～5倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5～8倍柱体积的95%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到带鱼鱼肉蛋白铁螯合肽。

3.  根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤1）中的中的带鱼为日本带鱼（Trichiurus japonicus）。

4.  根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3）的凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化的具体过程为：
凝胶柱层析：将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为25~30 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶LH-20柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高铁螯合活性的峰为凝胶层析酶解物；
RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80~100 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对铁的螯合活性得1个高铁螯合活性肽Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met。

5.  根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述RP-HPLC条件为：进样量为10~15 μL；色谱柱Kromasil C18 为250 mm×4.6 mm，5 μm；流动相为20%乙腈；洗脱速度0.8~1.0 mL/min；紫外检测波长220 nm。

6.  权利要求1所述的一种源于带鱼鱼肉蛋白的铁螯合肽用于制备补铁药物和保健品中的用途。

说明书一种源于带鱼鱼肉蛋白的铁螯合肽及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种源于带鱼鱼肉蛋白铁螯合肽及其制备方法，属于水产品精深加工技术领域。
背景技术
生物活性肽是指那些有特殊生理活性的肽类，是当前药物及保健品研究的热点。目前，通过蛋白酶解生产的活性肽主要来源于陆地的蛋白源，海洋生物生存环境明显区别于陆地环境，其蛋白质的氨基酸组成或序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，在种类和数量上也远远超过陆源蛋白资源。因此，借鉴陆地活性肽开发的酶工程技术，以海洋生物蛋白资源为原料，通过对制备工艺的综合研究，将研制出陆地蛋白源和化学合成所无法生产的系列天然、高效、新颖的生物活性肽。
铁是人类的必须的微量元素，对婴幼儿和儿童的生长发育至关重要。大分子蛋白质虽然也可以与铁离子结合，但铁螯合蛋白质分子量大，难以通过肠黏膜，不利于铁离子的吸收。而现有的研究表明，铁螯合肽可以大大提高铁离子的吸收利用率，同时多肽也具有多种显著的生物活性，表现出双重功效。
基于此，本发明根据铁螯合肽和带鱼鱼肉蛋白多肽的研究现状，提供一种源于带鱼鱼肉蛋白的铁螯合肽，并提供这种铁螯合肽的制备方法。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种源于带鱼鱼肉蛋白的铁螯合肽。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种源于带鱼鱼肉蛋白的铁螯合肽的制备方法。
本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种源于带鱼鱼肉蛋白的铁螯合肽，其特征在于该多肽的氨基酸序列为Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met（APPENGMAQM），ESI/MS测定分子量为1045.18 Da。
本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种源于带鱼鱼肉蛋白的铁螯合肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）带鱼鱼肉的预处理：将洗净、去骨和皮的带鱼鱼肉按照固液比1 g:2 mL ~3mL放入磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L，pH 6.5）中，用高速组织捣碎机将其处理成匀浆，然后按照体积比1:3~ 5mL放入乙醚中脱脂4 ~ 6 h，4 ℃、5000 ~ 6000 rpm，15 ~ 20 min离心除去乙醚，沉淀物冷冻干燥即为脱脂带鱼鱼肉。
）带鱼鱼肉蛋白的酶解：按照料液比1g:20~25 mL向脱脂带鱼鱼肉中加入磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L，pH 6.5），按照脱脂带鱼鱼肉质量的1.5~2.5%向溶液中加入木瓜蛋白酶（酶活力≥2.0×104 U/g），于温度55~65℃下酶解4~6 h后，将溶液升温至90℃~ 95℃，并于此温度保持10~15min后，冷却至室温；用NaOH调溶液pH到7.5~8.5，按照蛋白质量的1.5 ~2.0%向溶液中加入胰蛋白酶（酶活力≥2.5×104 U/g），于温度35~45℃下酶解3~4 h，得酶解产物；
3）带鱼鱼肉蛋白铁螯合肽的制备：将制备的带鱼鱼肉蛋白酶解产物采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有10～15倍AB-8大孔树脂的层析柱中，用3～5倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5～8倍柱体积的95%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到带鱼鱼肉蛋白铁螯合肽。
作为优选，所述的步骤1）中的带鱼为日本带鱼（Trichiurus japonicus）。
作为优选，所述步骤4）的凝胶柱层析和RP-HPLC纯化的具体过程为：
凝胶柱层析：将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为25~30 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶LH-20柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高铁螯合活性的峰为凝胶层析酶解物；
RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80~100 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对铁的螯合活性得1个高铁螯合活性肽Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met（APPENGMAQM）。
再优选，所述RP-HPLC条件为：进样量10~15 μL；色谱柱Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相20%乙腈；洗脱速度0.8~1.0 mL/min；紫外检测波长220 nm。
本发明基于多肽与金属离子螯合的理论基础，以及多肽-铁螯合物的独特功效（可同时补充多肽/氨基酸和铁），以带鱼鱼肉为原材料，通过对木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的酶解条件控制，制备具有高铁螯合活性的多肽。本发明为补铁保健食品和药物开发提供了一种技术支持。
附图说明
图1是本发明的葡聚糖凝胶LH-20层析图。
图2是本发明的葡聚糖凝胶LH-20制备酶解物的RP-HPLC分析图。
图3 是本发明的Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met（APPENGMAQM）的质谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
一种源于带鱼鱼肉蛋白的铁螯合肽的制备方法，制备工艺流程如下：带鱼鱼肉"脱脂"酶解"酶解物"超滤"AB-8大孔树脂纯化"凝胶过滤层析"RP-HPLC制备"铁螯合肽。
实施例：1）带鱼鱼肉的预处理：将洗净、去骨和皮的日本带鱼（Trichiurus japonicus）鱼肉按照固液比1 g: 3mL放入缓冲液中，用高速组织捣碎机将其处理成匀浆，然后按照体积比1: 5mL放入乙醚中脱脂5 h，4 ℃、6000 rpm，15 min离心除去乙醚，沉淀物冷冻干燥即为脱脂带鱼鱼肉。
2）带鱼鱼肉蛋白的酶解：按照料液比1g: 25 mL向脱脂带鱼鱼肉中加入磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L，pH 6.5），按照脱脂带鱼鱼肉质量的2.5%向溶液中加入木瓜蛋白酶（酶活力≥2.0×104 U/g），于温度60℃下酶解6 h后，将溶液升温至95℃，并于此温度保持10 min后，冷却至37℃；用NaOH调溶液pH到8.0，按照蛋白质量的2.0%向溶液中加入胰蛋白酶（酶活力≥2.5×104 U/g），于温度37℃下酶解4 h，得酶解产物；
3）带鱼鱼肉蛋白铁螯合肽的制备：将制备的带鱼鱼肉蛋白酶解产物采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有15倍AB-8大孔树脂的层析柱中，用5倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用6倍柱体积的95%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到带鱼鱼肉蛋白铁螯合肽，利用氨基酸序列分析仪和质谱测定其结构，具体过程为：
①凝胶柱层析：将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为25~30 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶LH-20柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高铁螯合活性的峰为凝胶层析酶解物（F2）（图1）；
②RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80~100 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化（进样量10~15 μL；色谱柱Kromasil C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相20%乙腈；洗脱速度0.8~1.0 mL/min；紫外检测波长220 nm），根据对铁的螯合活性得1个高铁螯合活性肽（图2）。
    ③结构检测：铁螯合肽经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met（APPENGMAQM），ESI/MS测定分子量为1046.17 Da。
采用邻菲罗啉比色法，测定带鱼鱼肉蛋白源螯合肽对铁离子的螯合作用。将0.05 g样品置于100 mL烧杯中，加入2 mL浓盐酸，待样品完全溶解后，用蒸馏水定容至100 mL容量瓶中。准确吸取5 mL样品液于50 mL容量瓶中，加入1 mol/L的HCl溶液1 mL，10%的盐酸羟胺l mL，0.12%邻菲罗啉1 mL，然后加入10%醋酸钠5 mL，用水稀释至刻度，摇匀。以不加铁的试剂空白溶液作参比液，在510 nm波长处测定吸光度，将数值代入标准曲线中计算出铁结合量。
标准曲线的制作：吸取10 μg/mL铁的标准溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分别置于50 mL容量瓶中，加入l mol/L的HCl溶液1 mL，10%的盐酸羟胺l mL，0.12%邻菲罗啉1 mL，然后加入10%醋酸钠5 mL，用水稀释至刻度，摇匀。以不加铁的试剂空白溶液作参比液，在510 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线，得标准曲线公式为：y = 0.1873x+0.011，R2 = 0.9998。
测定结果表明：纯化得到的铁螯合肽Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met（APPENGMAQM）对铁离子的螯合能力为74.69 μg/mg，与蛋白酶解产物（33.52 μg/mg）相比其对铁的螯合能力有了较大提高。
最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
      SEQUENCE LISTING
 
<110>  浙江海洋学院
 
<120>  一种源于带鱼鱼肉蛋白的铁螯合肽及其制备方法和用途
 
<130>  zjou-wb201503
 
<160>  1    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工合成
 
<400>  1
 
Ala Pro Pro Glu Asn Gly Met Ala Gln Met
1               5                   10