说明书通过蜕皮素受体复合物调节外源性基因表达的手性二酰基肼配体
本申请是申请日为2008年5月29日，申请号为200880100879.X，发明名称为“通过蜕皮素受体复合物调节外源性基因表达的手性二酰基肼配体”的申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及生物技术、基因工程和药物化学领域。在一个实施方案中，本发明涉及基因表达的领域。在另一个实施方案中，本发明涉及天然和突变的核受体的二酰基肼配体和手性二酰基肼配体以及它们在基于核受体的可诱导的基因表达系统中的用途，以及使用这些配体和可诱导的基因表达系统在宿主细胞中调节基因表达的方法。
背景
本文引用了各种出版物，其公开内容通过引用被全文并入。然而，本文任何参考文献的引用不应被解释为承认该参考文献对于本申请是可以作为“现有技术”的。
在基因工程领域，基因表达的精确控制是研究、操作和控制发育和其他生理过程的有价值的工具。基因表达是复杂的生物过程，其包括许多特异性蛋白-蛋白相互作用。为了触发基因表达以便其产生蛋白合成第一阶段中必要的RNA，必须将转录激活子接近控制基因转录的启动子。通常地，转录激活子自身与具有至少一个DNA结合结构域的蛋白缔合，所述DNA结合结构域结合存在于基因启动子区域的DNA结合位点。因此，为了使基因表达发生，包括DNA结合结构域和位于所述DNA结合结构域适当距离处的反式激活结构域的蛋白必须被置于基因的启动子区域中正确的位置。
传统的转基因方法利用细胞类型特异性的启动子来驱使设计的转基 因的表达。先将含有所述转基因的DNA构建体整合进宿主基因组。当被转录激活子触发时，转基因的表达在所给细胞类型中发生。
调控外源性基因在细胞中的表达的另一种方法是通过可诱导的启动子。使用这种可诱导的启动子的例子包括PR1-a启动子、原核的抑制子-操纵子系统、免疫抑制性抑免蛋白系统和更高级的真核转录激活系统例如类固醇激素受体系统，并描述如下。
来自烟草的PR1-a启动子在病原体攻击之后全身获得性抵抗应答中被诱导。PR1-a的用途可被限制，因为它经常对内源性物质和外部的因子例如病原体、UV-B辐射和污染物产生应答。基于由热激、干扰素和重金属所诱导的启动子的基因调控系统已被描述(Wurn等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 55:5414-5418(1986)；Arnheiter等,Cell 62:51-61(1990)；Filmus等,Nucleic Acids Research 20:27550-27560(1992))。然而，这些系统由于它们对非靶基因的表达的作用而具有局限性。这些系统还是有漏洞的。
原核的抑制子-操纵子系统使用细菌抑制子蛋白和它们所结合的独特的操纵子DNA序列。来自大肠杆菌的四环素(“Tet”)和乳糖(“Lac”)抑制子-操纵子系统二者都已被用在植物和动物中以控制基因表达。在Tet系统中，四环素结合至TetR抑制子蛋白，导致构象变化，其将抑制子蛋白从操纵子释放出来，并因此允许转录发生。在Lac系统中，乳糖操纵子响应于乳糖或合成的类似物例如异丙基-b-D-硫代半乳糖苷的存在而被激活。不幸地，这种系统的使用受到配体即四环素和乳糖的不稳定化学性质、它们的毒性、它们的天然存在或者诱导或抑制所需要的相对高水平的限制。由于相似原因，这种系统在动物中的使用受到限制。
免疫抑制分子例如FK506、雷帕霉素和环孢菌素A可结合至抑免蛋白FKBP12、亲环蛋白等。使用此信息，已经设计了总体战略以简单地通过将FK506置于两种蛋白中的每种上或者通过将FK506置于一种上并将环孢菌素A置于另外一种上，而将任何两种蛋白结合在一起。然后可使用FK506(FK1012)的合成同二聚体或由FK506-环孢菌素(FKCsA)融合所得的化合物来诱导这些分子的二聚化(Spencer等,Science 262:1019-24(1993)；Belshaw等,Proc Natl Acad Sci USA 93:4604-7(1996))。融合至 FKBP12的Gal4 DNA结合结构域和融合至亲环蛋白和FKCsA化合物的VP16激活子结构域被用来显示异二聚化和报道基因在含有Gal4结合位点的启动子的控制下的激活。不幸地，该系统包括可具有不需要的副作用的免疫抑制剂，并因此限制它用于各种哺乳动物基因开关应用。
还使用了更高级的真核转录激活系统例如类固醇激素受体系统。类固醇激素受体是核受体超家族的成员，并在脊椎动物和无脊椎动物细胞中被发现。不幸地，为了调控基因表达而激活所述受体的类固醇化合物特别地在植物和动物中的使用由于它们参与这些生物体中许多其他天然生物途径而受到限制。为了克服这种困难，使用昆虫蜕皮素受体(EcR)开发了一种替代系统。
昆虫的生长、蜕皮和发育受到蜕皮素类固醇激素(蜕皮激素)和保幼激素调控(Dhadialla等,Annu.Rev.Entomol.43:545-569(1998))。蜕皮素在昆虫体内的分子靶至少由蜕皮素受体(EcR)和超气门蛋白(USP)组成。EcR是特征为签名DNA和配体结合域和激活结构域的核类固醇受体超家族的成员(Koelle等,Cell,67:59-77(1991))。EcR受体对若干类固醇化合物例如松甾酮A和米乐甾酮(muristerone)A进行应答。最近，描述了具有蜕皮类固醇激动剂活性的非类固醇化合物，其包括由Rohm和Haas公司销往全世界的商业上可得的杀虫剂虫酰肼(tebufenozide)和甲氧虫酰肼(methoxyfenozide)(参见WO 96/27673和US 5,530,028)。两种类似物在其他生物体内都具有出色的安全性概况。
昆虫蜕皮素受体(EcR)与超气门蛋白(USP)即哺乳动物的类视黄醇X受体(RXR)的昆虫同系物发生异二聚化作用，并结合蜕皮类固醇和蜕皮素受体应答元件，并激活对蜕皮素应答的基因的转录。EcR/USP/配体复合物在昆虫的发育和繁殖中起重要作用。EcR有五个组件式结构域，A/B(反式激活)、C(DNA结合，异二聚化)、D(铰链，异二聚化)、E(配体结合，异二聚化和反式激活)和F(反式激活)结构域。当与其他蛋白融合时，这些结构域中的一些例如A/B、C和E保持它们的功能。
紧密地调控的可诱导的基因表达系统或“基因开关”对于各种应用是有用的，其中所述应用例如基因疗法、细胞中蛋白的大规模生产、基于细 胞的高通量筛选测定、功能性基因组学和转基因植物和动物性状的调控。
第一种型式的基于EcR的基因开关使用了黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)EcR(DmEcR)和小家鼠(Mus musculus)RXR(MmRXR)，并且显示了这些受体在类固醇松甾酮A存在下反式激活哺乳动物细胞系和转基因小鼠中的报道基因(Christopherson等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:6314-6318(1992)；No等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:3346-3351(1996))。随后，Suhr等,Proc.Natl.Acad.Sci.95:7999-8004(1998)显示非类固醇蜕皮素激动剂虫酰肼通过家蚕(Bombyx mori)EcR(BmEcR)在不存在外源性异二聚体配偶体的情况下诱导了哺乳动物细胞中报道基因的高水平的反式激活。
WO 97/38117和WO 99/58155公开了调节外源性基因表达的方法，其中包括外源性基因和蜕皮素应答元件的DNA构建体被包括蜕皮素受体的第二DNA构建体所激活，其中所述蜕皮素受体因此在配体的存在下，或者可选地在能够作为沉默配偶体起作用的受体的存在下，结合至蜕皮素应答元件以诱导基因表达。所选的蜕皮素受体是从黑腹果蝇分离的。通常，为了提供最佳的激活，这种系统需要沉默配偶体的存在，优选地为类视黄醇X受体(RXR)。在哺乳动物细胞中，昆虫蜕皮素受体(EcR)与类视黄醇X受体(RXR)异二聚化，并以配体依赖的方式来调控靶基因的表达。WO 99/02683公开，分离自家蚕的蜕皮素受体在哺乳动物系统中是有功能的，而不需要外源性二聚体配偶体。
US 6,265,173 B1公开，受体的类固醇/甲状腺超家族的各成员可与黑腹果蝇超气门受体(USP)或至少包括USP二聚化结构域的其片段相结合以用于基因表达系统。US 5,880,333公开了用在植物中的黑腹果蝇EcR和超气门(USP)异二聚体系统，在其中反式激活结构域和DNA结合结构域被置于两种不同的杂交蛋白上。不幸地，这些基于USP的系统在动物细胞中是组成性的，并因此对于调控报道基因表达是无效的。
在这些情况的每种中，反式激活结构域和DNA结合结构域(或者作为WO 99/02683中天然的EcR或者作为WO 97/38117中修饰的EcR)被并入单个分子中，而且另一个异二聚体配偶体USP或RXR以它们的天然 状态被使用。
近来，据显示，基于蜕皮素受体的可诱导基因表达系统导致了在不存在配体的情况下大大减少的背景活性和在有配体存在的情况下显著增加的背景活性，在其中所述基因表达系统中通过将它们置于两种不同蛋白上而将反式激活和DNA结合结构域互相分离(参见WO 01/70816 A1，以其整体通过引用并入本文)。与在申请WO 97/38117和WO 99/02683中公开的两种系统相比，该双杂交系统是显著地改进的可诱导的基因表达调节系统。所述双杂交系统利用一对相互作用蛋白的能力来将转录激活结构域带到相对于DNA结合结构域更有利的位置，以致于当DNA结合结构域结合至基因上的DNA结合位点时，反式激活结构域更有效地激活启动子(参加，例如，US 5,283,173)。简单说，所述双杂交基因表达系统包括两个基因表达盒；编码DNA结合结构域的第一个融合至核受体多肽，而且编码反式激活结构域的第二个融合至不同的核受体多肽。在配体存在下，第一多肽与第二多肽的相互作用有效地将DNA结合结构域束缚在反式激活结构域上。由于DNA结合和反式激活结构域位于两个不同分子上，在不存在配体的情况下背景活性大大减少。
当与类固醇配体例如松甾酮A(“PonA”)或米乐甾酮(“MurA”)相比时，双杂交系统还提供对非类固醇配体例如二酰基肼增强的敏感性。那就是，当与类固醇比较时，非类固醇配体在较低浓度下提供更高活性。另外，因为基于EcR基因开关的反式激活通常是细胞系依赖性的，所以较容易为每种应用定制基因开关系统以获得最大的反式激活能力。此外，双杂交系统避免一些由于RXR过表达的副作用，而所述过表达通常发生在将未被修饰的RXR用作异二聚体受体的配偶体之时。在一个双杂交系统中，EcR或RXR的天然DNA结合和反式激活结构域被消除，因此这些杂交分子具有更少的与存在于细胞中的其他类固醇受体相互作用的机会，并导致减少的副作用。另外的基因开关系统包括描述在下面的那些，其中每一种都通过引用被并入：US 7,091,038、WO2004078924、EP1266015、US20010044151、US20020110861、US20020119521、US20040033600、US20040197861、US20040235097、US20060020146、US20040049437、 US20040096942、US20050228016、US20050266457、US20060100416、WO2001/70816、WO2002/29075、WO2002/066612、WO2002/066613、WO2002/066614、WO2002/066615、WO2005/108617、US 6,258,603、US20050209283、US20050228016、US20060020146、EP0965644、US 7,304,162、US 7,304,161、MX234742、KR10-0563143、AU765306、AU2002-248500和AU2002-306550。
发明概述
上述基于EcR的基因调控系统的缺点包括在配体不存在时相当大的背景活性和这些系统用于植物和动物二者时的不适用性(参见US 5,880,333)。因此，本领域存在改进基于EcR的系统以精确调节外源性基因在植物和动物中的表达的需要。这种改进的系统将有用于一些应用，例如基因疗法、蛋白和抗体的大规模生产、基于细胞的高通量筛选测定、功能性基因组学和转基因动物性状的调控。对于特定的应用例如基因疗法，可能期望有一个可诱导的基因表达系统，其对合成的非类固醇配体很好地应答，并同时对天然类固醇不敏感。因此，简单的、紧凑的并依赖于相对便宜的、容易获得的和对宿主毒性低的配体的改进的系统将被证明对于调控生物系统是有用的。
随着基于蜕皮素受体的基因调控系统的改进，它们在各种应用中的使用增加了，这导致了对于比目前存在的那些具有更高活性的配体的需求的增加。US 6,258,603 B1、US 2005/0209283 A1和US 2006/0020146 A1(以及其中所引用的专利)公开了二苯甲酰肼配体。然而，还存在对于具有改进的药学特性的另外配体的需要。申请人已经发现了之前未被描述过的手性二酰基肼配体，其具有令人吃惊的生物活性和以预料不到的方式调节转基因表达的能力。
本发明提供与基于蜕皮素受体的可诱导基因表达系统一起使用的式I的二酰基肼配体和式II或III的手性二酰基肼配体，其中所述基于蜕皮素受体的可诱导基因表达系统对于调节宿主细胞中感兴趣的靶基因的表达 是有用的。本发明的手性二酰基肼配体以R-或S-立体异构体的形式对映体富集。申请人已经发现这些新的手性二酰基肼配体令人吃惊地有效。因此，本发明有用于应用例如基因疗法、蛋白和抗体的大规模生产、基于细胞的筛选测定、功能性基因组学、蛋白组学、代谢物组学和转基因生物体性状的调控，其中基因表达水平的控制是期望的。本发明的优势是，它提供一种调控基因表达并定制表达水平以适应使用者的要求的方法。
本发明涉及式I的化合物或者其药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或无定形形式
其中
A是烷氧基、芳烷氧基或芳氧基；
B是可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；并且
R1和R2独立是可选地取代的烷基、芳烷基、羟烷基、卤代烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的杂环、可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基。
在另一个实施方案中，本发明涉及对映体富集的式II的化合物或者其药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或无定形形式
其中
A是烷氧基、芳烷氧基、芳氧基、芳烷基、可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；
B是可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；并且
R1和R2独立是可选地取代的烷基、芳烷基、羟烷基、卤代烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的杂环、可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；
条件是R1不等同于R2；
其中在含有R1和R2的不对称碳原子处的绝对构型主要为S。
在另一个实施方案中，本发明涉及对映体富集的式III的化合物或者其药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或无定形形式
其中
A是烷氧基、芳烷氧基、芳氧基、芳烷基、可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；
B是可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；并且
R1和R2独立是可选地取代的烷基、芳烷基、羟烷基、卤代烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的杂环、可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；
条件是R1不等同于R2；
其中在含有R1和R2的不对称碳原子处的绝对构型主要为R。
在一个实施方案中，本发明涉及具有至少95％的对映体过量的(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼或其药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或无定形形式。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其包括具有至少95％的对映体过量的(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼或其药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或无定形形式。
本发明还涉及式IV的化合物的制备过程
其中
A是芳烷基、可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；
B是可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；
R2是可选地取代的烷基、芳烷基、羟烷基、卤代烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的杂环、可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；
条件是R2不等同于-CR8R9CHR10CR11R12；并且
R8、R9、R10、R11和R12独立选自氢、烷基、环烷基、杂环、芳基或杂芳基；
其中R2所连接的不对称碳原子以R或S异构体的形式对映体富集；
所述过程包括：
a)将式V的化合物
与式VI的化合物进行反应
R2HC＝N-NH-CO2R7 式VI
其中
X和Y独立为O或NR，其中R是烷基或芳基；
Ca和Cb独立为S构型的不对称碳原子或R构型的不对称碳原子；
R14和R15独立为烷基或芳基；
R13是卤素、氢、烷基、烷氧基或OSO2CF3；
R7是烷基、芳烷基或芳基；并且
R2、R8、R9、R10、R11和R12具有上述相同的含义；
以形成式VII的化合物；
b)将式VII的化合物还原以形成式VIII的化合物；
c)将式VIII的化合物与式B-CO-LG的化合物进行反应以形成式IX的化合物，其中LG是离去基团；
d)将式IX的化合物的R7CO2-基团移除以形成式X的化合物；并且
e)将式X的化合物与式A-CO-LG的化合物进行反应以形成式IV的化合物，其中LG是离去基团。
本发明还涉及调节宿主细胞中基因表达的方法，其使用带有式I的二酰基肼配体或者式II或III的手性二酰基肼配体的基因表达调节系统。
在一个实施方案中，本发明涉及式I的二酰基肼配体或者式II或III的手性二酰基肼配体在可诱导的基因表达系统中的用途，其中所述可诱导 的基因表达系统具有水平降低的背景基因表达并对配体的亚微摩尔浓度进行应答。
在另一个实施方案中，本发明涉及调节宿主细胞中靶基因表达的方法，其中所述宿主细胞包括第一基因表达盒，其包括编码第一多肽的第一多核苷酸，其包括：
i)反式激活结构域；
ii)DNA结合结构域；和
iii)组H核受体配体结合结构域；
以及第二基因表达盒，其包括：
i)能够结合至所述DNA结合结构域的应答元件；
ii)由反式激活结构域所激活的启动子；和
iii)所述靶基因；
所述方法包括将所述宿主细胞与式I的二酰基肼配体或者式II或III的手性二酰基肼配体相接触；其中靶基因的表达受到调节。
在另一个实施方案中，本发明涉及调控转基因受试者中内源性或异源性基因的表达的方法，其包括将配体与所述受试者的细胞中的蜕皮素受体复合物相接触，其中所述细胞在与配体结合时还包含蜕皮素受体复合物的DNA结合序列，而且其中蜕皮素受体复合物-配体-DNA结合序列复合物的形成诱导基因表达，而且其中所述配体是式I的二酰基肼配体或者式II或III的手性二酰基肼配体，其中转基因受试者的内源性或异源性基因表达受到调控。
在另一个实施方案中，本发明涉及调节宿主细胞中靶基因表达的方法，其包括步骤：
a)将基因表达调节系统引入宿主细胞，所述基因表达调节系统包括：
i)第一基因表达盒，其能够被表达在宿主细胞中，所述第一基因表达盒包括编码第一杂交多肽的多核苷酸序列，其包括：
(a)识别与其表达待调节的基因缔合的应答元件的DNA结合结构域； 和
(b)蜕皮素受体配体结合结构域；
ii)第二基因表达盒，其能够被表达在宿主细胞中，所述第二基因表达盒包括编码第二杂交多肽的多核苷酸序列，其包括：
(a)反式激活结构域；和
(b)嵌合的类视黄醇X受体的配体结合结构域；以及
iii)第三基因表达盒，其能够被表达在宿主细胞中，所述第三基因表达盒包括多核苷酸序列，其包括：
(a)被第一杂交多肽的DNA结合结构域所识别的应答元件；
(b)被第二杂交多肽的反式激活结构域所激活的启动子；和
(c)其表达将受到调节的基因；以及
b)将式I的二酰基肼配体或者式II或III的手性二酰基肼配体引入宿主细胞，其中宿主细胞的基因表达受到调节。
在另一个实施方案中，本发明涉及产生多肽的方法，其包括步骤：
a)选择一种细胞，其对暴露于式I的二酰基肼配体或者式II或III的手性二酰基肼配体基本上不敏感；
b)将下述引入细胞：
i)DNA构建体，其包括：
(a)编码所述多肽的外源性基因；和
(b)应答元件；
其中所述基因是在所述应答元件的控制下；以及
ii)蜕皮素受体复合物，其包括：
(a)结合至应答元件的DNA结合结构域；
(b)所述配体的结合结构域；和
(c)反式激活结构域；以及
c)将所述细胞暴露于所述配体；其中多肽被产生。
本发明的该实施方案提供在时间上控制细胞中多肽产生的优势。此外，在那些情况下当这种多肽的聚集能破坏细胞时，所述多肽的表达可通过将所述细胞暴露于本发明的化合物而被限制在短时段内。这种控制在当外源性基因是治疗基因时特别地重要。可以使用治疗基因来产生控制所需功能的多肽，例如糖尿病患者中胰岛素的产生。它们还可被用来产生破坏性的或甚至致死性的蛋白，例如对癌细胞致死的那些。当所产生的蛋白水平可构成例如转基因植物中生长或繁殖的代谢消耗时，这种控制还可以是重要的。
附图简述
图1：开关构建体CVBE和报道分子构建体6XEcRE Lac Z的示意图。两种构建体的两侧都是长末端重复序列，G418和嘌呤霉素是可选的标志物，CMV是细胞巨化病毒启动子，VBE是被插入VP16反式激活结构域下游的家蚕EcR的氨基酸26-546的编码序列，6X EcRE是六个拷贝的蜕皮素应答元件，lacZ编码报道酶β-半乳糖苷酶。
图2A-2C：(A)外消旋-、(B)(R)-和(C)(S)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2,6-二氯-苯甲酰)-酰肼的手性HPLC对比。
图3：显示体内对比外消旋-、(R)-和(S)-2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼对于小鼠中治疗系统基因表达的诱导的图。实心圆圈是S对映体，实心三角是外消旋物，而空心圆圈是R对映体。
图4：2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的外消旋物和R对映体样品批的表格。通过从甲醇/水或甲苯/庚烷的快速结晶/沉淀获得的R对映体的样品产生了相同的粉末X-射线衍射图形(数据未显示)，并且具有互相比较基本上相同的熔点([甲苯/庚烷]166.2-167.1℃，[CH3OH/H2O]166.5-167.4℃)，以及与得自CH3OH结晶的标准(165.1-166.5℃)相比基本相同的熔点。通过甲醇蒸发获得的外消 旋物两种分开的制剂的样品显示在实验误差内相同的熔点(170-171℃，169-170℃)和纯度的轻微变动。
图5：显示2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的微粒化的R对映体的粒度分布的表格。
图6：显示2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的微粒化的外消旋物的粒度分布的表格。
图7：显示2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的微粒化的外消旋物和R对映体的堆密度和拍实密度分析的表格。
图8：2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的微粒化的外消旋物和R对映体的热重分析/差热分析(TGA/DTA)(热绘图)证明了不同的结晶形式。批号：REH-28-9-1和REH-28-4-2；样品重量7.71994mg。信号输出的单位是uV每mg样品(uV/mg)；热重–样品的百分比重量改变(TG％)。两种物质都在DTA概况上显示吸热作用。R对映体的起始温度(163.6℃)比外消旋物的起始温度(171.2℃)显著较低。R对映体的熔化热(59.8uv.s/mg)比外消旋物的熔化热(80.8uv.s/mg)显著较低。
图9：显示药物赋形剂中2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的外消旋物和R对映体的定性对比溶解度测试的表格。
图10：显示热力学平衡测定(90℃下进行5分钟或所指示的时间；处理2)结果的表格，所述测定之后冷却到室温并将2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的外消旋物和R对映体的晶种放入药物赋形剂。处理1是在室温下搅拌≤2.5小时的结果。
图11：显示2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的外消旋物和R对映体在20％PEG 1000的蒸馏水溶液(pH 7.0)中的溶解度(μM)的表格。
图12：显示2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲 基-苯甲酰)-酰肼的外消旋物和R对映体在水性聚山梨醇酯80中的溶解度的表格。
图13：显示2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的外消旋物和R对映体穿过Caco-2细胞单层的双向通透性的表格。a通透性分类：(Papp A→B)<1.0X10-6cm/s＝低；(Papp A→B)>1.0X10-6cm/s＝高；b显著外流：外流>3.0且(Papp B→A)>1.0X10-6cm/s。
图14：显示2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的外消旋物和R对映体在MDR1-MDCK细胞中的通透性的表格。分类：A-B Papp>3.0且外流比率<3.0：高。A-B Papp>3.0且10>外流比率>3.0：中等。A-B Papp>3.0且外流比率>10：低。A-B Papp<3.0：低。
图15：显示2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的外消旋物和R对映体在人肝脏微粒体中的稳定性的表格。
图16：显示2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的外消旋物和R对映体/Labrasol制剂在C57BL/6N:Crl小鼠中的给药计划的表格。a给药施用9天(第一次18只雌性动物/组)或12天(第二次18只雌性动物/组)；b作为可能的替换而被包括。
图17：2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼外消旋物的非微粒化和微粒化样品的显微照片。注意50微米的参考刻度。
图18：显示在药物施用9天后和日剂量之后数小时后以4种剂量水平(3、10、30和50mg/kg/天)施用于Labrasol中的2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的外消旋物和R对映体的血清水平的表格。
图19：显示在药物施用12天后和日剂量之后数小时后以4种剂量水平(3、10、30和50mg/kg/天)施用于Labrasol中的2-乙基-3-甲氧基-苯 甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的外消旋物和R对映体的血清水平的表格。
图20：pCMV/GEVY(DEF)质粒的图示。质粒pCMV/GEVY(DEF)由来自云杉色卷蛾的EcR的D、E和F结构域所组成，其载有被融合到酵母GAL4-DBD(aa 1-147)下游并受到CMV启动子和pBIND载体(Promega Corporation，Madison，WI，USA)下游的SV40多腺苷酸化信号控制的突变V390I/Y410E/E274V。使用基于5’和3’末端的20-25nt序列而设计的引物将所示的EcR的DEF结构域扩增。将限制性内切酶位点BamH I和Xba I分别加到5’和3’引物。使用适当的限制性内切酶消化PCR产物并克隆进pBIND载体。
图21：pCMV/VP16-Hs-LmRXR载体的图示。pCMV/VP16-Hs-LmRXR载体含有来自人类RXRβ(E结构域的螺旋1-8)和飞蝗(Locusta migratoria)RXR(E结构域的螺旋9-12)的嵌合RXR，其被融合到VP16激活结构域的下游并被置于pBIND载体中CMV启动子的控制之下。
图22：p6xGAL4RE-TTR-SEAP报道载体的图示。可诱导的SEAP报道载体p6xGAL4RE-TTR-SEAP含有人类分泌的碱性磷酸酶报道基因，其被置于可诱导的启动子的控制之下，所述启动子由在运甲状腺素蛋白(TTR)启动子上游的6拷贝的Gal4应答元件所组成。
图23：Ad-RTS-hIL-12的图示，其中E1和E3区域缺失而且RTS-IL12成分代替E1区域。
图24：显示在注射了由Ad.RheoSP1-mIL12质粒感染的B16细胞并以0、3、10、30、50mg/kg/天的剂量施用了二酰基肼的R对映体或外消旋物之后，mIL12p70在肿瘤和血清中表达的图。对照：只接受3天50mg/kg/天的剂量的配体的未被转导的载有B16的小鼠(配体50)和未被处理的(无配体)载有肿瘤的小鼠(肿瘤对照)。“L3d后中断3d”：使用配体处理3天然后在接下来另外3天中不提供配体的小鼠。
图25：显示在注射了由Ad.RheoSP1-mIL12质粒感染的B16细胞并以0、3、10、30、50mg/kg/天的剂量施用了二酰基肼的R对映体或外消旋物 之后，mIFN-γ在肿瘤和血清中表达的图。对照：只接受3天50mg/kg/天的配体的未被转导的载有B16的小鼠(配体50)和未被处理的(无配体)载有肿瘤的小鼠(肿瘤对照)。“L3d后中断3d”：使用配体处理3天然后在接下来另外3天中不提供配体的小鼠。
发明详述
本发明涉及式I的化合物或者其药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或无定形形式
其中
A是烷氧基、芳烷氧基或芳氧基；
B是可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；并且
R1和R2独立是可选地取代的烷基、芳烷基、羟烷基、卤代烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的杂环、可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基。
在另一个实施方案中，本发明涉及对映体富集的式II的化合物或者其药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或无定形形式
其中
A是烷氧基、芳烷氧基、芳氧基、芳烷基、可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；
B是可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；并且
R1和R2独立是可选地取代的烷基、芳烷基、羟烷基、卤代烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的杂环、可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；
条件是R1不等同于R2；
其中在含有R1和R2的不对称碳原子处的绝对构型主要为S。
在另一个实施方案中，本发明涉及对映体富集的式III的化合物或者其药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或无定形形式
其中
A是烷氧基、芳烷氧基、芳氧基、芳烷基、可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；
B是可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；并且
R1和R2独立是可选地取代的烷基、芳烷基、羟烷基、卤代烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的杂环、可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；
条件是R1不等同于R2；
其中在含有R1和R2的不对称碳原子处的绝对构型主要为R。
在另一个实施方案中，本发明涉及对映体富集的式II或III的化合物或者其药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或无定形形式，其中
A是-OC(CH3)3、-OCH2Ph、可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；
B是可选地取代的芳基；
R1是可选地取代的(C1-C6)烷基、羟基(C1-C4)烷基或可选地取代的(C2-C6)烯基；并且
R2是可选地取代的(C1-C6)烷基、芳基(C1-C4)烷基、可选地取代的(C3-C7)环烷基或可选地取代的芳基；
条件是R1不等同于R2；
其中
在含有R1和R2的不对称碳原子处的绝对构型在式II中主要为S；并且
在含有R1和R2的不对称碳原子处的绝对构型在式III中主要为R。
在另一个实施方案中，本发明涉及对映体富集的式II或III的化合物或者其药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或无定形形式，其中
A是可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；
B是可选地取代的芳基；
R1是可选地取代的(C1-C6)烷基、羟基(C1-C4)烷基或可选地取代的(C2-C6)烯基；并且
R2是可选地取代的(C1-C6)烷基、芳基(C1-C4)烷基、可选地取代的(C3-C7)环烷基或可选地取代的芳基；
条件是R1不等同于R2；
其中
在含有R1和R2的不对称碳原子处的绝对构型在式II中主要为S；并且
在含有R1和R2的不对称碳原子处的绝对构型在式III中主要为R。
在另一个实施方案中，本发明涉及对映体富集的式II或III的化合物或者其药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或无定形形式，其中
A是
R3a、R3b、R3c、R3d和R3e独立选自氢、卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、可选地取代的烷基、卤代烷基、羟烷基、芳烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的芳基、可选地取代的杂芳基、可选地取代的杂环、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、羧酰氨基、亚磺酰氨基、-CORc、-SO2Rd、-N(Re)CORf、-N(Re)SO2Rg或-N(Re)C＝N(Rh)-氨基；或者
R3a和R3b与它们所连接的碳原子一起形成五、六或七元的融合环烷基或杂环的环；或者
R3b和R3c与它们所连接的碳原子一起形成五、六或七元的融合环烷基或杂环的环；
R4a、R4b、R4c、R5a、R5b、R6a、R6b和R6c独立选自氢、卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、可选地取代的烷基、卤代烷基、羟烷基、芳烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的芳基、可选地取代的杂芳基、可选地取代的杂环、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、羧酰氨基、亚磺酰氨基、-CORc、-SO2Rd、-N(Re)CORf、-N(Re)SO2Rg或-N(Re)C＝N(Rh)-氨基；
X是O或S；
B是
并且；
R3f、R3g、R3h、R3i和R3j独立选自氢、卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、可选地取代的烷基、卤代烷基、羟烷基、芳烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的芳基、可选地取代的杂芳基、可选地取代的杂环、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、羧酰氨基、亚磺酰氨基、-CORc、-SO2Rd、-N(Re)CORf、-N(Re)SO2Rg或-N(Re)C＝N(Rh)-氨基；或者
R3f和R3g与它们所连接的碳原子一起形成五、六或七元的融合环烷基或杂环的环；或者
R3g和R3h与它们所连接的碳原子一起形成五、六或七元的融合环烷基或杂环的环；
其中
Rc是氢、羟基、卤代烷基、羟烷基、芳烷基、可选地取代的烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的杂环、可选地取代的芳基、可选地取代的杂芳基、烷氧基、芳氧基或芳烷氧基；
Rd是卤代烷基、羟烷基、芳烷基、可选地取代的烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的杂环、可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；
Re是氢、卤代烷基、羟烷基、芳烷基、可选地取代的烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的杂环、可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；
Rf是氢、卤代烷基、羟烷基、芳烷基、可选地取代的烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的杂环、 可选地取代的芳基、可选地取代的杂芳基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基或氨基；
Rg是卤代烷基、羟烷基、芳烷基、可选地取代的烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的杂环、可选地取代的芳基、可选地取代的杂芳基或氨基；
Rh是氢、烷基、芳基、氰基或硝基；
R1是可选地取代的(C1-C6)烷基、羟基(C1-C4)烷基或可选地取代的(C2-C6)烯基；并且
R2是可选地取代的(C1-C6)烷基、芳基(C1-C4)烷基、可选地取代的(C3-C7)环烷基或可选地取代的芳基；
条件是R1不等同于R2；
其中
在含有R1和R2的不对称碳原子处的绝对构型在式II中主要为S；并且
在含有R1和R2的不对称碳原子处的绝对构型在式III中主要为R。
在另一个实施方案中，本发明涉及对映体富集的式II的化合物或者其药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或无定形形式，其中
A、B、R3a、R3b、R3c、R3d、R3e、R3f、R3g、R3h、R3i、R3j、R4a、R4b、R4c、R5a、R5b、R6a、R6b、R6c和X具有与上述相同的含义；
R1是(C1-C6)烷基、羟基(C1-C4)烷基或(C2-C4)烯基；并且
R2是可选地取代的(C3-C7)环烷基；
其中在含有R1和R2的不对称碳原子处的绝对构型主要为S。
在另一个实施方案中，本发明涉及对映体富集的式III的化合物或者其药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或无定形形式，其中
A、B、R3a、R3b、R3c、R3d、R3e、R3f、R3g、R3h、R3i、R3j、R4a、R4b、R4c、R5a、R5b、R6a、R6b、R6c和X具有与上述相同的含义；
R1是(C1-C6)烷基、羟基(C1-C4)烷基或(C2-C4)烯基；并且
R2是可选地取代的(C1-C6)烷基；
条件是R1不等同于R2；
其中在含有R1和R2的不对称碳原子处的绝对构型主要为R。
在一个实施方案中，本发明涉及对映体富集的式II的化合物或者其药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或无定形形式，其中
A是
B是
R3a、R3b、R3c、R3d、R3e、R3f、R3g、R3h、R3i和R3j独立选自氢、卤素、(C1-C4)烷基或(C1-C4)烷氧基；
R1是(C1-C6)烷基、羟基(C1-C4)烷基或(C2-C4)烯基；并且
R2是可选地取代的(C3-C7)环烷基；
其中在含有R1和R2的不对称碳原子处的绝对构型主要为S。
在另一个实施方案中，本发明涉及对映体富集的式III的化合物或者其药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或无定形形式，其中
A是
B是
R3a、R3b、R3c、R3d、R3e、R3f、R3g、R3h、R3i和R3j独立选自氢、卤素、(C1-C4)烷基或(C1-C4)烷氧基；
R1是(C1-C6)烷基、羟基(C1-C4)烷基或(C2-C4)烯基；并且
R2是可选地取代的(C1-C6)烷基；
其中在含有R1和R2的不对称碳原子处的绝对构型主要为R。
在另一个实施方案中，本发明涉及对映体富集的式II的化合物，其具有S异构体的至少50％、75％、85％、95％或>99％的对映体过量。在一个实施方案中，式II的化合物基本上由S异构体组成。
在另一个实施方案中，本发明涉及对映体富集的式III的化合物，其具有R异构体的至少50％、75％、85％、95％或>99％的对映体过量。在一个实施方案中，式III的化合物基本上由R异构体组成。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其包括式I、II或III的化合物。
在一个实施方案中，本发明涉及(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼，其具有至少95％或至少99％的对映体过量，或其药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或无定形形式。在一个实施方案中，所述化合物是对映体纯的。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其包括(R)-3,5- 二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼，其具有至少95％或至少99％的对映体过量，或其药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或无定形形式。在一个实施方案中，所述化合物是对映体纯的。
意外地发现，对映体纯的(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼具有组合在一起的有益特性，其使之独特地适合体内药物用途。这种特性包括与外消旋物相比更低的熔点和较低的熔化热(实施例68)；在许多液体药物赋形剂中与外消旋物相比更好的溶解度(实施例68)；在特定细胞中与外消旋物相比更好的通透性(实施例69)；与外消旋物相比更可能跨越血脑屏障(实施例69)；与外消旋物相比具有更稳定的肝细胞代谢(实施例70)；当作为Labrasol溶液或悬浮液口服施用时获得与外消旋物相比显著更高的血浆水平(实施例71)；并且通过激活基于EcR的基因开关而获得与外消旋物相比更高的体内基因表达(实施例72)。
本发明还涉及式IV的化合物的制备过程
其中
A是芳烷基、可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；
B是可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；
R2是可选地取代的烷基、芳烷基、羟烷基、卤代烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的杂环、可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；
条件是R2不等同于-CR8R9CHR10CR11R12；并且
R8、R9、R10、R11和R12独立选自氢、烷基、环烷基、杂环、芳基或杂芳基；
其中R2所连接的不对称碳原子以R或S异构体的形式对映体富集；
所述过程包括：
a)将式V的化合物
与式VI的化合物进行反应
R2HC＝N-NH-CO2R7 式VI
其中
X和Y独立为O或NR，其中R是烷基或芳基；
Ca和Cb独立为S构型的不对称碳原子或R构型的不对称碳原子；
R14和R15独立为烷基或芳基；
R13是卤素、氢、烷基、烷氧基或OSO2CF3；
R7是烷基、芳烷基或芳基；并且
R2、R8、R9、R10、R11和R12具有上述相同的含义；
以形成式VII的化合物；
b)将式VII的化合物还原以形成式VIII的化合物；
c)将式VIII的化合物与式B-CO-LG的化合物进行反应以形成式IX的化合物，其中LG是离去基团；
d)将式IX的化合物的R7CO2-基团移除以形成式X的化合物；并且
e)将式X的化合物与式A-CO-LG的化合物进行反应以形成式IV的化合物，其中LG是离去基团。
在另一个实施方案中，本发明涉及制备式IV的化合物的过程，其中R8、R9、R10、R11和R12是氢。
在另一个实施方案中，本发明涉及制备式IV的化合物的过程，其中
R8、R9、R10、R11和R12是氢；
X是NR并且R是甲基；
Y是O；
R14是甲基；
R15是苯基；并且
Ca和Cb中每个都是R构型的。
在另一个实施方案中，本发明涉及制备式IV的化合物的过程，其中
R8、R9、R10、R11和R12是氢；
X是NR并且R是甲基；
Y是O；
R14是甲基；
R15是苯基；并且
Ca和Cb中每个都是S构型的。
在另一个实施方案中，本发明涉及制备式IV的化合物的过程，其中
R8、R9、R10、R11和R12是氢；
X是NR并且R是甲基；
Y是O；
R14是甲基；
R15是苯基；
Ca和Cb中每个都是S构型的；并且
B是3,5-二甲苯基。
在另一个实施方案中，本发明涉及制备式IV的化合物的过程，其中
R8、R9、R10、R11和R12是氢；
X是NR并且R是甲基；
Y是O；
R14是甲基；
R15是苯基；
Ca和Cb中每个都是S构型的；并且
A是2-乙基-3-甲氧苯基。
在另一个实施方案中，本发明涉及制备式IV的化合物的过程，其中
R8、R9、R10、R11和R12是氢；
X是NR并且R是甲基；
Y是O；
R14是甲基；
R15是苯基；
Ca和Cb中每个都是S构型的；并且
R2是叔-丁基。
本发明还涉及制备式II或III的化合物的过程，其包括：
a)将式XI的酰基肼
与式XII的酮进行反应
以形成式XIII的化合物；
其中R1不等同于R2；
b)将式XIII的化合物在手性催化剂的存在下还原以形成式S-XIV或R-XIV的化合物；并且
c)将式S-XIV或R-XIV的化合物与式B-CO-LG的化合物进行反应以形成式II或III的化合物，其中LG是离去基团。
本发明的式I的二酰基肼包括但不限于：
外消旋-N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-肼羧酸苄酯；或外消旋-N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-肼羧酸叔丁酯。
本发明的式II或III的手性二酰基肼包括但不限于：
(S)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-环己基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼；
(S)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-环己基-丁基)-N'-(3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼；
(S)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-环己基-丁基)-N'-(4-甲基-苯甲酰)-酰肼.
(R)-N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-肼羧酸苄酯；
(R)-N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-肼羧酸叔-丁酯；
(R)-N'-(1-叔-丁基-4-羟基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-肼羧酸苄酯；
(R)-N'-(1-叔-丁基-4-羟基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-肼羧酸苄酯；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N'-苯甲酰-N-(1-叔-丁基-丁基)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2-甲基-苯甲酰)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2-甲氧基-苯甲酰)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2-氟代-苯甲酰)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2-氯代-苯甲酰)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N'-(2-溴代-苯甲酰)-N-(1-叔-丁基-丁基)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3-甲基-苯甲酰)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3-氯代-苯甲酰)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(4-甲基-苯甲酰)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(4-乙基-苯甲酰)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(4-甲氧基-苯甲酰)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(4-氯代-苯甲酰)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2,6-二氟-苯甲酰)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2,6-二氟-苯甲酰)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,4-二甲氧基-苯甲酰)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二氟-苯甲酰)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(4-甲基-苯并[1,3]间二氧杂环戊烯-5-羰基)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(5-甲基-2,3-二氢-苯并[1,4]二氧杂环己烯-6-羰基)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(5-乙基-2,3-二氢-苯并[1,4]二氧杂环己烯-6-羰基)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(萘-1-羰基)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(萘-2-羰基)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(噻吩-2-羰基)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2,5-二甲基-呋喃-3-羰基)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2-氯代-吡啶-3-羰基)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(6-氯代-吡啶-3-羰基)-酰肼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰)-酰肼；
(R)-3,5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰)-酰肼；和
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N'-(4-乙基-苯甲酰)-N-(1-苯乙基-丁-3-烯基)-酰肼。
式II或III的手性二酰基肼可在分子的其他部分含有手性中心(即，不在含有R1和R2的非对称碳原子处)。所有可能的对映体、非对映体和立体异构体旨在被包括在本发明的范围内。
本发明还涉及调节宿主细胞中基因表达的方法，其使用带有式I的二酰基肼配体或者式II或III的手性二酰基肼配体的基因表达调节系统。
在一个实施方案中，本发明涉及式I的二酰基肼配体或者式II或III的手性二酰基肼配体在可诱导的基因表达系统中的用途，所述可诱导的基因表达系统在不存在配体的情况下具有水平降低的背景基因表达并对亚微摩尔浓度的配体进行应答。
在另一个实施方案中，本发明涉及调节宿主细胞中靶基因表达的方法，其中所述宿主细胞包括第一基因表达盒，其包括编码第一多肽的第一多核苷酸，其包括：
i)反式激活结构域；
ii)DNA结合结构域；和
iii)组H核受体配体结合结构域；
以及第二基因表达盒，其包括：
i)能够结合至所述DNA结合结构域的应答元件；
ii)由反式激活结构域所激活的启动子；和
iii)所述靶基因；
所述方法包括将所述宿主细胞与式I的二酰基肼配体或者式II或III的手性二酰基肼配体相接触；其中靶基因的表达受到调节。
在另一个实施方案中，本发明涉及调节宿主细胞中感兴趣的基因的表达的方法，其中所述宿主细胞包括第一重组基因表达盒，其包括编码第一多肽的第一多核苷酸，其包括：
i)DNA结合结构域；和
ii)组H核受体配体结合结构域；
以及第二重组基因表达盒，其包括：
i)能够结合至所述DNA结合结构域的应答元件；
ii)启动子；和
iii)所述感兴趣的基因；
所述方法包括将所述宿主细胞与式I的二酰基肼配体或者式II或III的手性二酰基肼配体相接触；其中感兴趣的基因的表达受到调节。
在另一个实施方案中，本发明涉及调控转基因受试者中内源性或异源性基因的表达的方法，其包括将配体与所述受试者的细胞中的蜕皮素受体复合物相接触，其中所述细胞在与配体结合时还包含蜕皮素受体复合物的DNA结合序列，而且其中蜕皮素受体复合物-配体-DNA结合序列复合物的形成诱导基因表达，而且其中所述配体是式I的二酰基肼配体或者式II或III的手性二酰基肼配体，其中转基因受试者的内源性或异源性基因表达受到调控。
在一个实施方案中，所述细胞是自体细胞，即所述细胞是得自所述受试者并被蜕皮素受体复合物和DNA结合序列转染。被转染的自体细胞然后被植入回所述受试者，而所述受试者然后被所述配体处理。可以通过若干方式中的任一种将所述自体细胞植入，其包括输注或注射即直接注射。在一个实施方案中，通过肿瘤内注射将所述自体细胞植入。
在另一个实施方案中，本发明涉及调控转基因受试者中内源性或异源性基因的表达的方法，其包括将配体与所述受试者的细胞中的嵌合的蜕皮素受体复合物相接触，其中所述细胞在与配体结合时还包含蜕皮素受体复合物的DNA结合序列，所述DNA结合序列还包括启动子，而且其中蜕皮素受体复合物-配体-DNA结合序列复合物的形成诱导基因表达，而且其中所述配体是式I的二酰基肼配体或者式II或III的手性二酰基肼配体，其中转基因受试者的内源性或异源性基因表达受到调控。
在另一个实施方案中，转基因受试者是植物、昆虫、动物或哺乳动物即人或兽医动物例如奶牛、猪、绵羊、山羊、马、狗或猫。
在一个实施方案中，所述细胞是自体细胞。优选地，所述自体细胞可含有所述蜕皮素受体复合物和所述蜕皮素复合物的DNA结合序列，并且所述细胞被植入所述受试者以使其成为转基因的。优选地，所述植入可以是通过注射。优选地，所述注射可以是进入肿瘤。
在一个实施方案中，所述配体可作为药物组合物的一部分被施用于所述转基因受试者，所述药物组合物可包括药学上可接受的载体。优选地，所述药物组合物可被口服施用。优选地，所述药学上可接受的载体可包括亲脂的溶剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及调控转基因受试者中转基因表达的方法，其中所述转基因受试者包括能够调节转基因表达的重组蜕皮素受体复合物；所述方法包括向所述受试者施用有效量的式I的二酰基肼配体或者式II或III的手性二酰基肼配体。
在另一个实施方案中，本发明涉及调节宿主细胞中靶基因表达的方法，其包括步骤：
a)将基因表达调节系统引入宿主细胞，所述基因表达调节系统包括：
i)第一基因表达盒，其能够被表达在宿主细胞中，所述第一基因表达盒包括编码第一杂交多肽的多核苷酸序列，其包括：
(a)识别与其表达将受到调节的基因缔合的应答元件的DNA结合结构域；和
(b)蜕皮素受体配体结合结构域；
ii)第二基因表达盒，其能够被表达在宿主细胞中，所述第二基因表达盒包括编码第二杂交多肽的多核苷酸序列，其包括：
(a)反式激活结构域；和
(b)嵌合的类视黄醇X受体的配体结合结构域；以及
iii)第三基因表达盒，其能够被表达在宿主细胞中，所述第三基因表达盒包括多核苷酸序列，其包括：
(a)被第一杂交多肽的DNA结合结构域所识别的应答元件；
(b)被第二杂交多肽的反式激活结构域所激活的启动子；和
(c)其表达将受到调节的基因；以及
b)将式I的二酰基肼配体或者式II或III的手性二酰基肼配体引入宿主细胞；其中宿主细胞的基因表达受到调节。
在另一个实施方案中，本发明涉及产生多肽的方法，其包括步骤：
a)选择一种宿主细胞，其对暴露于式I的二酰基肼配体或者式II或III的手性二酰基肼配体基本上不敏感；
b)将下述引入宿主细胞：
i)DNA构建体，其包括：
(a)编码所述多肽的外源性基因；和
(b)应答元件；
其中所述基因是在所述应答元件的控制下；和
ii)蜕皮素受体复合物，其包括：
(a)结合至应答元件的DNA结合结构域；
(b)所述化合物的结合结构域；和
(c)反式激活结构域；和
c)将所述细胞暴露于所述化合物，其中多肽被产生。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其中所述蜕皮素受体复合物或蜕皮素受体配体结合结构域包括突变。
在本发明的方法中，所述蜕皮素受体复合物或蜕皮素受体配体结合结构域可包括突变。
本文所用缩写具有它们在化学和生物领域内常用的含义，除非另外指明。例如：“h”是指小时，“min”是指分钟，“sec”是指秒，“d”是指天，“μL”是指微升，“mL”是指毫升，“L”是指升，“μM”是指微摩尔的，“mM”是指毫摩尔的，“M”是指摩尔的，“mol”是指摩尔，“mmol”是指毫摩尔，“μg”是指微克，“mg”是指毫克，“A”是指腺嘌呤或腺嘌呤 核苷，“T”是指胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷，“G”是指鸟嘌呤或鸟嘌呤核苷，“C”指胞嘧啶核苷或胞嘧啶，“xg”是指倍重力，“nt”是指核苷酸，“aa”是指氨基酸，“bp”是指碱基对，“kb”是指千碱基，“k”是指千，“μ”是指微，“℃”是指摄氏度，“THF”是指四氢呋喃，“DME”是指二甲氧基乙烷，“DMF”是指二甲基甲酰胺，“NMR”是指核磁共振，“psi”是指磅每平方英寸，并且“TLC”是指薄层色谱法。
本文所用术语“烷基”单独地或作为另一个基团的一部分是指直链或支链饱和脂肪族烃，其具有一至十个碳或所标明的碳数(C1-C10是指1至10个碳)。示例性的烷基包括甲基、乙基、n-丙基、异丙基、n-丁基、仲-丁基、异丁基、叔-丁基、n-戊基、n-己基、异己基、n-庚基、4,4-二甲基戊基、n-辛基、2,2,4-三甲基戊基、壬基、癸基以及类似物。
本文所用术语“可选地取代的烷基”单独地或作为另一个基团的一部分是指上述所定义的烷基，其被一种至三种取代基可选地取代，其中所述取代基独立地选自硝基、氰基、氨基、可选地取代的环烷基、可选地取代的杂芳基、可选地取代的杂环、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、羧酰氨基、亚磺酰氨基、-CORc、-SO2Rd、-N(Re)CORf、-N(Re)SO2Rg或-N(Re)C＝N(Rh)-氨基。示例性的被取代的烷基包括-CH2OCH3、-CH2CH2NH2、-CH2CH2CN、-CH2SO2CH3以及类似物。
本文所用术语“卤代烷基”单独地或作为另一个基团的一部分是指上述所定义的烷基，其具有一种至六种卤素取代基。示例性的卤代烷基包括三氟甲基、-CH2CH2F以及类似物。
本文所用术语“羟烷基”单独地或作为另一个基团的一部分是指上述所定义的烷基，其具有一种至三种羟基取代基，通常为一种羟基取代基。示例性的羟烷基包括羟甲基、羟乙基、羟丙基以及类似物。
本文所用术语“芳烷基”单独地或作为另一个基团的一部分是指上述所定义的烷基，其具有一种至三种芳基取代基(所述芳基取代基可如下述被可选地取代)，通常具有一种或两种芳基取代基。示例性的芳烷基包括，例如，苯甲基、苯乙基、4-氟苯乙基、苯丙基、二苯甲基以及类似物。
本文所用术语“环烷基”单独地或作为另一个基团的一部分是指饱和的和部分地不饱和的(含有一个或两个双键)环状烃基团，其含有具有3至12个或所指明的碳数的碳原子的一至三个环。示例性的环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、降冰片基、十氢化萘、金刚烷基以及类似物。
本文所用术语“可选地取代的环烷基”单独地或作为另一个基团的一部分是指上述所定义的环烷基，其被一种至三种取代基可选地取代，其中所述取代基独立地选自卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、可选地取代的烷基、卤代烷基、羟烷基、芳烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的芳基、可选地取代的杂芳基、可选地取代的杂环、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、羧酰氨基、亚磺酰氨基、-CORc、-SO2Rd、-N(Re)CORf、-N(Re)SO2Rg或-N(Re)C＝N(Rh)-氨基。示例性的可选地取代的环烷基包括
以及类似物。可选地取代的环烷基可被融合至芳基以提供下述可选地取代的芳基。
本文所用术语“烯基”单独地或作为另一个基团的一部分是指上述所定义的烷基，其含有一至三个碳碳双键，通常含有一或两个双键。示例性的烯基包括-CH＝CH2、-CH2CH＝CH2、-CH2CH2CH＝CH2、-CH2CH2CH＝CHCH3以及类似物。
本文所用术语“可选地取代的烯基”单独地或作为另一个基团的一部分是指上述所定义的烯基，其被一种至三种取代基可选地取代，其中所述取代基独立地选自卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、可选地取代的烷基、卤代烷基、羟烷基、芳烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的芳基、可选地取代的杂芳基、可选地取代的杂环、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、羧酰氨基、亚磺酰氨基、-CORc、-SO2Rd、-N(Re)CORf、-N(Re)SO2Rg或-N(Re)C＝N(Rh)-氨基。示例 性的可选地取代的烯基包括-CH＝CHPh、-CH2CH＝CHPh以及类似物。
本文所用术语“炔基”单独地或作为另一个基团的一部分是指上述所定义的烷基，其含有一至三个碳碳三键，通常含有一个或两个三键。示例性的炔基包括-C≡CH、-C≡CCH3、-CH2C≡CH、-CH2CH2C≡CH和-CH2CH2C≡CCH3。
本文所用术语“可选地取代的炔基”单独地或作为另一个基团的一部分是指上述所定义的炔基，其被一种至三种取代基可选地取代，其中所述取代基独立地选自卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、可选地取代的烷基、卤代烷基、羟烷基、芳烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的芳基、可选地取代的杂芳基、可选地取代的杂环、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、羧酰氨基、亚磺酰氨基、-CORc、-SO2Rd、-N(Re)CORf、-N(Re)SO2Rg或-N(Re)C＝N(Rh)-氨基。示例性的可选地取代的炔基包括-C≡CPh、-CH2C≡CPh以及类似物。
本文所用术语“芳基”单独地或作为另一个基团的一部分是指具有6至12个碳原子的单环和双环芳香环系统，例如苯基(缩写为Ph)、1-萘基和2-萘基。
本文所用术语“可选地取代的芳基”单独地或作为另一个基团的一部分是指上述所定义的芳基，其被一种至五种取代基、通常一种至三种取代基可选地取代，其中所述取代基独立地选自卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、可选地取代的烷基、卤代烷基、羟烷基、芳烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的芳基、可选地取代的杂芳基、可选地取代的杂环、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、羧酰氨基、亚磺酰氨基、-CORc、-SO2Rd、-N(Re)CORf、-N(Re)SO2Rg或-N(Re)C＝N(Rh)-氨基。示例性的可选地取代的芳基包括2-甲苯基、2-甲氧苯基、2-氟苯基、2-氯苯基、2-溴苯基、3-甲苯基、3-甲氧苯基、3-氯苯基、4-甲苯基、4-乙苯基、4-甲氧苯基、4-氯苯基、2,6-二氟苯基、2,6-二氯苯基、2-甲基、3-甲氧苯基、2-乙基、3-甲氧苯基、3,4-二甲氧苯基、3,5-二氟苯基、3,5-二甲苯基和3,5-二甲氧基、4-甲苯基以及类似物。术语可选地取代的芳基旨在包括具有融合的可选地取代的环烷基和融合的可选地取 代的杂环的环的基团。例子包括
以及类似物。
本文所用术语“杂芳基”单独地或作为另一个基团的一部分是指具有5至14个碳原子和1、2、3或4个杂原子的单环和双环芳香环系统，其中所述杂原子独立地选自氧、氮和硫。示例性的杂芳基包括1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、4-苯并咪唑基、5-苯并咪唑基、2-苯并噻唑基、4-苯并噻唑基、5-苯并噻唑基、5-吲哚基、5-吲哚基、3-吲唑基、4-吲唑基、5-吲唑基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、2-喹啉基、3-喹啉基、6-喹啉基以及类似物。术语杂芳基旨在包括可能的N-氧化物。示例性的N-氧化物包括吡啶基N-氧化物以及类似物。
本文所用术语“可选地取代的杂芳基”单独地或作为另一个基团的一部分是指上述所定义的杂芳基，其被一种至四种取代基、通常一种或两种取代基在任何可能的碳原子处可选地取代，其中所述取代基独立地选自卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、可选地取代的烷基、卤代烷基、羟烷基、芳烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的芳基、可选地取代的杂芳基、可选地取代的杂环、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、羧酰氨基、亚磺酰氨基、-CORc、-SO2Rd、-N(Re)CORf、-N(Re)SO2Rg或-N(Re)C＝N(Rh)-氨基。示例性的可选地取代的杂芳基包括
以及类似物。
前面所鉴定的手性二酰基肼配体中末端部分A和B的可选地取代的芳基和可选地取代的杂芳基的特殊化学性质并不是狭隘地关键性的，并且如所述，考虑了各种取代基。优选地，选择可选地取代的芳基和可选地取代的杂芳基的取代基以使得碳原子和杂原子的总数不多于大约20，更优选地不多于大约15。
本文所用术语“杂环”单独地或作为另一个基团的一部分是指饱和的和部分地不饱和的(含有一个或两个双键)环状基团，其含有具有2至12个碳原子和1或2个氧、硫或氮原子的一至三个环。所述杂环可通过碳原子或氮原子可选地连接至分子的其余部分。示例性的杂环基团包括
以及类似物。
本文所用术语“可选地取代的杂环”单独地或作为另一个基团的一部分是指上述所定义的杂环，其被一种至四种取代基、通常一种或两种取代基可选地取代，其中所述取代基独立地选自卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、可选地取代的烷基、卤代烷基、羟烷基、芳烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的芳基、可选地取代的杂芳基、可选地取代的杂环、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、羧酰氨基、亚磺酰氨基、-CORc、-SO2Rd、-N(Re)CORf、-N(Re)SO2Rg或-N(Re)C＝N(Rh)-氨基。示例性的可选地取代的杂环基团包括
以及类似物。可选地取代的杂环可被融合至芳基以提供上述可选地取代的芳基。
本文所用术语“烷氧基”单独地或作为另一个基团的一部分是指连接到末端氧原子的羟烷基、卤代烷基、芳烷基、可选地取代的烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基或可选地取代的炔基。示例性的烷氧基包括甲氧基、叔-丁氧基、-OCH2CH＝CH2以及类似物。
本文所用术语“芳氧基”单独地或作为另一个基团的一部分是指连接到末端氧原子的可选地取代的芳基。示例性的芳氧基包括苯氧基以及类似物。
本文所用术语“芳烷氧基”单独地或作为另一个基团的一部分是指连接到末端氧原子的芳烷基。示例性的芳烷氧基包括苯甲氧基以及类似物。
本文所用术语“烷硫基”单独地或作为另一个基团的一部分是指连接到末端硫原子的羟烷基、卤代烷基、芳烷基、可选地取代的烷基、可选地取代的烯基或可选地取代的炔基。示例性的烷硫基包括-SCH3以及类似物。
本文所用术语“卤代(halo)”或“卤素(halogen)”单独地或作为另一个基团的一部分是指氟、氯、溴或碘。
本文所用术语“氨基”单独地或作为另一个基团的一部分是指式-NRaRb的基团，其中Ra和Rb独立为氢、卤代烷基、羟烷基、芳烷基、可选地取代的烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的杂环、可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；或者Ra和Rb与他们所连接的氮原子一起形成四至七元杂环。示例性的氨基包括-NH2、-N(H)CH3、-N(CH3)2、 -N(H)CH2Ph以及类似物。
本文所用术语“羧酰氨基”单独地或作为另一个基团的一部分是指式-CO-氨基的基团。示例性的羧酰氨基包括-CONH2、-CON(H)CH3、-CON(H)Ph以及类似物。
本文所用术语“亚磺酰氨基”单独地或作为另一个基团的一部分是指式-SO2-氨基的基团。示例性的亚磺酰氨基包括-SO2NH2、-SO2N(H)CH3、-SO2N(H)Ph以及类似物。
根据上述可选地取代的基团，Rc是氢、羟基、卤代烷基、羟烷基、芳烷基、可选地取代的烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的杂环、可选地取代的芳基、可选地取代的杂芳基、烷氧基、芳氧基或芳烷氧基；Rd是卤代烷基、羟烷基、芳烷基、可选地取代的烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的杂环、可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；Re是氢、卤代烷基、羟烷基、芳烷基、可选地取代的烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的杂环、可选地取代的芳基或可选地取代的杂芳基；Rf是氢、卤代烷基、羟烷基、芳烷基、可选地取代的烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的杂环、可选地取代的芳基、可选地取代的杂芳基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基或氨基；Rg是卤代烷基、羟烷基、芳烷基、可选地取代的烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、可选地取代的炔基、可选地取代的杂环、可选地取代的芳基、可选地取代的杂芳基或氨基；并且Rh是氢、烷基、芳基、氰基或硝基。
本说明书通篇中，选择基团及其可选的取代基以提供稳定的部分和化合物。
本发明的化合物可包含在组成这种化合物的一个或多个原子上非天然比例的原子同位素。例如，所述化合物可以是用放射性同位素进行放射性标记的，所述放射性同位素例如氚(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)。不管是否具有放射性，本发明化合物的所有同位素变种旨在被本发明的范围所涵盖。
本发明的化合物可形成也在本发明范围内的盐。本文对本发明的化合物的引用被理解为包括对其盐的引用，除非另外指出。本文所用术语“盐”表示用无机和/或有机酸和碱形成的酸性的和/或碱性的盐。另外，当式I、II或III的化合物含有碱性部分和酸性部分二者时，两性离子(“内盐”)可被形成，并被包含在本文所用术语“盐”中。药学上可接受的(即，无毒的、生理上可接受的)盐是优选的，虽然其他盐在可在制备中采用的例如分离或纯化步骤中也是有用的。式I、II或III的化合物的盐可例如通过将化合物与适量的例如等当量的酸或碱在一种使盐在其中沉淀的介质或含水介质中进行反应、随后冻干而形成。
含有碱性部分的本发明的化合物可与各种有机和无机酸形成盐。示例性的酸加成盐包括醋酸盐(例如用醋酸或三卤乙酸例如三氟乙酸所形成的那些)、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡萄糖庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐(用盐酸形成)、氢溴酸盐(用溴化氢形成)、氢碘酸盐、2-羟乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐(用马来酸形成)、甲磺酸盐(用甲磺酸形成)、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐(例如用硫酸形成的那些)、磺酸盐(例如本文提到的那些)、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐(toluenesulfonate)例如甲苯磺酸盐(tosylate)、十一酸盐以及类似物。
含有酸性部分的本发明的化合物可与各种有机和无机碱形成盐。示例性的碱盐包括铵盐，碱金属盐例如钠、锂和钾盐，碱土金属盐例如钙和镁盐，含有有机碱(例如，有机胺)的盐例如苄星青霉素、二环己基胺、海巴青霉素(用N,N-双(去氢枞)乙二胺形成)、N-甲基-D-葡萄糖胺、N-甲基-D-葡萄糖酰胺、t-丁胺，和含有氨基酸例如精氨酸、赖氨酸的盐，以及类似物。
本说明书中所用的立体化学术语和惯例与Pure & Appl.Chem 68:2193 (1996)中描述的那些是一致的，除非另外指出。
术语“对映体过量”或“ee”是指一种对映体与另一种相比存在多少的量度。对于R和S对映体的混合物，百分比对映体过量被定义为│R-S│*100，其中R和S是混合物中对映体各自的摩尔或重量分数，以致于R+S＝1。在知道手性物质的旋光度的情况下，百分比对映体过量被定义为([α]obs/[α]max)*100，其中[α]obs是对映体混合物的旋光度，而[α]max是纯对映体的旋光度。使用各种分析技术来确定对映体过量是可能的，所述分析技术包括NMR光谱法、手性柱层析法或光偏振法。
术语“对映体纯的(enantiomerically pure)”或“对映纯的(enantiopure)”是指其所有分子(在检测限内)都具有相同手性意义的手性物质样品。
术语“对映体富集的(enantiomerically enriched)”或“对映富集的(enantioenriched)”是指其对映体比值超过50:50的手性物质样品。对映体富集的化合物可以是对映体纯的。
术语“不对称碳原子”是指在有机化合物分子中被连接至四个不同原子或原子基团的碳原子。
术语“主要地”是指超过50:50的比值。
术语“离去基团”或“LG”是指从被认为是特定反应中底物的残基或主要部分中的原子或基团分离的原子或基团。在酰胺偶合反应中，示例性的离去基团包括-F、-Cl、-Br、-OC6F5以及类似物。
对于本发明的目的来说，术语“分离的”是指一种被移出它的原始环境(它天然存在的环境)的物质(例如，化合物或生物物质如核酸或蛋白)。例如，植物或动物中以天然状态存在的多核苷酸不是分离的，然而从天然存在的相邻核酸所分离的相同多核苷酸被认为是“分离的”。
应用于生物物质的术语“纯化的”不要求所述物质以展现绝对纯度和不含有其他化合物的形式存在。它更确切说是个相对的定义。
“核酸”、“核酸分子”、“低聚核苷酸”和“多核苷酸”被互换地使用并且指的是核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷 酸酯多聚体形式，或其单链形式或双链螺旋的任何磷酸酯类似物，例如硫代磷酸酯和硫酯。双链的DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。术语核酸分子，特别地DNA或RNA分子，仅仅是指所述分子的一级和二级结构，并不将它限制在任何特定的三级形式。因此，该术语包含尤其在线形或环形DNA分子(例如，限制性片段)、质粒、超螺旋DNA和染色体中发现的双链DNA。在讨论特定双链DNA分子的结构时，本文根据正常的惯例来描述序列，其中所述正常的惯例只给出沿着未转录的DNA链(即具有与mRNA同源的序列的链)的5’至3’方向的序列。“重组DNA分子”是经历了分子生物学操作的DNA分子。DNA包括但不限于cDNA、基因组DNA、质粒DNA、合成的DNA和半合成的DNA。
术语“片段”是指相对于参考核酸具有缩短长度的核苷酸序列，其在公共的部分包括与参考核苷酸相同的核苷酸序列。本发明的这种核酸片段在适当的时候可作为组成部分被包括在更大的多核苷酸中。这种片段包括以下或者可选地由以下组成：长度范围为本发明核酸的至少6、8、9、10、12、15、18、20、21、22、23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、51、54、57、60、63、66、70、75、78、80、90、100、105、120、135、150、200、300、500、720、900、1000或1500个连续核苷酸的低聚核苷酸。
如本文所用，“分离的核酸片段”是指单或双链的RNA或DNA多聚体，其可选地含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA多聚体形式的分离的核酸片段可包括cDNA、基因组DNA或合成的DNA的一个或多个区段。
“基因”指的是包括编码功能分子(例如，多肽或RNA)的核苷酸的多核苷酸，并包括cDNA和基因组DNA核酸。“基因”还指表达特定的RNA、蛋白或多肽的核酸片段，其包括在所述编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调控序列。“天然基因”指的是与它自己的调控序列一起天然地被发现的基因。“嵌合的基因”是指非天然的任何基因，其包括没有一起被天然地发现的调控和/或编码序列。因此，嵌合的基因可包括衍生自不同来源的调控序列和编码序列，或衍生自相同来源但以 不同于天然发现的方式排列的调控序列和编码序列。嵌合的基因可包括衍生自不同来源的编码序列和/或衍生自不同来源的调控序列。“内源性基因”是指在生物体基因组中天然位置的天然基因。“外来”基因或“异源性”基因是指通常不在宿主生物体中被发现，但通过基因转移而被引入宿主生物体的基因。外来基因可包括被插入非天然生物体的天然基因，或者嵌合的基因。“转基因”是通过转化步骤被引入基因组的基因。
“异源性”DNA是指不天然地位于细胞内或细胞染色体位点的DNA。优选地，异源性DNA包括对于细胞是外来的基因。
术语“基因组”包括染色体以及线粒体、叶绿体和病毒DNA或RNA。
核酸分子是与另外的核酸分子例如cDNA、基因组DNA或RNA“可杂交的”，这是当单链形式的核酸分子可与其他核酸分子在适当的温度和溶液离子强度条件下进行退火时(参见下面的Sambrook等,1989)。杂交和冲洗条件是众所周知的，并在Sambrook等Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港(1989)中，具体在其中第11章和表11.1(通过引用全文并入本文)中得到示例。温度和离子强度的条件确定杂交的“严格性”。
可以调整严格性条件以筛选适度相似的片段例如来自远亲生物体的同源序列，至高度相似的片段例如复制来自近亲生物体的功能酶的基因。为了初步筛选同源核酸，可以使用对应于Tm为55°的低严格性杂交条件，例如，5×SSC、0.1％SDS、0.25％牛奶并不含甲酰胺；或者30％甲酰胺、5×SSC、0.5％SDS。中等严格性杂交条件对应于更高的Tm，例如，40％甲酰胺和5×或6×SCC。高严格性杂交条件对应于最高的Tm，例如，50％甲酰胺、5×或6×SCC。
杂交要求两种核酸含有互补序列，虽然取决于杂交的严格性，碱基之间的错配是可能的。术语“互补的”被用来描述能够互相杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，就DNA而论，腺嘌呤核苷与胸腺嘧啶互补，而且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本发明还包括与本文所公开或使用的完整序列互补的分离的核酸片段，以及那些基本上相似的核酸序列。
在本发明一个实施方案中，使用包括Tm为55℃的杂交步骤的杂交条件并使用上述条件来检测多核苷酸。在另一个实施方案中，Tm为60℃；在一个实施方案中，Tm为63℃；在另一个实施方案中，Tm为65℃。
杂交后的冲洗也确定严格性条件。一组条件使用一系列的冲洗，其从6×SSC、0.5％SDS在室温下开始进行15分钟(min)，然后用2×SSC、0.5％SDS在45℃下重复进行30分钟，并且之后用0.2×SSC、0.5％SDS在50℃下30分钟重复两次。一组严格性条件使用更高的温度，其中的冲洗与上述那些相同，除了最后两次在0.2×SSC、0.5％SDS中冲洗30min的温度被增加到60℃之外。另一组高度严格的条件在65℃下使用在0.1×SSC、0.1％SDS中的两次最后冲洗。
杂交核酸的适当的严格性取决于核酸长度和互补程度，本领域众所周知的变量。两种核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越大，具有那些序列的核酸的杂交物的Tm值越大。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的Tm)以如下顺序减少：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。关于超过100个核苷酸长度的杂交物，已经得出计算Tm的公式(参见上述Sambrook等,9.50-0.51)。关于与较短核酸即低聚核苷酸进行的杂交，错配的位置变得更重要，而且低聚核苷酸的长度确定它的特异性(参见上述Sambrook等,11.7-11.8)。
在本发明一个实施方案中，使用包括低于500mM盐和至少37摄氏度的杂交步骤和在至少63摄氏度下在2XSSPE中的冲洗步骤的杂交条件来检测多核苷酸。在一个实施方案中，所述杂交条件包括低于200mM盐和至少37摄氏度的杂交步骤。在另一个实施方案中，所述杂交条件包括2XSSPE和63摄氏度的杂交和冲洗步骤二者。
在另一个实施方案中，可杂交的核酸的长度是至少约10个核苷酸。优选地，可杂交的核酸的最小长度是至少约15个核苷酸；更优选地至少约20个核苷酸；并且最优选地所述长度是至少30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，可以根据例如探针长度等因素对温度和冲洗溶液盐浓度作必要的调整。
术语“探针”是指单链核酸分子，其可与互补的单链靶核酸进行碱基 配对以形成双链分子。
如本文所用，术语“低聚核苷酸”是指可与基因组DNA分子、cDNA分子、质粒DNA或mRNA分子杂交的短核酸。低聚核苷酸可被例如32P-核苷酸或与标记物例如生物素共价偶合的核苷酸标记。被标记的低聚核苷酸可被用作探针来检测核酸的存在。低聚核苷酸(其一条或两条都可被标记)可被用作PCR引物来克隆全长或片段的核酸，或检测核酸的存在。低聚核苷酸还可被用来与DNA分子形成三螺旋。通常地，合成地制备低聚核苷酸，优选地在核酸合成器上。因此，可以用非天然存在的磷酸酯类似物键例如硫酯键等制备低聚核苷酸。
“引物”指的是与靶核酸序列杂交以产生双链核酸区域的低聚核苷酸，其中所述双链核酸区域在适合的条件下充当DNA合成的起始点。这种引物可被用在聚合酶链式反应中。
“聚合酶链式反应”被缩写成PCR并指用来酶扩增特定核酸序列的体外方法。PCR包含一系列重复的温度循环，而每个循环包括三个阶段：将模板核酸变性以分离靶分子链，将单链PCR低聚核苷酸引物与模板核酸退火，并用DNA聚合酶延伸被退火的引物。PCR提供检测靶分子存在的方法以及在定量或半定量的条件下确定核酸起始库中靶分子相对量的方法。
“逆转录聚合酶链式反应”被缩写成RT-PCR并指这样的体外方法，其用来从RNA分子酶促产生靶cDNA分子，随后酶促扩增上述靶cDNA分子中特定的核酸序列。RT-PCR还提供检测靶分子存在的方法以及在定量或半定量的条件下确定核酸起始库中靶分子相对量的方法。
DNA“编码序列”是指编码多肽的双链DNA序列，并且当被置于适当的调控序列的控制之下时可在体外或体内被转录和翻译成细胞中的多肽。“适合的调控序列”是指位于编码序列上游(5’非编码序列)、之中或下游(3’非编码序列)的核苷酸序列，其影响转录、RNA加工或稳定性或者相关编码序列的翻译。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。编码序列的边界是由在5’(氨基)端的起始密码子和在3’(羧基)端的翻译终止密码子确定的。编码序列可包括但不限于原核序列、来自mRNA的 cDNA、基因组DNA序列以及甚至合成的DNA序列。如果编码序列是为了在真核细胞中表达，多腺苷酸化信号和转录终止序列通常将位于编码序列的3’侧。
“可读框”被缩写成ORF，并且指的是一段核酸序列即DNA、cDNA或RNA，其包括翻译起始信号或起始密码子例如ATG或AUG，以及终止密码子，并可潜在地翻译成多肽序列。
本文使用术语“头对头”来描述两条多核苷酸序列相对于彼此的方向。当一条多核苷酸编码链的5’端与另一条多核苷酸编码链的5’端临近时，两条多核苷酸被置于头对头的方向，从而每条多核苷酸转录的方向是离开另一条多核苷酸的5’端而进行的。术语“头对头”可被缩写成(5’)对(5’)，并且还可用符号(←→)或(3’←5’5’→3’)来表示。
本文使用术语“尾对尾”来描述两条多核苷酸序列相对于彼此的方向。当一条多核苷酸编码链的3’端与另一条多核苷酸编码链的3’端临近时，两条多核苷酸被置于尾对尾的方向，从而每条多核苷酸转录的方向是向着另一条多核苷酸进行的。术语“尾对尾”可被缩写成(3’)对(3’)，并且还可用符号(←→)或(5’←3’3’→5’)来表示。
本文使用术语“头对尾”来描述两条多核苷酸序列相对于彼此的方向。当一条多核苷酸编码链的5’端与另一条多核苷酸编码链的3’端临近时，两条多核苷酸被置于头对尾的方向，从而每条多核苷酸转录的方向是与另一条多核苷酸相同的方向。术语“头对尾”可被缩写成(5’)对(3’)，并且还可用符号(→→)或(5’→3’5’→3’)来表示。
术语“下游”是指位于参考核苷酸序列3’侧的核苷酸序列。特别地，下游核苷酸序列一般涉及在转录起始点之后的序列。例如，基因的翻译起始密码子位于转录起始位点的下游。
术语“上游”是指位于参考核苷酸序列5’侧的核苷酸序列。特别地，上游核苷酸序列一般涉及位于编码序列5’侧或转录起始点的序列。例如，多数启动子位于转录起始位点的上游。
术语“限制性内切酶”和“限制性酶”被可互换地使用，并且指的是 在双链DNA中特定的核苷酸序列中结合并切割的酶。
“同源重组”指的是将外来DNA序列插入另一个DNA分子，例如将载体插入染色体。优选地，载体靶向特定的染色体位点以进行同源重组。对于特定的同源重组，载体含有足够长的染色体序列同源区域以允许载体互补结合和整合入染色体。更长的同源区域和更高的序列相似度可增加同源重组的效率。
本领域已知的若干方法可被用来扩增本发明的多核苷酸。一旦建立适合的宿主系统和生长条件，就可大量地扩增和制备重组表达载体。如本文所述，可被使用的表达载体包括但不限于下述载体或它们的衍生物：人或动物病毒例如牛痘病毒或腺病毒；昆虫病毒例如杆状病毒；酵母载体；噬菌体载体(例如λ)；以及质粒和黏端质粒DNA载体，仅举几个例子。
“载体”指的是将核酸克隆和/或转移进宿主细胞的任何载体。载体可以是可连接另一个DNA区段以引起所连接的区段进行复制的复制子。“复制子”是指在体内起DNA复制自主单元作用的任何遗传元件(例如，质粒、噬菌体、黏端质粒、染色体、病毒)，其中所述DNA复制自主单元能够在它自己的控制下进行复制。术语“载体”包括在体外、离体或在体内将核酸引入细胞的病毒和非病毒载体二者。本领域已知的大量载体可被用来对核酸进行操作，将应答元件和启动子引入基因等。可能的载体包括例如质粒或修饰的病毒，其包括例如噬菌体如λ衍生物，或质粒如pBR322或pUC质粒衍生物，或Bluescript载体。例如，可以通过将适当的DNA片段连接至所选的具有互补黏性末端的载体来实现对应于应答元件和启动子的DNA片段向适合的载体中的插入。可选地，DNA分子的末端可被酶修饰或者可通过将核苷酸序列(连接序列)连接至DNA末端来产生任何位点。这种载体可被改造以含有可选的标志物基因，所述标志物基因提供细胞的选择，其中所述细胞已将标志物并入细胞基因组。这种标志物允许宿主细胞的鉴定和/或选择，所述宿主细胞并入且表达由所述标志物编码的蛋白。
病毒载体及特别地逆转录载体已被用于细胞以及活动物受试者中的多种多样的基因输送应用。可被使用的病毒载体包括但不限于逆转录病 毒、腺伴随病毒、天花、杆状病毒、牛痘、单纯性疱疹、爱泼斯坦-巴尔二氏病毒、腺病毒、双生病毒和花椰菜花叶病毒载体。非病毒载体包括质粒、脂质体、带电脂质(细胞转染剂)、DNA-蛋白复合物和生物多聚体。除了核酸之外，载体还可包括一个或多个调控区域和/或在选择、测量和监测核酸转移结果(转移至哪种组织，表达持续时间等)中有用的可选的标志物。
术语“质粒”是指染色体外元件，其通常载有不是细胞中心代谢一部分的基因，且通常以环状双链DNA分子的形式存在。这种元件可以是衍生自任何来源的单或双链DNA或RNA的线状、环状或超螺旋的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中若干核苷酸序列被连接或重组至独特的构造，所述构造能够将沿着适当的3’未翻译序列将所选基因产物的启动子片段和DNA序列引入细胞。
“克隆载体”是指“复制子”，它是顺序地进行复制的单位长度的核酸，优选地为DNA，并且包括复制起点，例如质粒、噬菌体或黏端质粒，另一条核酸片段可与其连接以引起所连接区段的复制。克隆载体可能能够在一种细胞类型中复制并在另一种中表达(“穿梭载体”)。
术语“表达载体”是指载体、质粒或媒介物，其被设计成能够在转化进宿主之后表达被插入的核酸序列。被克隆的基因即被插入的核酸序列，通常被置于控制元件的控制之下，所述控制元件例如启动子、最小启动子、增强子或类似物。对于驱使期望的宿主细胞中核酸表达是有用的起始控制区或启动子有许多，并且是本领域技术人员熟悉的。实际上任何能够驱使这些基因的启动子都适合于本发明，其包括但不限于：病毒启动子、细菌启动子、动物启动子、哺乳动物启动子、合成启动子、组成性启动子、组织特异性启动子、发育特异性启动子、可诱导的启动子、光调控的启动子；CYC1、HIS3、GAL1、GAL4、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、碱性磷酸酶启动子(对于在酵母菌Saccharomyces中表达是有用的)；AOX1启动子(对于在毕赤酵母Pichia中表达是有用的)；β-内酰胺酶、lac、ara、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac和trc启动子(对于在大肠杆菌中表达是有用的)；光调控的、种子特异性的、花粉特异性的、子房特异性的、发病或疾病相关的花椰菜花叶病 毒35S、极小的CMV 35S、木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)，叶绿素a/b结合蛋白，核酮糖1,5-二磷酸羧化酶，茎特异性的、根特异性的甲壳酶，应激诱导的水稻东格鲁杆状病毒，植物超启动子，马铃薯亮氨酸氨基肽酶，硝酸盐还原酶，甘露碱合酶，胭脂氨酸合酶，泛素，玉米蛋白和花色苷启动子(对于在植物细胞中表达是有用的)；本领域已知的动物和哺乳动物启动子包括但不限于SV40早期(SV40e)启动子区域、被包含在劳斯肉瘤病毒(RSV)的3’长末端重复序列(LTR)中的启动子、腺病毒(Ad)的E1A或主要晚期启动子(MLP)基因的启动子、细胞巨化病毒(CMV)早期启动子、单纯性疱疹病毒(HSV)胸腺嘧啶核苷激酶(TK)启动子、杆状病毒IE1启动子、延伸因子1α(EF1)启动子、磷酸甘油酸酯激酶(PGK)启动子、泛素(Ubc)启动子、白蛋白启动子、小鼠金属硫蛋白-L启动子的调控序列和转录控制区、遍在启动子(HPRT、波形蛋白、α-肌动蛋白、微管蛋白以及类似物)、中间丝的启动子(结蛋白、神精丝、角蛋白、GFAP以及类似物)、(MDR、CFTR或VIII型因子以及类似物的)治疗基因的启动子、发病或疾病相关的启动子以及展现了组织特异性并被用在转基因动物中的启动子如在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区域；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区域、在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区域、在睾丸、乳房、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区域；在肝脏中有活性的白蛋白基因、Apo AI和Apo AII控制区域、在肝脏中有活性的α-胎蛋白基因控制区域、在肝脏中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区域、在骨髓细胞中有活性的β-珠蛋白基因控制区域、在脑中少突胶质细胞中有活性的髓磷脂碱蛋白基因控制区域、在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区域以及在下丘脑中有活性的促性腺释放激素基因控制区域、丙酮酸激酶启动子、绒毛蛋白启动子、脂肪酸结合肠蛋白的启动子、平滑肌细胞α-肌动蛋白的启动子以及类似物。此外，可通过加入增强子或调控序列以及类似物来修饰这些表达序列。
可通过本领域已知方法将载体引入期望的宿主细胞，所述方法例如转染、电穿孔、微注射、转导、细胞融合、DEAE、葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质转染(溶酶体融合)、基因枪的使用或DNA载体运载蛋白(参见，例如Wu等,J.Biol.Chem.267:963-967(1992)；Wu等,J.Biol.Chem. 263:14621-14624(1988)；和Hartmut等,加拿大专利申请编号2,012,311，提交于1990年3月15日)。
还可通过脂质转染将本发明的多核苷酸引入体内。在过去的十年中，使用脂质体来在体外包裹并转染核酸的情况持续增加。可以使用为了限制在脂质体介导的转染中遇到的难度和危险而被设计的合成的阳离子脂质来制备用于在体内转染编码标志物的基因的脂质体(Felgner等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84:7413(1987)；Mackey等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:8027-8031(1988)；和Ulmer等,Science 259:1745-1748(1993))。阳离子脂质的使用可促进带负电的核酸的包裹，并且还促进与带负电的细胞膜的融合(Felgner等,Science 337:387-388(1989))。用来转移核酸的特别有用的脂质化合物和组合物在WO95/18863、WO96/17823和U.S.5,459,127中被描述。使用脂质转染在体内将外源性基因引入特定器官具有某些实际的优势。脂质体向特定细胞的分子靶向代表一方面的优势。显然，将转染指向特定细胞类型在具有细胞异质性的组织中将是特别优选的，其中所述具有细胞异质性的组织例如胰、肝、肾和脑。为了靶向的目的，可将脂质化学地偶合至其他分子(上述Mackey等1988)。可将被靶向的肽如激素或神经递质以及蛋白如抗体或非肽分子化学地偶合至脂质体。
其他分子对于促进体内核酸的转染也是有用的，例如阳离子低聚肽(例如，WO95/21931)、衍生自DNA结合蛋白的肽(例如，WO96/25508)或阳离子多聚体(例如，WO95/21931)。
还可能将载体作为裸露的DNA质粒体内引入(参见美国专利5,693,622、5,589,466和5,580,859)。还可使用受体介导的DNA输送方法(Curiel等,Hum.Gene Ther.3:147-154(1992)；和Wu等,J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987))。
术语“转染”是指细胞对外源性或异源性RNA或DNA的吸收。当这种RNA或DNA被引入细胞内时，细胞就被外源性或异源性RNA或DNA“转染”。当被转染的RNA或DNA导致表型改变时，细胞就被外源性或异源性RNA或DNA“转化”。可将转化RNA或DNA整合(共价连接)到构成细胞基因组的染色体DNA。
“转化”是指将核酸片段转移进宿主生物体的基因组以导致基因稳定的遗传。含有被转化的核酸片段的宿主生物体是指“转基因的”或“重组的”或“转化的”生物体。
另外，包括本发明多核苷酸的重组载体可包含细胞宿主中一种或多种复制起点以及标志物或可选的标志物，在所述细胞宿主中寻求它们的扩增或表达。
术语“可选的标志物”是指识别因子，其通常为能够基于标志物基因的作用即对抗生素的抵抗、对除草剂的抵抗、比色标志物、酶、荧光标志物以及类似物而被选择的抗生素或化学抵抗基因，其中所述作用被用来追踪感兴趣的核酸的遗传和/或鉴定遗传了感兴趣的核酸的细胞或生物体。本领域已知和使用的可选的标志物基因的例子包括：提供对氨苄西林、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、潮霉素、双丙氨磷除草剂、磺胺以及类似物的抵抗的基因；以及被用作表型标志物的基因即花色苷调控基因、异戊醇转移酶基因以及类似物。
术语“报道基因”是指编码识别因子的核酸，其能够基于报道基因的作用而被鉴定，其中所述作用被用来追踪感兴趣的核酸的遗传，鉴定遗传了感兴趣的核酸的细胞或生物体和/或测量基因表达的诱导或转录。本领域已知和使用的报道基因的例子包括：荧光素酶(Luc)、绿荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡萄糖醛酸酶(Gus)以及类似物。可选的标志物基因还可被视为报道基因。
“启动子”和“启动子序列”可被互换地使用并指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的DNA序列。通常，编码序列位于启动子序列的3’侧。启动子可作为整体衍生自天然基因，或由衍生自天然发现的不同启动子的不同元件所组成，或甚至包括合成的DNA区段。据本领域技术人员理解，不同启动子可指导不同组织或细胞类型中的，或在发育的不同阶段中的，或对不同环境或生理条件进行应答时的基因表达。导致基因在多数细胞类型和多数时间中表达的启动子通常被称作“组成性启动子”。导致基因在特定细胞类型中表达的启动子通常被称作“细胞特异性启动子”或“组织特异性启动子”。导致基因在发育或细胞分化特定阶段中表达的启 动子通常被称作“发育特异性启动子”或“细胞分化特异性启动子”。被诱导并导致基因在将细胞暴露于或用诱导启动子的试剂、生物分子、化学品、配体、光或类似物处理之后表达的启动子通常被称作“可诱导的启动子”或“可调控的启动子”。还认识到，由于多数情况下调控序列的确切界限未被完全界定，不同长度的DNA片段可具有相同的启动子活性。
启动子序列通常在其3’末端由转录起始位点界定并向上游延伸(5’方向)以包括最小数量的碱基或元件，所述碱基或元件对于在背景之上可检测的水平的转录起始是必要的。在启动子序列中将发现转录起始位点(例如通过用核酸酶S1进行定位来方便地确定)以及负责结合RNA聚合酶的蛋白结合结构域(共有序列)。
当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA时，编码序列是“受控”于细胞中的转录和翻译控制序列的，所述mRNA然后被反式RNA剪接(如果所述编码序列含有内含子)并翻译成编码序列所编码的蛋白。
“转录和翻译控制序列”是指DNA调控序列例如启动子、增强子、终止子以及类似物，其提供宿主细胞中编码序列的表达。在真核细胞中，多腺苷酸化信号是控制序列。
术语“应答元件”是指一种或多种顺式作用DNA元件，其赋予启动子通过与转录因子的DNA结合结构域相互作用而介导的应答，所述转录因子的DNA结合结构域例如第一杂交蛋白的DNA结合结构域。该DNA元件可以是回文的序列(完美的或不完美的)或由序列模体或被可变数量的核苷酸分离的半位点所组成。该半位点可以是相似或相同的并被排列为直接或倒置的重复或者单个半位点或串联的相邻半位点的多聚体。所述应答元件可包括从不同生物体分离的最小启动子，其取决于将引入所述应答元件的细胞或生物体的性质。第一杂交蛋白的DNA结合结构域在存在或不存在配体的情况下结合至应答元件的DNA序列以在该应答元件的调控下开始或抑制下游基因的转录。天然蜕皮素受体的应答元件的DNA序列的例子包括：RRGG/TTCANTGAC/ACYY(SEQ ID NO:16)(参见Cherbas等,Genes Dev.5:120-131(1991))；AGGTCAN(n)AGGTCA，其中N(n)可以是一种或多种间隔区核苷酸(SEQ ID NO:17)(参见D'Avino等,Mol.Cell. Endocrinol.113:1-9(1995))；以及GGGTTGAATGAATTT(SEQ ID NO:18)(参见Antoniewski等,Mol.Cell Biol.14:4465-4474(1994))。
术语“可操作地连接”是指核酸序列在单个核酸片段上的缔合以使一个的功能受到另一个的影响。例如，当能够影响编码序列的表达时(即所述编码序列在启动子的转录控制之下)，将启动子与编码序列可操作地连接。可将编码序列以有义或反义方向可操作地连接至调控序列。
本文所用术语“表达”是指衍生自核酸或多核苷酸的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定聚集。表达还可指mRNA翻译成蛋白或多肽。
术语“盒”、“表达盒”和“基因表达盒”是指可在特定的限制位点或通过同源重组插入核酸或多核苷酸的DNA区段。所述DNA区段包括编码感兴趣的多肽的多核苷酸，并且所述盒和限制位点被设计以确保所述盒被插入转录和翻译的适当阅读框架。“转化盒”是指包括编码感兴趣的多肽的多核苷酸并且具有除了促进特定宿主细胞转化的多核苷酸之外的元件的特定载体。本发明的盒、表达盒、基因表达盒以及转化盒还可包括允许编码宿主细胞中感兴趣的多肽的多核苷酸增强表达的元件。这些元件可包括但不限于：启动子、最小启动子、增强子、应答元件、终止子序列、多腺苷酸化序列以及类似物。
为了本发明的目的，术语“基因开关”是指与启动子相关的应答元件和基于EcR的系统的组合，其中所述基于EcR的系统在一种或多种配体的存在下调节基因的表达，而应答元件和启动子被整合进所述基因。
术语“调节(modulate)”和“调节(modulates)”是指诱导、减少或抑制核酸或基因表达，并导致蛋白或多肽生产的相应的诱导、减少或抑制。
本发明的质粒或载体还可包括至少一个适合驱使宿主细胞中基因表达的启动子。
可被用在本发明实施方案中的增强子包括但不限于：SV40增强子、细胞巨化病毒(CMV)增强子、延伸因子1(EF1)增强子、酵母增强子、病毒基因增强子以及类似物。
终止控制区域即终止子或多腺苷酸化序列还可衍生自优选的宿主中 天然的各种基因。可选地，终止位点可以是不必要的，然而如果被包括进来则是最优选的。在本发明一个实施方案中，终止控制区域可被包括或衍生自合成的序列、合成的多腺苷酸化信号、SV40晚期多腺苷酸化信号、SV40多腺苷酸化信号、牛生长激素(BGH)多腺苷酸化信号、病毒终止子序列或类似物。
术语“3’非编码序列”或“3’非翻译区(UTR)”是指位于编码序列下游(3’)的DNA序列，并可包括多腺苷酸化[poly(A)]识别序列以及编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其他序列。多腺苷酸化信号通常被表征为影响多聚腺苷酸束向mRNA前体的3’端的添加。
“调控区域”是指调控第二个核酸序列的表达的核酸序列。调控区域可包括天然地负责表达特定核酸的序列(同源区域)，或可包括负责表达不同蛋白或甚至合成的蛋白的不同起源的序列(异源区域)。特别地，所述序列可以是原核、真核或病毒基因的序列或衍生的序列，其以特定的或非特定的方式并且以可诱导的或不可诱导的方式刺激或抑制基因转录。调控区域包括复制起点、RNA剪接位点、启动子、增强子、转录终止序列以及将多肽导向靶细胞的分泌途径的信号序列。
来自“异源来源”的调控区域是指不与所表达的核酸天然相连的调控区域。包括在异源调控区域之中的是来自不同物种的调控区域、来自不同基因的调控区域、杂交调控序列以及不天然存在却是由本领域普通技术人员设计的调控序列。
“RNA转录物”是指由RNA聚合酶催化的DNA序列转录所得的产物。当RNA转录物是DNA序列的完美互补拷贝时，它被称作初级转录物或者它可以是衍生自初级转录物的转录后加工的RNA序列并被称作成熟RNA。“信使RNA(mRNA)”是指不含内含子并可被细胞翻译成蛋白的RNA。“cDNA”是指与mRNA互补并衍生自mRNA的双链DNA。“有义”RNA是指包括mRNA并因此可被细胞翻译成蛋白的RNA转录物。“反义RNA”是指与所有或部分的靶初级转录物或mRNA互补的并且阻断靶基因表达的RNA转录物。反义RNA的互补可以是与特定基因转录物的任何部分即5’非编码序列、3’非编码序列或编码序列。“功能性RNA”是指反 义RNA、核酶RNA或未被翻译但对细胞加工有作用的其他RNA。
“多肽”、“肽”和“蛋白”被可互换地使用并指包括共价连接的氨基酸残基的多聚体化合物。氨基酸具有如下通用结构：
“分离的多肽”、“分离的肽”或“分离的蛋白”是指基本上不含通常以天然状态与其相连的那些化合物(例如其他蛋白或多肽、核酸、碳水化合物、脂质)的多肽或蛋白。“分离的”不意味着排除与其他化合物的人工的或合成的混合物，或干扰生物活性的杂质的存在，其中所述杂质可由于例如不完全的纯化、稳定剂的添加或配制成药学上可接受的制剂而存在。
“取代突变体多肽”或“取代突变体”将被理解为是指这样的突变体多肽，其包括用与野生型或天然存在的多肽相关的不同氨基酸取代至少一个(1)野生型或天然存在的氨基酸。取代突变体多肽可包括仅一个(1)野生型或天然存在的氨基酸的取代并可被称作“点突变体”或“单点突变体”多肽。可选地，取代突变体多肽可包括两个(2)或更多个野生型或天然存在的氨基酸被2个或更多个与野生型或天然存在的多肽相关的氨基酸的取代。根据本发明，包括取代突变的组H核受体配体结合结构域多肽包括至少一个(1)野生型或天然存在的氨基酸被与野生型或天然存在的组H核受体配体结合结构域多肽相关的不同氨基酸的取代。
当取代突变体多肽包括两个(2)或更多个野生型或天然存在的氨基酸的取代时，该取代可包括相等数量的为了所述取代而缺失的野生型或天然存在的氨基酸即2个野生型或天然存在的氨基酸被2个非野生型或非天然存在的氨基酸所替换，或者不相等数量的为了所述取代而缺失的野生型氨基酸即2个野生型氨基酸被1个非野生型氨基酸所替换(取代+缺失突变)或2个野生型氨基酸被3个非野生型氨基酸所替换(取代+插入突变)。
可使用缩略的命名系统来描述取代突变体以表示氨基酸残基和在参考多肽序列和新的被取代的氨基酸残基中被替换的个数。例如，多肽的第 二十个(20th)氨基酸残基被取代的取代突变体可被缩略为“x20z”，其中“x”是待替换的氨基酸，“20”是多肽中氨基酸残基位置或编号，而“z”是新的被取代的氨基酸。因此，被互换地缩略为“E20A”或“Glu20Ala”的取代突变体表示所述突变体包括丙氨酸残基(本领域中通常缩略为“A”或“Ala”)对谷氨酸(本领域中通常缩略为“E”或“Glu”)在所述多肽位置20上的替换。
可以通过本领域已知的任何诱变技术进行取代突变，其包括但不限于体外位点定向诱变(Hutchinson等,J.Biol.Chem.253:6551(1978)；Zoller等,DNA 3:479-488(1984)；Oliphant等,Gene 44:177(1986)；Hutchinson等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:710(1986))、连接剂(Pharmacia)的使用、限制性内切酶消化/片段缺失和取代、PCR介导的/低聚核苷酸定向的诱变以及类似物。基于PCR的技术对于位点定向诱变是优选的(参见Higuchi，1989，"Using PCR to Engineer DNA"(使用PCR来改造DNA)，在PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification(PCR技术：DNA扩增的原理和应用)中，H.Erlich，编辑，Stockton出版社，第6章，第61-70页)。
本发明多肽的“片段”是指这样一种多肽，其氨基酸序列比参考多肽短，且整段包括与这些参考多肽相同的氨基酸序列。在适当时，这种片段可作为一部分而被包括在较大的多肽中。本发明这种多肽片段可具有至少2、3、4、5、6、8、10、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26、30、35、40、45、50、100、200、240或300个氨基酸的长度。
多肽或蛋白的“变体”是指任何类似物、片段、衍生物或突变体，其衍生自多肽或蛋白并保持所述多肽或蛋白的至少一种生物学性质。多肽或蛋白的不同变体可天然存在。这些变体可以是特征为编码所述蛋白的结构性基因的核苷酸序列的差异的等位基因变异，或可包括差别剪接或翻译后修饰。技术人员能制造具有单个或多个氨基酸取代、缺失、添加或替换的变体。这些变体可尤其包括：(a)其中一个或多个氨基酸残基被保守或不保守的氨基酸所取代的变体，(b)其中一个或多个氨基酸被添加到多肽或蛋白的变体，(c)其中一个或多个氨基酸包括取代基的变体，和(d)其中 多肽或蛋白与另一个多肽例如血清白蛋白融合的变体。获得这些变体的技术包括遗传(抑制、缺失、突变等)、化学和酶技术，是本领域普通技术人员已知的。变体多肽优选地包括至少约14个氨基酸。
术语“同源性”是指两种多核苷酸或两种多肽部分之间同一性的百分比。可以使用本领域已知技术来确定一个部分和另一个部分序列之间的对应。例如，可以通过将序列信息排在一起并使用容易获得的计算机程序来直接对比两种多肽分子之间的序列信息以确定同源性。可选地，可以通过将多核苷酸在形成同源区域之间稳定双链体的条件下杂交来确定同源性，随后用单链特异性核酸酶进行消化并且确定消化片段的大小。
如本文所用，所有语法形式和拼写变化的术语“同源的”是指具有“共同进化起源”的蛋白之间的关系，所述蛋白包括来自超家族(例如，免疫球蛋白超家族)的蛋白和来自不同物种的同源蛋白(例如，肌球蛋白轻链等)(Reeck等,Cell 50:667(1987))。这种蛋白(以及它们的编码基因)具有序列同源性，其通过它们高度的序列相似性得到反映。然而，在通常使用和本申请中，当用副词例如“高度”修饰时，术语“同源的”可以指序列相似性而非共同进化起源。
因此，所有语法形式的术语“序列相似性”是指可以或可以不共有共同进化起源的蛋白的核酸或氨基酸序列之间的同一性或对应程度(Reeck等,Cell 50:667(1987))。在一个实施方案中，当至少约50％(优选地至少约75％，并且最优选地至少约90或95％)的核苷酸在限定长度的DNA序列上匹配时，两条DNA序列是“基本上同源的”或“基本上相似的”。可通过使用序列数据库中可得的标准软件，或者在例如特定系统所限定的严格条件下的Southern杂交实验中将序列进行比较而鉴定基本上同源的序列。限定适当的杂交条件是在本领域技术之内的(参见，例如上述Sambrook等,1989)。
如本文所用，“基本上相似的”是指这样的核酸片段，其中在一种或多种核苷酸碱基上的改变导致一种或多种氨基酸的取代，但不影响由DNA序列编码的蛋白的功能特性。“基本上相似的”还指这样的核酸片段，其中在一种或多种核苷酸碱基上的改变不影响核酸片段通过反义或共抑制 技术来调节基因表达改变的能力。“基本上相似的”还指本发明核酸片段的修饰，例如一种或多种核苷酸碱基的缺失或插入，其基本上不影响所得转录物的功能特性。因此据理解，本发明涵盖多过特定的示范性序列。被提出的修饰中的每个是在本领域常规技术内的，如对编码的产物生物活性的保持进行确定。
此外，技术人员意识到，本发明所涵盖的基本上相似的序列还被它们在严格条件下(0.1X SSC、0.1％SDS、65℃并用2X SSC、0.1％SDS冲洗，接着是0.1X SSC、0.1％SDS)与本文所示例的序列杂交的能力所限定。基本上相似的本发明的核酸片段是其DNA序列与本文所报道的核酸片段的DNA序列至少70％相同的那些核酸片段。本发明的核酸片段包括其DNA序列与本文所报道的核酸片段的DNA序列至少80％相同的那些核酸片段。其他核酸片段与本文所报道的核酸片段的DNA序列至少90％相同。其他核酸片段与本文所报道的核酸片段的DNA序列至少95％相同。
两条氨基酸序列当超过约40％的氨基酸是相同的或者超过60％是相似的(功能相同)时是“基本上同源的”或“基本上相似的”。优选地，通过使用例如GCG(Genetics Computer Group(遗传学计算机组)，Program Manual for the GCG Package(GCG包的程序手册)，第7版，Madison，Wisconsin)堆积程序进行对比来鉴定相似或同源的序列。
本文使用术语“对应于”来指相似的或同源的序列，不管确切位置是与被测量相似性或同源性的分子相同还是不同。核酸或氨基酸序列的对比可包含空隙。因此，术语“对应于”是指序列相似性而非氨基酸残基或核苷酸碱基的编号。
氨基酸或核苷酸序列的“相当一部分”包括足够的多肽氨基酸序列或基因的核苷酸序列以推定地鉴定该多肽或基因，其通过本领域技术人员人工地评估所述序列或者使用算法例如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool(基本的局部对比搜索工具)；Altschul等,J.Mol.Biol.215:403 410(1993)；还参见www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)通过计算机自动化的序列对比和鉴定来进行。通常，为了推定地鉴定多肽或核酸序列与已知蛋白或基因是同源的，十个或更多连续氨基酸或者三十个或更多核苷酸的序列是 必要的。此外，关于核苷酸序列，可以以基因鉴定(例如，Southern杂交)和分离(例如，细菌菌落或噬菌斑的原位杂交)的序列依赖性方法使用包括20-30个连续核苷酸的基因特异性低聚核苷酸探针。另外，12-15个碱基的短的低聚核苷酸可被用作PCR的扩增引物以获得包括所述引物的特定核酸片段。因此，“相当一部分”的核苷酸序列包括足够的序列以特别地鉴定和/或分离包括所述序列的核酸片段。
本领域已知的术语“百分比同一性”是通过比较其序列而确定的两种或更多种多肽序列或两种或更多种多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，“同一性”还指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关程度，视情况而定，其由这种序列串之间的匹配所确定。可以使用已知方法容易地计算“同一性”和“相似性”，所述方法包括但不限于被描述在如下的那些：Computational Molecular Biology(计算分子生物学)(Lesk,A.M.编辑)牛津大学出版社，纽约(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects(生物计算：信息学和基因组计划)(Smith,D.W.编辑)学术出版社，纽约(1993)；Computer Analysis of Sequence Data(序列数据的计算机分析)，第I部分(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑)Humana出版社，新泽西(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(分子生物学中的序列分析)(von Heinje,G.编辑)学术出版社(1987)；和Sequence Analysis Primer(序列分析初级读本)(Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)Stockton出版社，纽约(1991)。将确定同一性的方法设计为在被测序列之间展现最好的匹配。将确定同一性和相似性的方法以公众可得的计算机程序编码。可以使用LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTAR有限公司，Madison，WI)的Megalign程序来进行序列对比和百分比同一性计算。可以使用带有缺省参数(GAP PENALTY＝10，GAP LENGTH PENALTY＝10)的Clustal对比方法(Higgins等,CABIOS.5:151 153(1989))进行序列的多重对比。使用Clustal方法配对对比的缺省参数可被选择：KTUPLE 1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5和DIAGONALS SAVED＝5。
术语“序列分析软件”是指对于分析核苷酸或氨基酸序列有用的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可以是商业上可得的或独立地 开发的。通常的序列分析软件将包括但不限于GCG程序套件(Wisconsin包第9.0版，Genetics Computer Group(遗传学计算机组)(GCG)，Madison,WI)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-410(1990))和DNASTAR(DNASTAR有限公司，1228 S.Park St.Madison,WI53715美国)。在本申请的范围内，将被理解的是，在序列分析软件被用于分析时，分析结果将基于参考程序的“缺省值”，除非另外说明。如本文所用，“缺省值”将指当其被第一次初始化时随着软件最初载入的任何值或参数组。
与DNA序列相关的“化学合成的”是指，组成性核苷酸是在体外装配的。可使用很好地确立的方法来实现DNA的人工化学合成，或者可使用若干商业上可得的机器之一进行自动化的化学合成。因此，可以为了基于核苷酸序列的最优化的最佳基因表达来定制基因以反映宿主细胞的密码子偏倚性。技术人员理解成功的基因表达的可能性，如果密码子的使用偏向于被宿主偏爱的那些密码子。优选的密码子的确定可基于衍生自宿主细胞的基因的调查，所述宿主细胞中的序列信息是可得的。
如本文所用，当下述时称两种或多种独立可操作的基因调控系统是“正交的”：a)相应配体在所选浓度下对每个所给系统的调节导致该系统基因表达强度的可测量的改变，和b)所述改变在统计学上显著不同于在所有其他系统表达的改变，其中所述所有其他系统在细胞、组织或生物体中是同时可操作的，不管实际调节的同时性或连续性。优选地，每种独立可操作的基因调控系统的调节导致超过细胞、组织或生物体中所有其他可操作的系统至少2倍的基因表达改变。更优选地，所述改变是超过至少5倍。甚至更优选地，所述改变是超过至少10倍。还更优选地，所述改变是超过至少100倍。甚至还更优选地，所述改变是超过至少500倍。理想地，每种所给系统被所选浓度的其相应配体的调节导致该系统基因表达强度可测量的改变，并且未导致在细胞、组织或生物体中可操作的所有其他系统的表达的可测量的改变。在这种情况下，多重可诱导基因调控系统被称为是“完全正交的”。本发明对于搜寻正交的配体和例如描述在US 2002/0110861 A1中的正交的基于受体的基因表达系统是有用的，其整体通 过引用被并入本文。
术语“调节”是指所给配体/受体复合物诱导或抑制外源性基因的反式激活的能力。
术语“外源性基因”是指对于所述受试者是外来的基因，即通过转化过程被引入所述受试者的基因，其为外源性突变基因的未突变版本或者外源性未突变基因的突变版本。转化的方法对于本发明不是关键性的，并可以是适合于本领域已知受试者的任何适合的方法。例如，通过从被转化的细胞再生而获得转基因植物。从文献中可以知道许多转化程序，例如使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或其T1质粒的农杆菌感染法、电穿孔、植物细胞和原生质体的微注射以及微粒转化。用来转化动物细胞和在转基因动物中再生这种被转化的细胞的互补技术是已知的。外源性基因可以是天然的或合成的基因，以及以DNA或RNA的形式被引入所述受试者的治疗基因，所述DNA或RNA可通过DNA中间产物例如逆转录酶起作用。这种基因可被引入靶细胞，直接地引入所述受试者或者间接地通过被转化的细胞例如自体细胞的转移来引入所述受试者。术语“治疗基因”是指将有利功能传递给宿主细胞的基因，其中所述宿主细胞表达这种基因。
术语“蜕皮素受体复合物”通常指异二聚体蛋白复合物，其由类固醇受体家族的两个成员蜕皮素受体(“EcR”)和超气门(“USP”)蛋白所组成(Yao等,Nature 366:476-479(1993))；Yao等,Cell 71:63-72(1992))。功能性蜕皮类固醇受体复合物还可包括另外的蛋白例如抑免蛋白。类固醇受体蛋白质家族的另外成员还可以是配体依赖性的或不依赖性的EcR和/或USP配偶体，被称作转录因子(例如DHR38、βFTZ-1或其他昆虫同系物)。蜕皮素受体复合物还可以是蜕皮素受体蛋白和超气门蛋白的脊椎动物同系物即视黄酸-X-受体(“RXR”)蛋白的异二聚体。蜕皮素受体蛋白或USP的同二聚体复合物在一些情况下还可以是功能性的。
可通过结合至复合物中一种蛋白的活性蜕皮类固醇或非类固醇配体来激活蜕皮类固醇受体复合物，其中所述的复合物中一种蛋白包括EcR但不排除复合物的其他蛋白。
蜕皮素受体复合物包括作为类固醇受体超家族成员的蛋白，其中所有成员特征为存在氨基酸末端反式激活结构域、DNA结合结构域(“DBD”)和被铰链区域分离的配体结合结构域(“LBD”)。所述家族的一些成员在LBD羧基端一侧还可具有另一种反式激活结构域。DBD特征为存在两个半胱氨酸锌指，在所述锌指之间是两个氨基酸模体即P-盒和D-盒，其赋予对蜕皮素应答元件以特异性。这些结构域可以是天然的、修饰的或异源性受体蛋白不同结构域的嵌合体。
构成外源性基因、应答元件和蜕皮素受体复合物的DNA序列可被引入古细菌，原核细胞例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或其他肠道细菌，或者真核细胞例如植物或动物细胞。然而，因为基因表达的许多蛋白在细菌内被不正确地加工，真核细胞是优选的。所述细胞可以是单个细胞或多细胞生物体的形式。外源性基因、应答元件和受体复合物的核苷酸序列还可作为RNA分子被并入，优选地以功能性病毒RNA例如烟草花叶病毒的形式。在真核细胞中，脊椎动物细胞是优选的，因为它们天然缺失对本发明中蜕皮素受体的配体产生应答的分子。结果，它们对本发明的配体是“基本上不敏感的”。因此，本发明的配体将对被转化的细胞或整个生物体具有可忽略的生理或其他作用。因此，细胞可生长并表达期望的产物，而基本上不受配体自身存在的影响。
术语“受试者”是指完整的昆虫、植物或动物或来自昆虫、植物或动物的细胞。还预期，当受试者为真菌或酵母时，配体将同样出色地工作。当所述受试者为完整动物时，优选地所述动物为脊椎动物，最优选地为哺乳动物。
当与蜕皮素受体复合物一起使用时，本发明中式I的二酰基肼配体和式II或III的手性二酰基肼配体提供外部短暂调控外源性基因表达的方法，其中所述蜕皮素受体复合物反过来结合至被连接到外源性基因的应答元件上。各种组件互相结合即配体结合至受体复合物和受体复合物结合至应答元件的顺序不是关键的。通常，外源性基因表达的调节是回应蜕皮素受体复合物与特异性对照或调控DNA元件的结合。与类固醇受体家族其他成员相似，蜕皮素受体蛋白具有至少三个结构域即反式激活结构域、DNA 结合结构域和配体结合结构域。与类固醇受体家族亚型相似，该受体还具有较少完全确定的区域，其对异二聚化特性负责。配体对蜕皮素受体蛋白的配体结合结构域的结合在与USP或RXR蛋白异二聚化之后，致使异二聚体蛋白的DNA结合结构域与激活形式的应答元件结合，从而导致外源性基因的表达或抑制。该机制不排除配体结合EcR或USP以及导致活性同二聚体复合物(例如EcR+EcR或USP+USP)形成的潜力。优选地，一个或多个受体结构域可被改变以产生嵌合基因开关。通常，三个结构域中的一个或多个可选自不同于其他结构域的来源，以致于嵌合受体在所选宿主细胞或生物体中为了反式激活活性、对配体的互补结合以及对特异性应答元件的识别而被优化。另外，应答元件自身可被修饰或被其他DNA结合蛋白结构域的应答元件所取代以适应嵌合的蜕皮素受体复合物，其中所述其他DNA结合蛋白结构域的应答元件例如来自酵母的GAL-4蛋白(参见Sadowski等,Nature 335:563-564(1988))或来自大肠杆菌的LexA蛋白(参见Brent等,Cell 43:729-736(1985))。嵌合系统的另一个优势是，它们允许选择被用来根据期望的最终结果而驱使外源性基因的启动子。这种双重控制在基因疗法领域中是特别重要的，特别是当产生细胞毒性蛋白时，因为表达的时间安排和发生表达的细胞二者皆可被控制。当将可操作地连接至适合的启动子的外源性基因引入受试者中的细胞中时，外源性基因的表达通过本发明配体的存在被控制。启动子可被组成性地或可诱导地调控或可以是组织特异性的(即只在特定细胞类型中表达)或对生物体特定发育阶段具有特异性。
编码各种多肽的许多基因组和cDNA核酸序列是本领域已知的。与本发明的配体一起有用的外源性遗传物质包括编码感兴趣的生物活性蛋白的基因例如，可从细胞释放的分泌性蛋白；可将底物由毒性物质代谢为非毒性物质或由非活性物质代谢为活性物质的酶；调控蛋白；细胞表面受体；以及类似物。有用的基因还包括编码凝血因子、激素例如胰岛素、甲状旁腺激素、促黄体激素释放因子、α和β精子抑制素和人生长激素的基因；编码蛋白例如酶的基因，其缺失导致异常状态的发生；编码细胞因子或淋巴因子例如干扰素、粒细胞性巨噬细胞集落刺激因子、集落刺激因子-1、肿瘤坏死因子和促红细胞生成素的基因；编码抑制剂物质例如α1-抗胰蛋白 酶的基因、编码作为药物例如白喉和霍乱毒素而起作用的物质的基因；以及类似物。有用的基因还包括对癌症疗法以及治疗遗传病症有用的那些。本领域技术人员具有获得几乎所有已知基因的核酸序列信息的途径，并且可从公共仓库即发表该序列的研究所直接获得核酸分子或者使用常规方法来制备所述分子。
在一个实施方案中，外源性基因是在RheoSwitchTM治疗系统(RTS)控制之下的hIL-12基因，其离体地通过腺病毒转染进自体树突细胞。
为了用于基因疗法，本文所述配体可被单独地或作为药物组合物的一部分施用，所述药物组合物包括药学上可接受的载体。在一个实施方案中，药物组合物是溶液、悬液、片剂、胶囊剂、软膏剂、酏剂或可注射的组合物的形式。
药学上可接受的载体包括填充剂例如糖如乳糖或蔗糖、甘露醇或山梨醇、纤维素制剂和/或磷酸钙如磷酸三钙或磷酸氢钙，以及结合剂例如淀粉糊，其使用例如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮。如果希望，可加入崩解剂例如上述的淀粉还有羧甲基淀粉、交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或者海藻酸或其盐例如海藻酸钠。辅助剂是流量调控剂和润滑剂例如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其盐例如硬脂酸镁或硬脂酸钙和/或聚乙二醇。在一个实施方案中，提供了含有适合的包衣的糖衣丸核心，所述包衣，如果被期望，对胃液具有抵抗性。为了该目的，可使用浓缩的糖溶液，其可以选择地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和适合的有机溶剂或溶剂混合物。为了产生对胃液有抵抗性的包衣，使用了适合的纤维素制剂例如邻苯二酸乙酰纤维素或邻苯二酸羟丙基甲基纤维素的溶液。为了识别或为了表征活性化合物剂量的组合，可将染料或色素加入片剂或糖衣丸的包衣。
其他可被口服使用的药物制剂包括由明胶制成的推入配合(push-fit)胶囊剂，以及由明胶和增塑剂例如甘油或山梨醇制成的软的、密封的胶囊剂。推入配合的胶囊剂可含有颗粒或纳米颗粒形式的活性化合物，其可被可选地与填充剂例如乳糖、结合剂例如淀粉和/或润滑剂例如滑石或硬脂酸 镁，以及可选地稳定剂进行混合。在一个实施方案中，其被溶解或悬浮在适合的液体例如脂肪油或液体石蜡中，可选地与稳定剂一起。
脂肪油可包括甘油单、二或三酯。甘油单、二或三酯包括衍生自C6、C8、C10、C12、C14、C16、C18、C20和C22酸的那些。示例性的甘油二酯特别地包括二油精、二棕榈一油精和混合的辛酸甘油酯-癸酸甘油酯甘油二酯。优选的甘油三酯包括植物油、鱼油、动物脂肪、氢化植物油、部分氢化的植物油、合成的甘油三酯、修饰的甘油三酯、分馏的甘油三酯、中链和长链甘油三酯、结构化的甘油三酯及其混合物。示例性的甘油三酯包括：杏仁油；巴西棕榈树油；琉璃苣油；黑醋栗种子油；加拿大低芥酸菜籽油；蓖麻油；椰子油；玉米油；棉籽油；月见草油；葡萄籽油；落花生油；芥籽油；橄榄油；棕榈油；棕榈仁油；花生油；菜籽油；红花油；芝麻油；鲨鱼肝油；大豆油；葵花籽油；氢化蓖麻油；氢化椰子油；氢化棕榈油；氢化大豆油；氢化植物油；氢化棉籽油和蓖麻油；部分氢化大豆油；部分大豆和棉籽油；三己酸甘油酯；三辛酸甘油酯；三癸酸甘油酯；三-十一酸甘油酯；三-月桂酸甘油酯；三油酸甘油酯；三亚油酸甘油酯；三亚麻酸甘油酯；三辛酸/癸酸甘油酯；三辛酸/癸酸/月桂酸甘油酯；三辛酸/癸酸/亚油酸甘油酯以及三辛酸/癸酸/硬脂酸甘油酯。
在一个实施方案中，甘油三酯是中链甘油三酯，其以商标名LABRAFAC CC可获得。其他的甘油三酯包括中性油例如中性植物油，特别是分馏的椰子油例如已知的和以商标名MIGLYOL商业上可得的，其包括如下产品：MIGLYOL 810；MIGLYOL 812；MIGLYOL 818和CAPTEX 355。其他的甘油三酯是辛-癸酸甘油三酯例如已知的和以商标名MYRITOL商业上可得的，其包括产品MYRITOL 813。该类甘油三酯还有CAPMUL MCT、CAPTEX 200、CAPTEX 300、CAPTEX 800、NEOBEE M5和MAZOL 1400。
包括甘油三酯的药物组合物还可包括亲脂的和/或亲水的表面活性剂，其在溶于水溶剂时可形成澄清的溶液。一种这样的表面活性剂是生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(维生素E TPGS)。这种组合物的例子在美国专利6,267,985中被描述。
在另一个实施方案中，药学上可接受的载体包括LABRASOL(Gattefosse SA)，其为PEG-8辛-癸酸甘油三酯。在另一个实施方案中，药学上可接受的载体包括PL90G、维生素E TPGS和Miglitol 812N。这种制剂的组分被显示在表1中。
表1
可经直肠使用的可能的药物制剂包括例如栓剂，其由含有栓剂基质的一种或多种配体的组合所组成。适合的栓剂基质是例如天然的或合成的甘油三酯或石蜡烃。另外，还可能使用明胶直肠胶囊，其由配体和基质的组合所组成。可能的基质物质包括例如液体甘油三酯、聚乙二醇或石蜡烃。
胃肠外施用的适合制剂包括水溶形式的配体的水溶液，例如水溶性盐和碱性溶液。另外，配体悬液可作为适当的油状注射悬液施用。适合的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油例如芝麻油或者合成脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯或聚乙二醇-400。水注射悬液可含有增加悬液粘性的物质，其包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。可选地，悬液还可包含稳定剂。
还可将局部组合物通过选择适当的载体而配制为油、乳膏、洗液、软膏以及类似物。适合的载体包括植物或矿物油、白色矿脂(白色软石蜡)、支链的脂肪或油、动物脂肪和高分子量乙醇(高于C12)。如果期望的话，还可包括乳化剂、稳定剂、湿润剂和抗氧化剂以及带来颜色或香味的剂。另外，还可将经皮渗透增强剂用于这些局部制剂中。这种增强剂的例子可在第3,989,816和4,444,762号美国专利中找到。
可由矿物油、自乳化蜂蜡和水的混合物配制乳膏，其中掺入了溶解于 少量油例如杏仁油的配体。这种乳膏的典型例子包括约40份水、约20份蜂蜡、约40份矿物油和约1份杏仁油。
可通过将植物油例如杏仁油中的配体悬液与温暖的软石蜡混合并使混合物冷却而配制软膏。这种软膏的典型例子是包括按重量计约30％杏仁油和约70％白色软石蜡的软膏。
可通过制备配体在适合的高分子量醇例如丙二醇或聚乙二醇中的悬液来方便地制备洗液。
可被添加进药物组合物的抗氧化剂的例子包括BHA和BHT。
在一个实施方案中，固体明胶胶囊中的药物组合物包括每mL LABRASOL中30mg配体。在另一个实施方案中，所述胶囊含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg配体。
药物组合物可含有按重量计0.01％至99％的配体。组合物可以是单剂或多剂形式。任何特定药物组合物中配体的量将取决于有效剂量，即引发期望的基因表达或抑制所需的剂量。在一个实施方案中，将0.1至7.5mg/kg施用于受试者。在另一个实施方案中，将0.1至3mg/kg施用于受试者。在另一个实施方案中，施用0.1至3mg/kg。
施用药物组合物的适合途径包括口服、直肠、局部(包括皮肤、口腔和舌下)、阴道、胃肠外(包括皮下、肌肉内、静脉内、皮内、鞘内、肿瘤内和硬膜外)和经过鼻胃管。本领域技术人员将理解，优选的施用途径将取决于被治疗的状况，并可随例如接受者的状况等因素改变。每天可施用一次或多次所述药物组合物。在一个实施方案中，每天从施用含有蜕皮素受体复合物和DNA结合序列的细胞之前24小时开始施用所述药物组合物。
本文所述的本发明式I的二酰基肼配体或者式II或III的手性二酰基肼配体还可与其他药学上有活性的化合物共同施用。本领域技术人员将理解，将选择与本文所述配体共同使用的药学上有活性的化合物以避免对接受者的不良作用或化合物之间不期望的相互作用。可与所述配体共同使用 的其他药学上有活性的化合物的例子包括例如AIDS化疗剂、氨基酸衍生物、止痛剂、麻醉剂、肛门直肠产品、抗酸剂和抗胃肠气胀药、抗生素、抗凝血剂、解毒剂、抗纤溶剂、抗组胺剂、抗炎剂、抗肿瘤剂、抗寄生虫剂、抗原生动物剂、退烧药、防腐剂、镇痉剂和抗胆碱能剂、抗病毒剂、食欲抑制剂、关节炎药物、生物反应调节剂、骨代谢调控剂、肠道排泄剂、心血管药物、中枢神经系统刺激剂、脑代谢增强剂、耳垢溶解剂、胆碱酯酶抑制剂、感冒和咳嗽制剂、集落刺激因子、避孕剂、细胞保护剂、牙科制剂、除臭剂、皮肤科用药、解毒剂、糖尿病药物、诊断剂、腹泻药、多巴胺受体激动剂、电解质、酶和助消化剂、麦角制剂、致育剂、纤维补充剂、抗真菌剂、溢乳抑制剂、胃酸分泌抑制剂、胃肠促动剂、促性腺激素抑制剂、头发生长刺激剂、补血药、血液流变学制剂、止血剂、组胺H2受体拮抗剂、激素、促血糖增高剂、降血脂药、免疫抑制剂、缓泻药、抗麻风剂、白细胞清除辅助剂、肺表面活性物质、偏头痛制剂、粘液溶解剂、肌肉松弛剂拮抗剂、肌肉松弛剂、麻醉拮抗剂、鼻腔喷雾剂、恶心药物核苷类似物、营养补充品、骨质疏松症制剂、催产药、副交感神经阻断药、拟副交感神经剂、帕金森病的药物、青霉素佐剂、磷脂、血小板抑制剂、卟啉剂、前列腺素类似物、前列腺素、质子泵抑制剂、瘙痒症药物拟精神药物、喹诺酮类药物、呼吸刺激剂、唾液刺激剂、盐替代品、硬化剂、皮肤伤口制剂、戒烟助剂、磺胺药、抗交感神经药、血栓溶解剂、Tourette氏综合征剂、颤抖症制剂、肺结核制剂、促尿酸排泄剂、尿道剂、子宫收缩剂、子宫松弛剂、阴道制剂、眩晕剂、维生素D类似物、维生素以及医学成像对比剂。在一些情况下，所述配体作为药物疗法的佐剂可以是有用的，例如“关闭”一种基因，所述基因产生使特定药物新陈代谢的酶。
为了农业应用，除了上述的应用之外，本发明的配体还可被用来控制杀虫蛋白例如苏云金芽孢杆菌(Bt)毒素的表达。这种表达可以是组织或植物特异性的。此外，特别地当也需要控制植物害虫时，可将一种或多种杀虫剂与本文所述配体合并，从而提供另外的优势和效力，包括比单独应用杀虫剂更少的总施用。当使用与杀虫剂的混合物时，组合物中每种组分的相应比例将取决于每种杀虫剂关于庄稼、害虫和/或待处理的杂草的相对有效性和期望的施用量。本领域技术人员将意识到，杀虫剂混合物可提供 优点例如比单独使用的一种杀虫剂更广谱的活性。能与本文所述配体合并成组合物的杀虫剂的例子包括杀真菌剂、除草剂、杀虫剂、杀螨剂和杀微生物剂。
本文所述的本发明式I的二酰基肼配体和式II或III的手性二酰基肼配体可通过通常使用的方法作为水喷雾被应用到植物叶子，所述方法例如通常的大容积水力喷雾、小容积喷雾、空气鼓风和空气喷雾。稀释和施用量将取决于所用仪器的类型、期望的施用的方法和频率和配体施用量。可以期待在喷雾罐中包含另外的佐剂。这种佐剂包括表面活性剂、分散剂、撒播剂、粘着剂、消泡剂、乳化剂以及其他相似物质，其被描述于每年由MC出版公司的McCutcheon部门(新泽西)所出版的McCutcheon's Emulsifiers and Detergents(McCutcheon氏乳化剂和去污剂)、McCutcheon's Emulsifiers and Detergents/Functional Materials(McCutcheon氏乳化剂和去污剂/功能性物质)以及McCutcheon's Functional Materials(McCutcheon氏功能性物质)。这些配体还可在施用前与肥料或施肥材料混合。这些配体和固体施肥材料还可在混合或掺和设备中混合，或者它们可与颗粒制剂中的肥料结合。可以使用肥料的任何相对比率，其适合待处理的庄稼和杂草。本文所述配体通常将包括5％至50％的施肥组合物。这些组合物提供促进所期望的植物的快速生长的施肥材料，并且同时控制基因表达。
宿主细胞和非人生物体
如上所述，式I的二酰基肼配体和式II或III的手性二酰基肼配体可被用来调节宿主细胞中的基因表达。转基因宿主细胞中的表达对于感兴趣的各种基因的表达可能是有用的。本发明提供调节原核和真核宿主细胞中基因表达的配体。
转基因宿主细胞中的表达对于感兴趣的各种多肽的表达是有用的，其中所述多肽包括但不限于在植物中作为疫苗而被产生的抗原；酶，如α-淀粉酶、肌醇六磷酸酶、葡萄聚糖和木聚糖酶；抵抗植物中昆虫、线虫、真菌、细菌、病毒和非生物应激的基因；抗原；营养品；药品；维生素；修饰氨基酸含量、杀虫剂抵抗、耐冷、耐干旱和耐热性的基因；工业产品；油、蛋白、碳水化合物；抗氧化剂；雄性不育植物；花；燃料；其他输出 特征；可被用来治疗状况、疾病、病症、功能异常或遗传缺陷的治疗多肽或产品，例如单克隆抗体、酶、蛋白酶、细胞因子、干扰素、胰岛素、促红细胞生成素、凝血因子、其他血液因子或成分；用于基因疗法的病毒载体；作为疫苗的病毒；药物开发的靶、功能基因组和蛋白质组学分析和应用：用于调节已经存在于宿主中的途径的途径中间产物；用于合成之前使用宿主不可能合成的新产物的途径中间产物；基于细胞的测定；功能基因组测定；蛋白质组学测定以及类似物。另外，对于带来宿主的更高生长产量或对于实现待使用的可选的生长模式，基因产物可能是有用的。
因此，本发明提供式I的二酰基肼配体和式II或III的手性二酰基肼配体来调节分离的宿主细胞中的基因表达。在一个实施方案中，分离的宿主细胞是原核宿主细胞或真核宿主细胞。在另一个实施方案中，分离的宿主细胞是无脊椎动物宿主细胞或脊椎动物宿主细胞。优选地，宿主细胞选自由细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、线虫细胞、昆虫细胞、鱼细胞、植物细胞、禽细胞、动物细胞和哺乳动物细胞所组成的组。更优选地，宿主细胞是酵母细胞、线虫细胞、昆虫细胞、植物细胞、斑马鱼细胞、鸡细胞、仓鼠细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、兔细胞、猫细胞、狗细胞、牛细胞、山羊细胞、奶牛细胞、猪细胞、马细胞、绵羊细胞、猿细胞、猴细胞、黑猩猩细胞或人细胞。宿主细胞的例子包括但不限于真菌或酵母种例如曲霉菌属、木霉菌属、酵母属、毕赤酵母属、念珠菌属、汉森酵母属，或细菌种例如在集胞藻属、聚球藻属、沙门氏菌属、芽胞杆菌属、不动杆菌属、红球菌属、链霉菌属、大肠杆菌属、假单胞菌属、甲基单胞菌属、甲基杆菌属、产碱杆菌属、鱼腥藻属、硫杆菌属、甲烷杆菌属和克雷伯氏杆菌属中的那些；植物种，选自由苹果、拟南芥、珍珠粟、香蕉、大麦、大豆、糖萝卜、黑豆、鹰嘴豆、辣椒、黄瓜、茄子、蚕豆、玉米、甜瓜、小米、绿豆、燕麦、秋葵、黍、木瓜、花生、豌豆、胡椒、木豆、菠萝、菜豆、土豆、南瓜、大米、高粱、大豆、南瓜、甘蔗、甜菜、向日葵、红薯、茶叶、番茄、烟草、西瓜和小麦所组成的组；动物；以及哺乳动物宿主细胞。
在另一个实施方案中，宿主细胞是酵母细胞，其选自由酵母、毕赤酵母和假丝酵母宿主细胞所组成的组。
在另一个实施方案中，宿主细胞是秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)细胞。
在另一个实施方案中，宿主细胞是昆虫细胞。
在另一个实施方案中，宿主细胞是植物细胞，其选自由苹果、拟南芥、珍珠粟、香蕉、大麦、大豆、糖萝卜、黑豆、鹰嘴豆、辣椒、黄瓜、茄子、蚕豆、玉米、甜瓜、小米、绿豆、燕麦、秋葵、黍、木瓜、花生、豌豆、胡椒、木豆、菠萝、菜豆、土豆、南瓜、大米、高粱、大豆、南瓜、甘蔗、甜菜、向日葵、红薯、茶叶、番茄、烟草、西瓜和小麦细胞所组成的组。
在另一个实施方案中，宿主细胞是斑马鱼细胞。
在另一个实施方案中，宿主细胞是鸡细胞。
在另一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，其选自由仓鼠细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、兔细胞、猫细胞、狗细胞、牛细胞、山羊细胞、奶牛细胞、猪细胞、马细胞、绵羊细胞、猴细胞、黑猩猩细胞和人细胞所组成的组。
宿主细胞转化是本领域众所周知的，并可以通过许多方法实现，所述方法包括但不限于电穿孔、病毒感染、质粒/载体转染、非病毒载体介导的转染、农杆菌介导的转化、粒子轰击以及类似方法。期望的基因产物的表达包括在适合的条件下培养被转化的宿主细胞并诱导被转化基因的表达。原核和真核细胞的培养条件和基因表达方案是本领域众所周知的。可以收集细胞并根据针对基因产物的方案分离基因产物。
另外，可以选择这样的宿主细胞，其调节被插入的多核苷酸的表达，或以期望的特定方式修饰并加工多肽产物。不同的宿主细胞对于蛋白的翻译和翻译后的加工和修饰(例如，糖基化、裂解(例如信号序列的))具有特征性的和特异性的机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以保证被表达的外来蛋白的期望的修饰和加工。例如，可以使用细菌系统中的表达来产生非糖基化的核心蛋白产物。然而，表达在细菌中的多肽可能未被适当地折叠。在酵母中的表达可产生糖基化的产物。在真核细胞中的表达能增加异源性蛋白“天然”糖基化和折叠的可能性。此外，在哺乳动物细胞中 的表达能提供再生或构成多肽活性的工具。此外，不同的载体/宿主表达系统可在不同程度上影响加工反应，例如溶蛋白性裂解。本发明式I的二酰基肼配体和式II或III的手性二酰基肼配体可被用于非人生物体，其包括分离的宿主细胞。在一个实施方案中，非人生物体是原核生物体或真核生物体。在另一个实施方案中，非人生物体是无脊椎动物生物体或脊椎动物生物体。
优选地，非人生物体选自由细菌、真菌、酵母、线虫、昆虫、鱼、植物、鸟、动物和哺乳动物所组成的组。更优选地，非人生物体是酵母、线虫、昆虫、植物、斑马鱼、鸡、仓鼠、小鼠、大鼠、兔、猫、狗、牛、山羊、奶牛、猪、马、绵羊、猿、猴或黑猩猩。
在另一个实施方案中，非人生物体是酵母，其选自由酵母、毕赤酵母和假丝酵母所组成的组。
在另一个实施方案中，非人生物体是秀丽隐杆线虫。
在另一个实施方案中，非人生物体是植物，其选自由苹果、拟南芥、珍珠粟、香蕉、大麦、大豆、糖萝卜、黑豆、鹰嘴豆、辣椒、黄瓜、茄子、蚕豆、玉米、甜瓜、小米、绿豆、燕麦、秋葵、黍、木瓜、花生、豌豆、胡椒、木豆、菠萝、菜豆、土豆、南瓜、大米、高粱、大豆、南瓜、甘蔗、甜菜、向日葵、红薯、茶叶、番茄、烟草、西瓜和小麦所组成的组。
在另一个实施方案中，非人生物体是小家鼠(Mus musculus)。
基因表达调节系统
本发明涉及式I的二酰基肼配体和式II或III的手性二酰基肼配体，其在基于蜕皮素受体的可诱导基因表达系统中是有用的。这些二酰基肼配体在原核和真核宿主细胞二者中提供改进的可诱导基因表达系统。因此，本发明涉及用于调节基因表达的式I的二酰基肼配体和式II或III的手性二酰基肼配体。特别地，本发明涉及具有反式激活基因表达调节系统的能力的式I的二酰基肼配体和式II或III的手性二酰基肼配体，其中所述基因表达调节系统包括至少一种基因表达盒，所述基因表达盒能够被表达在宿主细胞中，所述宿主细胞包括编码含有组H核受体配体结合结构域的多 肽的多核苷酸。在一个实施方案中，组H核受体配体结合是来自蜕皮素受体、遍在受体、孤独受体1、NER-1、类固醇激素核受体1、类视黄醇X受体相互作用蛋白-15、肝X受体β、类固醇激素受体样蛋白、肝X受体、肝X受体α、类法尼醇X受体、受体相互作用蛋白14或法呢醇受体。在另一个实施方案中，组H核受体配体结合结构域来自蜕皮素受体。
在另一个实施方案中，基因表达调节系统包括基因表达盒，其包括编码多肽的多核苷酸，其包括反式激活结构域、识别和其表达待调节的基因相关的应答元件的DNA结合结构域以及包括取代突变的组H核受体配体结合结构域。基因表达调节系统还可包括第二个基因表达盒，其包括：i)被第一个基因表达盒的编码的多肽的DNA结合结构域所识别的应答元件；ii)被第一个基因表达盒的编码的多肽的反式激活结构域所激活的启动子；以及iii)其表达待调节的基因。
在另一个实施方案中，基因表达调节系统包括一个基因表达盒，其包括a)编码多肽的多核苷酸，其包括反式激活结构域、识别和其表达待调节的基因相关的应答元件的DNA结合结构域以及包括取代突变的组H核受体配体结合结构域，以及b)第二个核受体配体结合结构域，其选自由脊椎动物类视黄醇X受体配体结合结构域、无脊椎动物类视黄醇X受体配体结合结构域、超气门蛋白配体结合结构域和包含两个多肽片段的嵌合配体结合结构域所组成的组，其中第一个多肽片段来自脊椎动物类视黄醇X受体配体结合结构域、无脊椎动物类视黄醇X受体配体结合结构域或超气门蛋白配体结合结构域，而第二个多肽片段来自不同的脊椎动物类视黄醇X受体配体结合结构域、无脊椎动物类视黄醇X受体配体结合结构域或超气门蛋白配体结合结构域。基因表达调节系统还可包括第二个基因表达盒，其包括：i)被第一个基因表达盒的编码的多肽的DNA结合结构域所识别的应答元件；ii)被第一个基因表达盒的编码的多肽的反式激活结构域所激活的启动子；以及iii)其表达待调节的基因。
在另一个实施方案中，基因表达调节系统包括第一基因表达盒和第二个基因表达盒，第一基因表达盒包括编码第一多肽的多核苷酸，其包括识别和其表达待调节的基因相关的应答元件的DNA结合结构域以及核受体 配体结合结构域，而第二个基因表达盒包括编码第二多肽的多核苷酸，其包括反式激活结构域和核受体配体结合结构域，其中核受体配体结合结构域之一是包括取代突变的组H核受体配体结合结构域。在一个实施方案中，第一多肽基本上不含反式激活结构域，而第二多肽基本上不含DNA结合结构域。对本发明目的，“基本上不含”是指所讨论的蛋白不含足以提供激活或结合活性的所讨论结构域的序列。基因表达调节系统还可包括第三个基因表达盒，其包括：i)被第一个基因表达盒的第一多肽的DNA结合结构域所识别的应答元件；ii)被第二个基因表达盒的第二个多肽的反式激活结构域所激活的启动子；以及iii)其表达待调节的基因。
其中当只有一个核受体配体结合结构域是包括取代突变的组H核受体配体结合结构域时，另一个核受体配体结合结构域可来自与包括取代突变的组H核受体配体结合结构域形成二聚体的任何其他核受体。例如，当包括取代突变的组H核受体配体结合结构域是包括取代突变的蜕皮素受体配体结合结构域时，另一个核受体配体结合结构域(“配偶体”)可来自蜕皮素受体、脊椎动物类视黄醇X受体(RXR)、无脊椎动物RXR、超气门蛋白(USP)或包括至少两种不同核受体配体结合结构域多肽片段的嵌合核受体，其中所述多肽片段选自由脊椎动物RXR、无脊椎动物RXR和USP所组成的组(参见WO 01/70816 A2、国际专利申请第PCT/US02/05235号和US 2004/0096942 A1，其通过引用全文并入本文)。“配偶体”核受体配体结合结构域还可包括截断突变、缺失突变、取代突变或另外的修饰。
在一个实施方案中，脊椎动物RXR配体结合结构域来自人类Homo sapiens、小鼠Mus musculus、大鼠Rattus norvegicus、鸡Gallus gallus、猪Sus scrofa domestica、蛙Xenopus laevis、斑马鱼Danio rerio、被囊动物Polyandrocarpa misakiensis或水母Tripedalia cysophora RXR。
在一个实施方案中，无脊椎动物RXR配体结合结构域来自飞蝗Locusta migratoria超气门多肽(“LmUSP”)、硬蜱螨Amblyomma americanum RXR同系物1(“AmaRXR1”)、硬蜱螨Amblyomma americanum RXR同系物2(“AmaRXR2”)、招潮蟹Celuca pugilator RXR同系物(“CpRXR”)、甲虫Tenebrio molitor RXR同系物(“TmRXR”)、蜜蜂Apis mellifera RXR 同系物(“AmRXR”)、蚜虫Myzus persicae RXR同系物(“MpRXR”)或非双翅类昆虫/非鳞翅类昆虫RXR同系物。
在一个实施方案中，嵌合RXR配体结合结构域包括至少两个多肽片段，其选自由脊椎动物种RXR多肽片段、无脊椎动物种RXR多肽片段和非双翅类昆虫/非鳞翅类昆虫无脊椎动物种RXR同系物多肽片段所组成的组。用于本发明的嵌合RXR配体结合结构域可包括至少两种不同种RXR多肽片段，或者当所述物种相同时，所述两种或更多种多肽片段可来自所述种RXR多肽片段的两种或更多种不同的同工型。
在一个实施方案中，嵌合RXR配体结合结构域包括至少一种脊椎动物种RXR多肽片段和一种无脊椎动物种RXR多肽片段。
在另一个实施方案中，嵌合RXR配体结合结构域包括至少一种脊椎动物种RXR多肽片段和一种非双翅类昆虫/非鳞翅类昆虫无脊椎动物种RXR同系物多肽片段。
在另一个实施方案中，其表达待调节的基因是关于宿主细胞的同源基因。在另一个实施方案中，其表达待调节的基因是关于宿主细胞的异源基因。
如下述用于本发明的式I的二酰基肼配体和式II或III的手性二酰基肼配体，当与核受体的配体结合结构域合并时，提供基因表达的外部短暂调控方法，其中所述核受体的配体结合结构域反过来结合至连接到基因的应答元件。结合机制或本发明各种成分互相结合的顺序不是关键的，其中所述结合亦即例如配体对配体结合结构域、DNA结合结构域对应答元件、反式激活结构域对启动子等。
蜕皮素受体是核受体超家族的成员，并被归类为超家族1组H(本文称作“组H核受体”)。每组的成员在E(配体结合)结构域中共有40-60％的氨基酸同一性(Laudet等,Cell 97:161-163(1999))。除了蜕皮素受体，该核受体超家族1组H的其他成员包括：遍在受体(UR)、孤独受体1(OR-1)、类固醇激素核受体1(NER-1)、类视黄醇X受体相互作用蛋白-15(RIP-15)、肝X受体β(LXRβ)、类固醇激素受体样蛋白(RLD-1)、肝X受体(LXR)、 肝X受体α(LXRα)、类法尼醇X受体(FXR)、受体相互作用蛋白14(RIP-14)和法尼醇受体(HRR-1)。
在特定的例子中，配体与组H核受体配体结合结构域以及它的核受体配体结合结构域配偶体的结合导致基因的表达或抑制。该机制不排除配体与组H核受体(GHNR)或它的配偶体的结合潜力，以及所致的活性同二聚体复合物的形成(例如GHNR+GHNR或配偶体+配偶体)。优选地，改变一种或多种受体结构域以产生杂交基因开关。通常，三种结构域即DBD、LBD和反式激活结构域中一个或多个可选自不同于其他结构域来源的来源，以便在所选宿主细胞或生物体中为了反式激活活性、配体的互补结合和特异性应答元件的识别而将杂交基因和所得的杂交蛋白最优化。另外，应答元件本身可被修饰或被其他DNA结合蛋白结构域例如来自酵母的GAL-4蛋白(参见Sadowski等,Nature 335:563-564(1988))或来自大肠杆菌的LexA蛋白(参见Brent等,Cell 43:729-736(1985))的应答元件所取代，或者被对于与蛋白的靶向相互作用有特异性的合成应答元件所取代，其中所述蛋白为了适应杂交受体而被设计、修饰和选择以用于此特定的相互作用(参见，例如，Kim等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:3616-3620(1997))。双杂交系统的另一个优点是，它们允许根据期望的最终结果来选择启动子以用来驱使基因表达。这种双重控制在基因疗法领域可以是特别重要的，特别是当产生细胞毒性蛋白时，因为表达的时间安排和表达所发生在的细胞二者都可被控制。当被可操作地连接至适合的启动子的基因被引入受试者的细胞中时，外源性基因的表达受到本发明系统的存在的控制。启动子可被组成性地或可诱导地调控，或者可以是组织特异性的(即只在特定类型的细胞中表达)或对生物体特定发育阶段具有特异性。
特别地，本文所述的是在基因表达调节系统中有用的式I的二酰基肼配体和式II或III的手性二酰基肼配体，所述基因表达调节系统包括含有取代突变的组H核受体配体结合结构域。该基因表达系统可以是基于“单开关”的基因表达系统，在其中反式激活结构域、DNA结合结构域和配体结合结构域在一个被编码的多肽上。可选地，基因表达调节系统可以是基于“双开关”或“双杂交”的基因表达调节系统，在其中反式激活结构域 和DNA结合结构域位于两个不同的被编码的多肽上。
本发明所用的基于蜕皮素受体的基因表达调节系统可以是异二聚化的或同二聚化的。功能性EcR复合物通常指异二聚化蛋白复合物，其由类固醇受体家族的两种成员、从各种昆虫获得的蜕皮素受体蛋白以及超气门(USP)蛋白或USP的脊椎动物同系物即类视黄醇X受体蛋白所组成(参见Yao等,Nature 366:476-479(1993)和Yao等,Cell 71:63-72(1992))。然而，所述复合物还可以是如下所述的同二聚体。功能性蜕皮类固醇受体复合物还可包括另外的蛋白例如抑免蛋白。被称作转录因子(例如DHR38或βFTZ-1)的类固醇受体蛋白质家族的另外成员还可以是EcR、USP和/或RXR的配体依赖性的或非依赖性的配偶体。另外，还可能需要其他辅助因子例如通常被称作共同激活子(还被称作适配子或调节子)的蛋白。这些蛋白不序列特异性地结合至DNA，并且不被包括在基态转录中。它们可能通过各种机制对转录激活产生作用，所述机制包括通过影响染色质结构或调节激活子-起始复合物的相互作用来刺激激活子的DNA结合。这种共同激活子的例子包括RIP140、TIF1、RAP46/Bag-1、ARA70、SRC-1/NCoA-1、TIF2/GRIP/NCoA-2、ACTR/AIB1/RAC3/pCIP以及混杂的共同激活子C应答元件B结合蛋白、CBP/p300(关于综述，参见Glass等,Curr.Opin.Cell Biol.9:222-232(1997))。并且，为了有效地抑制在不含配体时的转录激活，可能需要通常被称作共同抑制子(还被称作抑制子、沉默子或沉默调节子)的蛋白辅助因子。这些共同抑制子可与未配体的蜕皮素受体相互作用以沉默应答元件的活性。目前的证据表明，配体的结合改变受体的构象，其导致共同抑制子的释放和上述共同激活子的募集，从而破坏它们的沉默活性。共同抑制子的例子包括N-CoR和SMRT(关于综述，参见Horwitz等,Mol Endocrinol.10:1167-1177(1996))。这些辅助因子可以是在细胞或生物体中内源性的，或可以被作为转基因外源性地加入而以调控的或未被调控的方式被表达。蜕皮素受体蛋白、USP或RXR的同二聚体复合物在一些情况下还可以是功能性的。
蜕皮素受体复合物通常包含作为核受体超家族成员的蛋白，所述核受体超家族中的所有成员通常被表征为存在氨基末端反式激活结构域、DNA 结合结构域(“DBD”)和被铰链区域从DBD分离的配体结合结构域(“LBD”)。如本文所用，术语“DNA结合结构域”包括DNA结合蛋白的最小多肽序列直至全长的DNA结合蛋白，只要DNA结合结构域起作用以与特别的应答元件缔合。核受体超家族的成员还被表征为存在四或五个结构域：A/B、C、D、E以及在一些成员中的F(参见US 4,981,784和Evans,Science 240:889-895(1988))。“A/B”结构域对应于反式激活结构域，“C”对应于DNA结合结构域，“D”对应于铰链区域，而“E”对应于配体结合结构域。该家族一些成员还可在LBD的羧基末端一侧具有另外的反式激活结构域，其对应于“F”。
DBD被表征为存在两个半胱氨酸锌指，在其之间是两个氨基酸模体即P-盒和D-盒，其赋予对蜕皮素应答元件以特异性。这些结构域可以是天然的、修饰的或异源性受体蛋白不同结构域的嵌合体。EcR受体，像类固醇受体家族的亚型，还具有负责异二聚化特性的未完全界定的区域。因为核受体的结构域在性质上是组件式的，所以LBD、DBD和反式激活结构域可互换。
基因开关系统是已知的，其包含来自蜕皮素受体复合物的成分。然而，在这些已知的系统中，无论何时使用EcR，它都与天然或修饰的DNA结合结构域和反式激活结构域在同一个分子上缔合。USP或RXR通常被用作沉默配偶体。之前曾显示，当DNA结合结构域和反式激活结构域在相同分子上时在不存在配体下的背景活性是高的，而且当DNA结合结构域和反式激活结构域在不同分子上也就是各自在异二聚体或同二聚体复合物的两个配偶体上时这种活性被显著降低(参见PCT/US01/09050)。
调节基因表达的方法
本发明还涉及在宿主细胞中使用基因表达调节系统和本发明的配体来调节基因表达的方法。特别地，本发明提供调节宿主细胞中基因表达的方法，其包括步骤：a)将基因表达调节系统引入宿主细胞；和b)将式I的二酰基肼配体或者式II或III的手性二酰基肼配体引入宿主细胞；其中待调节的基因是基因表达盒的成分，所述基因表达盒包括：i)包括被基因表达系统的DNA结合结构域所识别的结构域的应答元件；ii)被基因表达 系统的反式激活结构域所激活的启动子；和iii)其表达待调节的基因，借此，当将式I的二酰基肼配体或者式II或III的手性二酰基肼配体引入宿主细胞之后，基因表达受到调节。
本发明还提供调节宿主细胞中基因表达的方法，其包括步骤：a)将基因表达调节系统引入宿主细胞；b)将基因表达盒引入宿主细胞，其中所述基因表达盒包括：i)包括被基因表达系统的DNA结合结构域所识别的结构域的应答元件；ii)被基因表达系统的反式激活结构域所激活的启动子；和iii)其表达待调节的基因；以及c)将式I的二酰基肼配体或者式II或III的手性二酰基肼配体引入宿主细胞；借此，当将式I的二酰基肼配体或者式II或III的手性二酰基肼配体引入宿主细胞之后，基因表达受到调节。
本发明还提供调节宿主细胞中基因表达的方法，其中所述宿主细胞包括基因表达盒，其含有应答元件，所述应答元件包括被基因表达调节系统的第一杂交多肽的DNA结合结构域所结合的结构域；被基因表达调节系统的第二杂交多肽的反式激活结构域所激活的启动子；以及其表达待调节的基因；其中所述方法包括步骤：a)将基因表达调节系统引入宿主细胞；和b)将式I的二酰基肼配体或者式II或III的手性二酰基肼配体引入宿主细胞；借此，当将配体引入宿主之后，基因表达受到调节。
使用本文所公开的方法在宿主细胞中表达的感兴趣的基因可以是内源性基因或异源性基因。期望的基因或蛋白的核酸或氨基酸序列信息可在许多公共数据库例如GENBANK、EMBL、Swiss-Prot和PIR中或许多生物学相关的期刊发表中找到。因此，本领域技术人员可以使用几乎所有已知基因的核酸序列信息。然后可将这种信息用于构建期望的构建体以将感兴趣的基因插入本发明所述方法中使用的基因表达盒中。
测量基因表达/转录
本发明所述方法的一个有用的测量是细胞的转录状态的测量，其包括RNA优选地为mRNA种的同一性和丰度。通过使用几种现存的基因表达技术中的任一种测量cDNA的丰度来方便地进行这种测量。
核酸阵列技术是用来确定mRNA差异表达的有用技术。这种技术包括例如低聚核苷酸芯片和DNA微阵列。这些技术依赖对应于不同基因或cDNA的DNA片段或低聚核苷酸，其中所述基因或cDNA被固定在固体支持体上并与探针进行杂交，所述探针是从在细胞、组织或整个生物体中提取的总mRNA库制备的并被转换成cDNA。低聚核苷酸芯片是在底物上使用光刻技术合成的低聚核苷酸阵列。已经生产了这样的芯片，其可被用来分析多达1700种基因。DNA微阵列是通常为PCR产物的DNA样品的阵列，其通过机器被印在显微镜载玻片上。通过全长或部分长的靶DNA序列来分析每个基因。目前在商业上常规地制备含有多达10,000个基因的微阵列。这两种技术之间的主要区别是，低聚核苷酸芯片通常使用允许分段成短DNA分子的25mer低聚核苷酸，而含有大约1000个碱基对的微阵列的较大DNA靶可在将复合的DNA混合物分割中提供更高的敏感性。
本发明所述方法的另一个有用的测量是确定细胞的翻译状态的测量，其通过使用本领域众所周知的方法来测量存在于细胞中的成分蛋白种的丰度。
当期望鉴定与各种生理功能相关的基因时，可以使用测量功能变化的测定，其中所述功能例如细胞生长、凋亡、老化、分化、粘连、对特定分子的结合、对另一个细胞的结合、细胞的组成、器官发生、细胞内运输、运输促进、能量转变、新陈代谢、肌形成、神经形成和/或血细胞生成。
另外，可选的标志物或报道基因表达可被用来测量使用本发明的基因表达调节。
检测基因表达产物的其他方法是本领域众所周知的，并且包含Southern印记(DNA检测)、斑点或狭缝印记(DNA、RNA)、Northern印记(RNA)、RT-PCR(RNA)、Western印记(多肽检测)和ELISA(多肽)分析。虽然较不优选，但可以使用被标记的蛋白来检测与之杂交的特定的核酸序列。
在一些情况下，有必要扩增核酸序列的量。这可使用若干适合方法中的一种或多种来进行，其包括例如聚合酶链式反应(“PCR”)、连接酶链式反应(“LCR”)、链置换扩增(“SDA”)、基于转录的扩增以及类似方法。 根据已知技术来进行PCR，例如在热稳定的DNA聚合酶的存在下、在杂交条件下、用一对低聚核苷酸引物、用一个同待测的特定序列的一条链(模板)杂交的引物处理核酸样品。所述引物与特定序列的每条模板链充分互补以与其杂交。每个引物的延伸产物被合成，并且与和它杂交的核酸模板链互补。从每个引物合成的延伸产物还可充当使用相同引物来进一步合成延伸产物的模板。在合成了延伸产物足够轮数之后，可按上述来分析所述样品以评估待检测的序列是否存在。
通用方法
本文所用的标准的重组DNA和分子克隆技术是本领域众所周知的，并且被描述在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)；冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989)(Maniatis)以及T.J.Silhavy,M.L.Bennan和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions(基因融合实验)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1984)以及Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验方法汇编)，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience(1987)。
适合于细菌培养物维持和生长的材料和方法是本领域众所周知的。适合于用在如下实施例中的技术可在如下所述中找到：Manual of Methods for General Bacteriology(普通细菌学方法手册)(Phillipp Gerhardt,R.G.E.Murray,Ralph N.Costilow,Eugene W.Nester,Willis A.Wood,Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips编辑)，American Society for Microbiology(美国微生物学会)，华盛顿特区(1994)或者Thomas D.Brock，Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology(生物技术：工业微生物学教科书)，第二版，Sinauer Associates,Inc.，Sunderland，MA(1989)。用于宿主细胞的生长和维持的所有试剂、限制酶和物质是从Aldrich Chemicals(Milwaukee,WI)、DIFCO Laboratories(Detroit,MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg,MD)或Sigma Chemical Company(St.Louis,MO)获得的，除非另外说明。
可使用得自Genetics Computer Group Inc.的程序包(Wisconsin Package第9.0版，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)来完成对遗传 序列的操作。当使用GCG程序“Pileup”时，可以使用gap产生的缺省值12，以及gap延伸的缺省值4。当使用CGC“Gap”或“Bestfit”时，可以使用缺省的gap产生罚分50，以及缺省的gap延伸罚分3。在任何情况下，在这些或任何其他GCG程序中当GCG程序参数未被提示时，可以使用缺省值。
在玻璃毛细管中用仪器测量了熔点并未被校正。在室温下于10cm长的石英池中使用Perkin Elmer341型旋光计测量旋光度([α]25589)。以g/100mL给出浓度。使用Bruker NMR在300MHz或400.13MHz下记录1H NMR光谱。除非另外说明，内部参比为溶剂。使用Bruker NMR在100.6MHz下记录13C NMR光谱。除非另外说明，内部参比为溶剂。使用与Agilent单级四级质谱仪偶合的Agilent 1100 LC层叠组件来进行LC-MS分析。溶剂是(A)H2O/0.1％甲酸和(B)ACN/0.1％甲酸，梯度为T＝0 15％B至T＝10 98％B，结束时间为20min，C18柱子尺寸为75mm×2.1mm，流速为0.2mL/min。通过直接注入Agilent ESI/TOF质谱仪来进行确切的质量分析。使用Bruker SMART6000来进行X-射线晶体结构的确定。在Perkin Elmer2400 CHN分析仪上进行元素分析。使用Macherey-NagelSil G/UV254 0.2mm板来进行分析性薄层色谱或TLC。大多数板被UV光成像。一些使用碘或磷钼酸显像。使用玻璃柱中的Aldrich硅胶(230-400孔，)在大约30psi的N2或氩气柱前压力下来进行硅胶色谱。使用装备有811C动态混合器、306 UV/VIS 155检测器和215液态操纵器的Gilson的HPLC系统来进行分析性HPLC。在220nm和254nm下测量UV吸光度，并且在254nm下进行整合。流速通常被保持在1mL/min。使用4.6mm×25cm的DuPont Zorbax ODS柱进行正相色谱。使用Alltech Adsorbosphere的5微米的4.6mm×25cm的C18柱进行反相色谱。使用的5微米的4.6mm×25cm的OD-H柱、的5微米的4.6mm×25cm的AD-H柱或5微米的的4.6mm×25cm的Regis Rexchrom(S,S)ULMO柱进行手性HPLC。溶剂是试剂级的，除非另外说明。使用与购买时一样的无水溶剂。
通用的合成方法
可通过如通用方案1所述的不对称合成来制备式II或III的对映体富集的化合物，其中A、B和R2如上定义而且R1是烯基。
通用方案1
被保护的肼1(例如肼基甲酸苄酯或肼基甲酸t-丁酯)和醛R2CHO的反应产生2。2的不对称烯丙基化提供对映体富集形式的3或4，这尤其取决于手性试剂和R2的选择。进行不对称烯丙基化反应的方法是本领域已知的，并可被用来制备本发明的化合物。在不对称烯丙基化反应中特别有用的手性试剂的合成被描述在Leighton等,J.Am.Chem.Soc.125:9596(2003)和WO 03/074534中。3与羧酸氯化物B-COCl的反应得到5。羧酸B-CO2H还可与3偶合以得到5。将5的保护基团移除而得到6。本领域技术人员意识到，有许多方法对肼进行脱保护，其取决于保护基团的性质。适合的保护/脱保护策略在“Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基团)”，T.W.Green和P.G.M.Wuts(1999)中有讨论。7与羧酸氯化物A-COCl或羧酸A-CO2H的反应得到8，即式II的化合物。相似地，4的反应导致式III的化合物。
还可通过如通用方案2所述的不对称还原来制备式II或III的对映体富集的化合物，其中A、B、R1和R2如上定义。
通用方案2
酰基肼1与酮R1COR2的反应提供腙2。2的不对称还原提供对映体富集形式的3或4，这尤其取决于还原剂、R1和R2的选择。US 5,250,731描述酰基腙的不对称催化氢化，其在手性磷烷催化剂复合物的存在下提供旋光的酰基肼。本领域技术人员意识到可以使用其他手性配体。而且，本领域技术人员将意识到，可以使用另外的不对称还原方法。在这个例子中，3与BCOCl的反应得到5，即式II的化合物。相似地，4的反应导致式III的化合物。
另外，可通过手性拆分，或者不对称合成和手性拆分的组合，或者不对称氢化和手性拆分的组合来制备式II或III的对映体富集的化合物。如通用方案3中所述，将外消旋二酰基肼进行手性HPLC色谱分析以提供式II或III的对映体富集的化合物。用于手性拆分的适合的手性柱子包括例如DaicelOD-H、DaicelAD-H和Regis Technologies ULMO手性柱子。其他的手性拆分方法也是可能的。用于手性拆分过程的外消旋二酰基肼可通过US 2005/0209283 A1和US 2006/0020146 A1中所述的方法学来制备。
通用方案3
还可使用标准的化学转化来进一步加工对映体富集的式II或III的化合物，其中R1是烯基。如通用方案4中所述，对于对映体富集的式III的化合物，烯基可被转化为烷基、羟烷基、用环烷基可选地取代的烷基、用杂环可选地取代的烷基、用烷氧基取代的烷基、卤代烷基和其他可选地取代的烷基。本领域技术人员将识别可用来将链烯转化为本发明其他基团的单或多步化学转化的分类。
通用方案4
实施例
通过参考上面提供的下面的通用合成方法和下面提供的非限制性的实施例，可更好地理解本发明，其作为本发明的例证而被提供。
实施例1
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼
合成
化合物1：肼基甲酸苄酯是商业上可得的。
化合物2：将肼基甲酸苄酯(300g，1.81摩尔)在装备有回流冷凝器、温度计、磁力搅拌和500mL添加漏斗的3L的4-颈烧瓶中溶解于1.2L甲醇中。将冰醋酸(5mL)加入混合物然后提升至45℃。在30分钟内将吡呋醛(248.8g溶液，2.17摩尔，在t-丁醇中大约75％)分批加入。将反应回流加热30分钟，同时用TLC进行监测。将混合物冷却至将近室温并在旋转式蒸发器上浓缩至大约700mL的总体积。在大约30℃下加入大约7g 活性碳。将混合物搅拌过夜并通过一片硅藻土(Celite)在孔径为“C”的玻璃烧结的布氏漏斗中过滤。在真空中将溶剂除去以留下浅黄色油，其被倒入结晶皿并通过用铲操作而被诱导结晶。将该物质颗粒化，并将残留的溶剂在空气中于室温下蒸发数日，留下420.4g的粗产物。在室温下从最初的300mL乙酸乙酯和1L己烷的沸腾混合物中重结晶，产生363.2g的近白色固体(E)-N’-(2,2-二甲基-亚丙基)-肼羧酸苄酯。从大约150mL己烷和45mL乙酸乙酯的混合物获得43.1g的第二次收获和相同的熔点。总产率：96.1％。Rf＝0.32(2:1己烷:乙酸乙酯)；mp＝74-74.5℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.0(1H，br s)，7.4-7.3(5H，m)，7.1(1H，s)，5.20(2H，s)，1.1(9H，s)。
化合物3：使用从Leighton等,J.Am.Chem.Soc.125:9596(2003)和WO 03/074534修改得来的过程来制备(S,S)-2-烯丙基-2-氯代-3,4-二甲基-5-苯基-[1,3,2]oxazasilolidine。整个过程是在无水的封闭系统下最小程度地且短暂地暴露于大气中进行的。首先将烯丙基三氯硅烷(419.5g，2.39摩尔)充入含有气体入口、顶端搅拌和添加漏斗的烘干的5L的4颈烧瓶，然后是2L的无水CH2Cl2。在冰/盐浴上氩气中将溶液冷却到0℃。通过添加漏斗将三乙胺(485g，4.79摩尔)加入，并将温度维持在0℃。在这一点上，反应是透明的琥珀色。使用固体添加漏斗在2h的时段内将S,S-假麻黄碱(359g，2.17摩尔)分批加入，并维持内部温度<15℃。使用200mL的CH2Cl2冲洗添加漏斗并加入反应。随着时间的流逝，糊状半颗粒状固体形成了(Et3NCl)。在冰上将浅褐色粘稠浆搅拌大约2h，然后除去冰浴，从而允许反应在几小时的一段时间内达到室温。大约12h后，通过蒸馏除去大多数CH2Cl2，并将系统维持在氩气下。加入1L的无水己烷，并再次将溶剂蒸馏。然后加入1L的无水戊烷，并在室温下氩气中将混合物搅拌大约1h。之前最初在CH2Cl2中形成的糊状浆变得更颗粒状，首先是在加入己烷时，然后特别是在加入戊烷之后。溶液的颜色是浅琥珀褐色的。一部分一部分地，并且通过使用温和的氩气压，将戊烷和可溶产物通过玻璃棉滤器和PFA管转移出反应烧瓶并进入装备有蒸馏头和磁力搅拌的第二只干燥的1L、3颈圆底烧瓶。在改变溶液转移方面，将戊烷蒸馏出该第二只烧瓶并留下浓缩的油状产物。重复该过程，各用500mL戊烷冲洗Et3NCl 残留物两次并将冲洗物在氩气环境下转移至第二只烧瓶。在大约10torr的真空下通过蒸馏收集成馏分的产物。在初馏物中收集到大约56.3g(9.7％)，其可能含有多达大约3％的烯丙基三氯硅烷。获得的主馏分即纯化的(S,S)-2-烯丙基-2-氯代-3,4-二甲基-5-苯基-[1,3,2]oxazasilolidine的量为413.3g(71％)，bp＝140-144@大约10torr，其作为轻微粘性的液体在收集时是浅黄色的，但在冷藏和用隔板/封口膜密封下几天内变成橙色。所述物质被冷藏储藏，未被鉴定并且未经纯化而用于随后的烯丙基化反应中。
化合物4：将装备有温度计和磁力搅拌的5L、4颈烧瓶在烘箱中干燥并被维持在氩气中，同时加入2L无水CH2Cl2，之后是N’-(2,2-二甲基-亚丙基)-肼羧酸苄酯(220g，939毫摩尔)。将混合物冷却并在大的大约10加仑的冰/盐浴中于2-3℃下进行搅拌。在大约30min内使用插管和温和的氩气压的协助来将(S,S)-2-烯丙基-2-氯代-3,4-二甲基-5-苯基-[1,3,2]oxazasilolidine(363g，1.355摩尔)加入烧瓶。最初的浅黄色溶液变成透明的浅橙色，而温度维持在2-3℃。允许反应自行温暖至室温，并通过在CH3OH中将一小部分猝灭并通过TLC(2:1己烷EtOAc)进行分析来进行监测。开始后36小时，TLC分析指示了大约90％完成。将混合物冷却到5℃，加入另外的48g(0.179毫摩尔)oxazasilolidine，并允许所述混合物温暖至室温。大约8小时后，再次将反应冷却至5℃，并用预先冷却的溶液(100g K2CO3在100mL去离子水中)猝灭大约1h的时间。在猝灭过程中，放出的热量将温度升至高达17℃。加入大约100mL另外的去离子水。溶液看上去变成了透明的蓝-绿色。在反应或猝灭中从未出现任何明显的气体释放。在室温下搅拌4天后，溶液是浅黄色，并且在5天后，有机相形成凝胶状但保持浅黄色。将混合物冷却至大约15℃(稍后明白这不必要)，加入大约1.25L己烷，并且使用顶端搅拌将所述凝胶部分地断裂和分散。将上清液离心(siphone off)并通过玻璃棉过滤，同时交替地将大约1L部分加到残留在烧瓶中的白色凝胶。还将另外的己烷加入上清液以使假麻黄碱作为白色固体沉淀并使任何残留凝胶断裂。将己烷提取物合并，并且在真空中除去溶剂。总的来说，通过凝胶的提取、己烷诱导的假麻黄碱沉淀以及通过玻璃棉和玻璃烧结布氏漏斗的过滤，使用大约5-6L己烷来获得黄色油状的粗制烯丙基酰肼。分批地用大约三体积的己烷处理 该粗制物质，允许其保持在室温下，从沉淀的假麻黄碱倾析出来，并被转移至分离漏斗。通过用大约各25mL 1.4N的HCl冲洗三次(大部分颜色也被除去)将产物溶液从残留的假麻黄碱中分离，接着用10％的K2CO3和盐水冲洗。将粗产物的己烷溶液在固体无水Na2SO4上干燥，在真空中除去溶剂以得到浅黄色的粘稠油。TLC(2:1己烷:EtOAc)显示期望的产物Rf＝0.4；两种杂质的是0.25和0.31(各自5-10％，其中一个可能是起始物质)，以及较不显著的杂质约为Rf＝0.4。之前在基线检测到的假麻黄碱现在是不存在的。在用真空泵除去痕量溶剂之后分离出琥珀色油状的全部196.8g(75.8％)的(R)-N'-(1-叔-丁基-丁-3-烯基)-肼羧酸苄酯。使用大约2L煮沸的己烷提取最初的凝胶，其现在是稍微浓缩和颗粒化的。过滤固体，脱去己烷，并从沉淀的假麻黄碱倾析出油，其产生大约18g。将该物质与来自上述原始产物批次(大约3-4g)的残留物合并，并用前述1.4N HCl、K2CO3水溶液和盐水冲洗。脱去己烷以产生琥珀油状的20.6克另外的产物，通过TLC其看上去与第一批相同。在硅胶上定量地对10.1g部分的(R)-N'-(1-叔-丁基-丁-3-烯基)-肼羧酸苄酯进行色谱分析以产生8.88g(色谱的88％产率)澄清、近于白色的油状纯产物。Rf＝0.43(2:1己烷:乙酸乙酯)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.4(5H，br s)，6.2(1H，br s)，6.0(1H，br s)，5.15(2H，s)，5.1(2H，s)，4.1(1H，br)，2.7(1H，m)，2.4(1H，br d)，2.0(1H，m)，0.95(9H，s)；ee＝98.1％，AD-H柱子；[α]25589-42.5°(c2.18，CH3OH)。
化合物5：将(R)-N'-(1-叔-丁基-丁-3-烯基)-肼羧酸苄酯(110g，398毫摩尔)和500mL二氯甲烷加入带有温度计和磁力搅拌器的2L圆底烧瓶中。随后加入K2CO3溶液(82.51g，200mL去离子水中597毫摩尔浓度)，并将烧瓶冷却至大约10℃。然后在20min的一段时间里缓慢加入无水的3,5-二甲基苯甲酰氯(73.82g，437.8毫摩尔)。使用1L的二氯甲烷将残留的酰基氯冲洗进烧瓶并稀释反应混合物。在添加时温度不允许超过15℃。将反应搅拌过夜，首先是在冰浴中然后是在室温下。在大约16小时的TLC分析表明反应完成并含有残留的酰基氯；将混合物一共搅拌大约40小时。将反应混合物倾入2L的分液漏斗。收集有机层并与水层的少量CH2Cl2回流合并。再用10％的K2CO3将有机相冲洗一次，用盐水冲洗，然后在固 体MgSO4/Na2SO4上干燥。将混合物从盐中滤出，并在真空中除去溶剂以获得颗粒状浅米色固体。将粗产物悬浮并在300mL的2:1己烷:醚中搅拌，并用布氏漏斗过滤以基本上除去残留的3,5-二甲基苯甲酰氯。使用合并的总共大约1200mL的2:1己烷:醚将收集的固体冲洗四次，从而提供白色颗粒状固体。将产物收集并允许在空气中干燥以产生144.55g的(R)-N'-(1-叔-丁基-丁-3-烯基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-肼羧酸苄酯，产率＝88.9％。将30g的样品溶解在205mL沸腾的甲醇中并允许在室温下结晶。在布氏漏斗中用50mL CH3OH冲洗所生成的絮凝剂物质以得到22.2g，mp(熔点)＝146℃，(ee>99.9％)。通过将该物质从沸腾的CH3OH重结晶两次而获得(R)-N'-(1-叔-丁基-丁-3-烯基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-肼羧酸苄酯的分析样品，接下来进行Kugelrohr短程蒸馏并收集固体以得到纯的白色物质：mp＝145.5-147℃。Rf＝0.12(10:1己烷:乙酸乙酯)；1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.5-7.2(m，9H，φ+NH)，7.2-6.8(m)，6.4(S)，6.3(S)，5.95(br，5H，苄基+C＝C)，5.4-4.6(m，9H，烯丙基N-CH，φ-CH3)，3.65(br)，2.5(m)，2.35(S)，2.3(S)，1.2-0.8(m，9H，-C(CH3)3)；[α]25589-12.8°(c2.01，CHCl3)。
化合物6将(R)-N'-(1-叔-丁基-丁-3-烯基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-肼羧酸苄酯(13.5g，33毫摩尔)于室温下悬浮在100mL冰醋酸中。将10％碳载钯(0.24g)作为4.4g醋酸中的浆加入。将灰色悬液在10-30psi下于帕尔氢化器上摇动90分钟，并通过TLC监测反应。将催化剂沉降，使用移液管除去反应溶液并通过带凹槽的滤纸(Schleicher & Schuell 5971/2，125mm直径)。将催化剂残留物用醋酸冲洗并将冲洗物通过滤纸以得到合并的总质量为156g的醋酸和产物。将混合物在冰上冷却，并加入大约600mL去离子水。在30分钟的一段时间里，油状产物流出，然后将其结晶。将其用滤纸过滤，在空气中干燥，并在纸上收集以产生7.9g的浅黄色固体。经过几小时，0.52g另外的产物从滤液中沉淀下来，得到总产量为8.42g(92.2％)的(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)酰肼；Rf＝0.5(1:1己烷:乙酸乙酯)；[α]25589+7.63(c1.98，CH3OH)，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.05(1H，s)，7.02(2H，s)，4.6+3.5(1H，2d)，4.1(2H，s，NH2)，2.38+2.37(6H，2s)，1.1-2.1(4H，m)，1.0+0.9(9H，2s)，1.0+0.98 (3H，2t)，2个不同的构象异构体。
化合物7(标题化合物)：将(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)酰肼(35g，126.6毫摩尔)在500mL的圆底烧瓶中使用磁力搅拌溶解在100mL二氯甲烷中。加入K2CO3水溶液(26.25g，189.9毫摩尔，溶解于75mL去离子水)并在冰上搅拌该混合物。加入固体2-乙基-3-甲氧基苯甲酰氯(27.67g，139.3毫摩尔)并用25mL的CH2Cl2将其冲洗进烧瓶。在冰上搅拌该混合物大约40h，允许浴温暖至室温。按需加入另外的二氯甲烷和水以协助操作。将有机层分离并在MgSO4上干燥。加入大约5g活性炭，并通过滤纸过滤除去盐和碳。在真空中将溶剂蒸发，首先在旋转式蒸发器上然后在高真空下，得到57.8g粗产物，其含有痕量的CH2Cl2。首先用3×100mL部分的醚(2％乙醇)，然后用1×100mL部分的1:1己烷:醚在烧结玻璃布氏漏斗(孔尺寸ASTM 40-60C，Pyrex)中研磨该粗制物质。然后用2×200mL去离子水冲洗产物并彻底混合，且允许在空气中干燥。(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼(还被称作(R)-2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼)作为亮白色粉末状固体(36.51g，65.7％产率，经HPLC和手性HPLC相当纯且具非常高的ee，经TLC得到一个斑点，1:1己烷:醚)被收集。对合并的有机冲洗物进行蒸发产出大约20g的物质，首先将其用200mL 2:1己烷:醚研磨，然后再用2×100mL 2:1己烷:醚在烧结玻璃布氏漏斗(孔尺寸ASTM 40-60C)中研磨。将该物质用3×100mL去离子水通过彻底混合而冲洗，并允许在空气中干燥。收集第二次收获的白色粉末(12.98g，23.4％的产率，经HPLC和手性HPLC相当纯且具有高ee)。以相同的方式获得第三次收获的近白色固体(1.52g，2.7％，98％纯度，>99％ee)。通过溶解在温暖的甲醇中并用0.45微米的注射器式滤器过滤至大的结晶皿中而制备最终样品。收集该物质，用铲子将其粉碎，并在真空炉中于50-58℃加热，实际上直至恒定重量。HPLC分析指示99.3％的化学纯度和>99.9％ee Rf＝0.28(1:1己烷:乙酸乙酯)；mp＝162.2-162.8℃；[α]25589+12.9(c2.04，CH3OH)；1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.0-7.1(4H，m)，6.9(1H，d)，6.1-6.4(1H，2d)，4.5-4.7(1H，2d)，3.78(3H，s)，2.3(6H，s)，2.3(1H，m)，1.9(2H，m)，1.55(3H，m)，1.1-1.15(9H， 2s)，0.9-1.0(6H，m)。
使用实施例1中描述的方法学来制备实施例2至29。通过手性HPLC来确定百分比对映体过量(ee)。表2提供实施例2至29的分析数据。
表2：分析数据
实施例30
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N’-(S)-[2-(6-甲氧基-萘-2-基)-丙酰]-酰肼
合成
化合物1：如实施例1中所述制备(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-酰肼。
化合物2：从对应的羧酸制备化合物2。将亚硫酰二氯(1.24g，10.42毫摩尔)在装备有磁力搅拌的圆底烧瓶中加入在8.2mL氯仿中的(S)-(+)-2-(6-甲氧基-萘-2-基)-丙酸(甲氧萘丙酸，2g，8.69毫摩尔)溶液。将一滴DMF加入并将混合物回流3小时。从反应混合物中将氯仿和过剩的亚硫酰二氯蒸馏出来，同时加入二氯甲烷。将残留的溶剂蒸发而产出(S)-2-(6-甲氧基-萘-2-基)-丙酰氯(1.918g，88.8％产率)。Rf＝0.2(1:1己烷:乙醚)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.98(br，1H)，7.78(t，2H)，7.36(d，1H)，7.18(d，1H)，7.14(m，2H)，4.25(q，1H)，3.93(s，3H)，1.68(d，3H)。
化合物3(标题化合物)：将(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-酰肼(e.e估计>99％基于前体，1.1g，3.98毫摩尔)溶解在10mL二氯甲烷中。将K2CO3水溶液(2.5mL中0.907g，6.57毫摩尔)加入反应混合物。加入(S)-2-(6-甲氧基-萘-2-基)-丙酰氯(1.09g，4.38毫摩尔)并将反应搅拌24小时且用TLC监测。按需加入另外的二氯甲烷和水以协助操作。将有机层分离，在Na2SO4上干燥，过滤，并在真空中除去溶剂以提供粗产物：mp＝98℃(玻璃)-123℃。将该粗制物质用2:1己烷:醚研磨三次以提供1.554g，80.1％产率的(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N’-(S)-[2-(6-甲氧基-萘-2-基)-丙酰]-酰肼，mp＝98℃(玻璃)-122℃。将研磨的物质在35℃下从异丙醇结晶以得到结晶产物。所有三批的1H NMR光谱是相同的。Rf＝0.15(1:1己烷:乙醚)；mp＝158-160℃(在150 ℃开始加热)；mp＝156-164℃(在25℃开始加热)；[α]25589+95.8°(c2.02，CH3OH)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.96+9.82(NH，2s)，7.71+7.58(2H，2d)，7.63(1H，s)，7.49+7.31(1H，2d)，7.26(1H，s)，7.13+6.77(1H，2d)，7.06(2H，s)，6.68+6.30(1H，2s)，4.31(m，1H)，3.88+3.85(3H，2s)，3.58(1H，m)，2.30+1.83(6H，2s)，1.64-1.03(4H，mm)，1.00(3H，m)，0.87+0.84(9H，2s)，0.63(3H，t)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ173.9，172.2，157.8，137.3，133.7，130.8，129.1，128.8，127.4，125.9，125.8，123.7，123.3，119.2，119.1，105.5，62.7，55.3，45.1，35.0，28.5，27.6，26.9，21.2，17.5，14.2；HRMS(ESI)m/z计算得到C31H39N2O3[M-H]-487.2966，实测487.2949，计算得到C31H40ClN2O3[M+Cl]-523.2733，实测523.2718，分析计算得到C31H40N2O3:C，76.19；H，8.25；N，5.73；O，9.8；实测：C，76.01；H，8.35；N，5.70。
为了确定实施例1中不对称烯丙基化反应的立体化学过程，确定了(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N’-(S)-[2-(6-甲氧基-萘-2-基)-丙酰]-酰肼的X-射线晶体结构。该实验确定，含有叔丁基和n-丙基的碳的绝对构型是R。
实施例31
(S)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N’-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼
合成
化合物1：如实施例1中所述制备(E)-N’-(2,2-二甲基-亚丙基)-肼羧酸苄酯。
化合物2：使用实施例1中所述的方法学用R,R-假麻黄碱制备(R,R)-2-烯丙基-2-氯代-3,4-二甲基-5-苯基-[1,3,2]oxazasilolidine。
化合物3：使用实施例1中所述的方法学制备(S)-N’-(1-叔-丁基-丁-3-烯基)-肼羧酸苄酯。分析数据：Rf＝0.46(2:1己烷:乙酸乙酯)；mp＝69-71℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.4(br s，5H)，6.2(br s，1H)，6.0(br s，1H)，5.15(s，2H)，5.1(s，2H)，4.1(br，1H)，2.7(m，1H)，2.4(br d，1H)，2.0(m，1H)，0.95(s，9H)；ee＝98.2％，ADH柱子；[α]25589+39.3°(c＝2.03，CHCl3)。
化合物4：使用实施例1中所述的方法学制备(S)-N’-(1-叔-丁基-丁-3-烯基)-N’-(3,5-二甲基-苯甲酰)肼羧酸苄酯。分析数据：Rf＝0.43(2:1己烷:乙酸乙酯)；mp＝150-151.5℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.45-6.88(m，7H)，6.44+6.28(2s，1H)，5.96(br，1H)，5.38-4.68(m，5H)， 3.69(br，1H)，2.68-2.43(m，2H)，2.36+2.29(2s，6H)，1.13+1.02+0.94(3s，9H)；[α]25589+12.5°(c＝2.01，CHCl3)。
化合物5：使用实施例1中所述的方法学制备(S)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-酰肼。分析数据：Rf＝0.5(1:1己烷:乙酸乙酯)；mp＝112-112.8℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.05(s，1H)，7.02(s，2H)，4.6+3.5(2d，1H)，2.38+2.37(2s，6H)，1.2-2.1(m，4H)，1.1+1.0(2s，9H)，1.05+0.98(2t，3H)2个不同的构象异构体；[α]25589-7.97(c2.14，CH3OH)。
化合物6(标题化合物)：使用实施例1中所述的方法学制备(S)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N’-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)酰肼。分析数据：Rf＝0.28(1:1己烷:乙酸乙酯)；mp＝156.5-157.5℃；[α]25589-13.39°(c2.05，CH3OH)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.4+10.26(s，1H)，7.18-7.14(m，3H)，7.08(d，J＝7.2Hz，1H)，7.03(t，J＝8.4Hz，1H)，6.34+6.21(d，J＝6.8Hz，1H)，4.57+4.38(d，J＝8.4Hz，1H)，3.78(s，3H)，2.29(s，6H)，2.27-2.23(m，1H)，1.89-1.79(m，2H)，1.59-1.38(m，3H)，1.09+1.06(s，9H)，0.95+0.87(t，J＝6.8Hz，6H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ173.40，168.24，157.64，137.18，136.98，136.50，130.89，130.73，130.20，126.96，125.28，124.83，119.37，118.95，112.41，62.29，56.11，35.45，28.71，27.56，21.24，20.15，15.15，14.68；HRMS(ESI)m/z，计算得到C27H39N2O3[M+H]+439.2955，实测439.295，计算得到C27H38NaN2O3[M+Na]+461.2774，实测461.2765；分析计算得到C27H38N2O3:C，73.94；H，8.73；N，6.39；O，10.94。实测：C，73.87；H，8.94；N，6.38；ee：>99.9％；Regis(S,S)ULMO，98:2己烷:甲醇的混合物，流速1mL/min。
使用实施例31中所述的方法学制备实施例32至47。通过手性HPLC来确定百分比对映体过量(ee)。
实施例48
(S)-N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-肼羧酸叔丁酯
合成
化合物1：肼基甲酸t-丁酯是商业上可得的。
化合物2：将吡呋醛(52.1g，454毫摩尔，在t-丁醇中大约75％的溶液)在带有回流冷凝器、温度计和添加漏斗的1L、3颈圆底烧瓶中溶解在120mL甲醇中。将冰醋酸(1mL)加入，然后在控制下加入肼基甲酸t-丁酯(50g，378毫摩尔)，且不除去反应的热量。将混合物搅拌4小时，同时通过TLC检测。反应完成时，在真空中除去溶剂，在戊烷中吸收残留物，并将戊烷蒸发掉。所得的油在静置后结晶以得到N'-(2,2-二甲基-亚丙基)-肼羧酸叔丁酯(75.7g，93％)。Rf＝0.42(2:1己烷:乙酸乙酯，1％醋酸)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.6(br s，1H)，7.1(s，1H)，1.5(s，9H)，1.1(s，9H)ppm。
化合物3：使用实施例1中所述的方法学用R,R-假麻黄碱制备(R,R)-2-烯丙基-2-氯代-3,4-二甲基-5-苯基-[1,3,2]oxazasilolidine。
化合物4：将N’-(2,2-二甲基-亚丙基)-肼羧酸叔丁酯(12g，59.9毫摩 尔)装入干燥的带有温度计、磁力搅拌器和氮气氛的3颈、1L圆底烧瓶。使用导管将无水二氯甲烷(200mL)充入烧瓶。使用冰浴将混合物冷却到0℃。随后在惰性条件下将(R,R)-2-烯丙基-2-氯代-3,4-二甲基-5-苯基-[1,3,2]oxazasilolidine(24.07g，89.87毫摩尔)加入烧瓶。在几分钟内，原来浅黄色的溶液转变为透明的暗黄色。在0℃下将反应搅拌6小时，然后允许其温暖至室温并搅拌过夜，同时使用TLC监测。通过加入大约25mL甲醇来将反应猝灭，导致颜色减轻。将溶液浓缩并用100mL乙酸乙酯和100mL水稀释残留物。将各相分离，并用乙酸乙酯萃取水层两次。将有机相合并，用盐水冲洗，在Na2SO4上干燥并浓缩。通过柱色谱使用己烷中的10％乙酸乙酯将所得油纯化。获得油状的纯化的(S)-N'-(1-叔-丁基-丁-3-烯基)-肼羧酸叔丁酯(2.87g，24.4％产率)。还收集到不纯的馏分(3.17g)。Rf＝0.44(5:1己烷:乙酸乙酯，I2成像)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.07(br，1H，NH)，5.85(m，1H)，5.0(dd，2H)，2.6(m，1H)，2.33(m，1H)，2.3(m，1H)，1.4(s，9H)，0.9(s，9H)。
化合物5：将(S)-N'-(1-叔-丁基-丁-3-烯基)-肼羧酸叔丁酯(2.34g，9.65毫摩尔)在帕尔瓶中溶解于甲醇(50mL)。将10％的Pd/C(70mg)加入水(1.6mL)中形成浆状，并在起始压力为55psi的帕尔氢化器上将混合物摇动4.5h。作为反应进度的量度监测压力的降低，指示在30分钟后反应可能完成。允许催化剂基本沉降，并用移液管除去上清液，通过0.45微米的注射器式滤器，并用TLC分析。在真空中除去溶剂以产生2.19g(92.7％)的淡苍黄色油状(S)-N'-(1-叔-丁基-丁基)-肼羧酸叔丁酯。Rf＝0.48(5:1己烷:乙酸乙酯，I2成像)，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.0(br，1H)，4.0(br，1H)，2.5(d，1H)，1.5(s，9H)，1.1(m，2H)，1.6(br，2H)，0.94(s，9H)，0.94(t，3H)。
化合物6(标题化合物)：将(S)-N'-(1-叔-丁基-丁基)-肼羧酸叔丁酯(1g，4.09毫摩尔)在带有磁力搅拌棒的管形瓶中溶于大约3mL二氯甲烷。加入溶解在大约2mL水中的0.8g的K2CO3(5.79毫摩尔)的溶液，接着是0.81g(4.80毫摩尔)的3,5-二甲基苯甲酰氯。将反应搅拌过夜，第一次在冰上，然后使之温暖至室温。然后将水和二氯甲烷各几mL加入以溶 解所有固体。将水层除去并在固体MgSO4上将有机层干燥。TLC指示反应大约95％完成。将混合物滤过一些玻璃棉进入管形瓶。使用N2蒸汽将溶剂蒸发，用3:1己烷:醚和戊烷进行追踪。将残留物用铲操作以使结晶开始，并在完全固体化之后用2-3mL戊烷在小烧结玻璃漏斗中将其研磨三次。在空气中干燥之后，得到300mg(19.5％)的(S)-N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-肼羧酸叔丁酯，其经TLC指示为相当纯，手性HPLC表明e.e＝93.3％。在真空炉中于50℃下将产物干燥以确定熔点。Rf＝0.42(4:1己烷:乙酸乙酯，UV(强)，I2(弱)成像)；mp＝115.5-117.5℃；[α]25589-30.18(c2.02，CH3OH)，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.15-7.03(m，3H)，6.07+6.00(s+d，1H)，4.52+4.40(2dd，1H)，2.32+2.28+2.23(3s，6H)，1.85-0.89(m，25H)。
实施例49
(R)-N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-肼羧酸叔丁酯
化合物1：如实施例1中所述制备(R)-N'3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁-3-烯基)-酰肼。
化合物2(标题化合物)：向(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)- 酰肼(400mg，1.44毫摩尔)的THF(10mL)溶液中加入t-boc酸酐(629mg，2.88毫摩尔)。将反应回流40h，冷却，用醚(20mL)稀释，用H2O冲洗并在无水Na2SO4上干燥。将溶剂在真空中蒸发并将残留物经快速色谱和薄层色谱进行纯化以得到白色固体(R)-N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-肼羧酸叔丁酯(45.7mg，产率4.1％)。Rf＝0.39(1:3EtOAc:n-己烷)；[α]25589+26.25(c2.09，CH3OH)，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.15-7.03(m，3H)，6.07+6.00(2d，1H)，4.59+4.50(2dd，1H)，2.37+2.34(2s，6H)，1.85-0.89(m，25H)ppm；HRMS(ESI)m/z计算得到C22H37N2O3[M+H]+377.2804，实测377.2795，计算得到C22H36N2NaO3[M+Na]+399.2624，实测399.2618。
实施例50
(R)-3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁-3-烯基)-N'-((S)-3,3,3-三氟-2-甲氧基-2-苯基-丙酰)-酰肼
合成
化合物1：使用US 2005/0209283 A1中所述的方法学来制备3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸酰肼。
化合物2：将吡呋醛(13.45g，156毫摩尔)在圆底烧瓶中溶解于300mL甲醇。加入3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸酰肼(26.6g,147.6毫摩尔)和150滴冰醋酸，并将混合物回流加热大约8小时，同时通过TLC监测。反应完成时，在真空中除去溶剂，并将产物在冷己烷中弄成浆，且在布氏漏斗上过滤以产生24.4g(66％)的3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸(2,2-二甲基-亚丙基)-酰肼。Rf＝0.19，(2:1己烷:乙酸乙酯)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.42+7.41(3s，1H)，7.1(t，1H)，6.9(d，1H)，6.82(d，1H)，3.78(s，3H)，2.2+2.1(2s，3H)，1.07+1.0(3s，9H)，多种构象，可能为E/Z混合物。
化合物3：如实施例1中所述制备(S,S)-2-烯丙基-2-氯代-3,4-二甲基-5-苯基-[1,3,2]oxazasilolidine。
化合物4：将3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸(2,2-二甲基-亚丙基)-酰肼(10.84g，43.31毫摩尔)充入被保持在氮气氛中的干燥的1L圆底烧瓶。通过导管加入350mL无水二氯甲烷。在冰浴上将烧瓶冷却至约5℃。通过注射器加入(S,S)-2-烯丙基-2-氯代-3,4-二甲基-5-苯基-[1,3,2]oxazasilolidine。在几分钟内，原来浅色的混合物转变为透明的暗黄色，并且在大约5℃下于氮气中任其搅拌。4小时后，TLC指示反应完成。通过加入大约25mL甲醇并 缓慢混合将反应猝灭。暗色消散。将溶液浓缩并用乙酸乙酯(100mL)和水(100mL)稀释残留物。将各相分离并用乙酸乙酯(2×100mL)萃取水层。用盐水将合并的有机相冲洗一次，在MgSO4上干燥，倾析，并浓缩以产生深黄色油，其静置后结晶(13.66g，72.4％产率)。将粗制物质从4:1己烷:乙酸乙酯中结晶，同时从不溶的粉末残留物中分离，所述残留物可能是假麻黄碱。在结晶一次之后，纯化的物质显示大约80％的e.e，偏好R-同分异构体，如Mosher分析所确定。在三次结晶后，回收6.65g的结晶固体(R)-3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁-3-烯基)酰肼(35.2％)，但是ee没有进一步提高。Rf＝0.38(2:1己烷:乙酸乙酯)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.22(t，1H)，7.11(br s，1H)，6.95(d，1H)，6.15(m，1H)，5.2(d，1H)，5.15(d，1H)，3.89(s，3H)，2.80(d，1H)，2.50(dm，1H)，2.33(s，3H)，2.2(dt，1H)，1.08(s，9H)。
化合物5(标题化合物)：将(R)-3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁-3-烯基)酰肼(100mg，0.344毫摩尔)和(R)-(+)-α-甲基-α-(三氟甲基)-苯乙酰氯(104mg，0.413毫摩尔)在管形瓶中溶解于1.5mL二氯甲烷。加入在大约0.5mL水中的K2CO3(95mg，0.69毫摩尔)溶液，并将反应混合物在室温下过夜搅拌，并用TLC监测。将各相分离，按需加入另外的二氯甲烷和/或水以协助操作。在MgSO4或Na2SO4上将二氯甲烷层干燥，并在真空中除去溶剂以得到油状固体粗产物。用己烷/醚将该残留物研磨，于是开始结晶。在没有进一步扰动的情况下允许结晶发生。从母液的分离提供了83mg(16.4％)的(R)-3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁-3-烯基)-N'-((S)-3,3,3-三氟-2-甲氧基-2-苯基-丙酰)-酰肼结晶，并从中获得X-射线晶体结构。Mp＝128-129℃；[α]25589+66.4°(c2.00，CH3OH)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.5(d，2H)，7.2-7.3(m，4H)，7.07(m，1H)，6.9(d，1H)，6.6+6.2(br，1H)，5.2(d，1H)，5.1(d，1H)，4.8(1H，br)，3.85(s，3H)，3.8(s，3H)，2.55(br，1H)，2.35(br，2H)，1.5(3H)，1.05(br s，9H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ168.1，158.3，138.7，134.0，129.4，128.0，126.5，126.4，126.3，124.9，122.1，118.0，117.0，112.2，57.3，55.7，35.8，32.0，28.1，12.3；HRMS(ESI)m/z计算得到C27H34F3N2O4[M+H]+507.2471，实测507.2463，m/z计算得到 C27H33F3N2NaO4[M+Na]+529.2290，实测529.2284。分析计算得到C27H33F3N2O4：C，64.02；H，6.57；F，11.25；N，5.53；O，12.63。实测：C，63.87；H，6.71；N，5.52。
为了确定实施例50中不对称烯丙基化反应的立体化学过程，确定了(R)-3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁-3-烯基)-N'-((S)-3,3,3-三氟-2-甲氧基-2-苯基-丙酰)-酰肼的X-射线晶体结构。该实验确定，含有叔丁基和n-丙基的碳的绝对构型是R。
实施例51
(R)-3,5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰)-酰肼
合成
化合物1：如实施例50中所述制备(R)-3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸N'-(1- 叔-丁基-丁-3-烯基)酰肼。
化合物2：将(R)-3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁-3-烯基)酰肼(3.05g，10.5毫摩尔)溶于100mL甲醇。将碳载钯(1％，240mg)小心地加入，并将混合物在起始压力为55psi的帕尔氢化器上摇动2.5小时。作为反应进度的量度监测压力的降低；1.5小时后，氢吸收停止。将混合物滤过一片硅藻土(Celite)，并在真空中除去溶剂。使用几种溶剂的TLC分析在区分两个酰肼斑点方面非常不成功，虽然3:1己烷:乙酸乙酯(Rf＝0.28)或多或少地成功了。从2:1戊烷:己烷中将粗产物结晶两次以得到>0.6g的(R)-3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)酰肼。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.05(t，1H)，6.79(d，1H)，6.76(d，1H)，3.7(s，3H)，2.37(m，1H)，2.12(s，3H)，1.7-1.1(m，4H)，0.90(s，9H)，0.82(t，3H)。
化合物3(标题化合物)：将(R)-3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)酰肼(100mg，0.34毫摩尔)和3,5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰氯(90mg，0.41毫摩尔)溶解于1mL的二氯甲烷。加入1.5当量的大约25％的K2CO3，并将反应混合物在室温下搅拌且通过TLC监测。完成后，将各相分离，按需加入另外的CH2Cl2和/或水以协助操作。将CH2Cl2相在MgSO4或Na2SO4上干燥，在真空中除去溶剂以得到油状固体。将此用1:1己烷:醚研磨，并允许在空气中干燥以产出(R)-3,5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰)-酰肼。Rf＝0.29(2:1己烷:乙酸乙酯)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.1(t，1H)，7.0(s，NH 1H)，6.9(d，1H)，6.7(s，2H)，6.3(d，1H)，4.78(m，1H)，3.95(s，3H)，3.85(2s，6H)，2.2(s，3H)，2.05(m，1H)，1.95(s，3H)，1.8(m，1H)，1.6(m，2H)，1.2+1.1+1.05(3s，9H)，1.05(m，3H)；HRMS(ESI)m/z计算得到C27H39N2O5[M+H]+471.2859，实测471.2850，计算得到C27H38NaN2O5[M+Na]+493.2670，实测493.2678。
实施例52
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-环己基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼
合成
化合物1：肼基甲酸苄酯是商业上可得的。
化合物2：将肼基甲酸苄酯(25g，150.44毫摩尔)在装备有磁力搅拌的圆底烧瓶中于氮气氛中溶解于200mL乙醇。将环己烷甲醛(17.7g，158毫摩尔)和乙酸(1mL)加入溶液并将混合物在室温下搅拌8h。将所得的固体沉淀过滤，用己烷冲洗，从乙酸乙酯中结晶，并在开放的实验台 上过夜干燥以得到28.87g(73.7％产率)的白色晶体N'-环己亚甲基-肼羧酸苄酯。Rf＝0.67(1:3己烷:乙酸乙酯)，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.8(1H，br s)，7.4(5H，m)，7.1(1H，br s)，5.3(2H，s)，2.4(1H，m)，1.7-1.9(4H，m)，1.3(6H，m)；HRMS(ESI)m/z计算得到C15H21N2O2[M+H]+261.1603，实测261.1592，计算得到C15H20NaN2O2[M+Na]+283.1426，实测283.1417。
化合物3：如实施例1中所述制备(S,S)-2-烯丙基-2-氯代-3,4-二甲基-5-苯基-[1,3,2]oxazasilolidine。
化合物4：将在75mL无水CHCl3中的5g(19.21毫摩尔)的N'-环己亚甲基-肼羧酸苄酯充入带有磁力搅拌器和N2气氛的圆底烧瓶中。将混合物冷却到0℃，并用注射器将(S,S)-oxazasilolidine(5.66g，21.1毫摩尔)加入溶液。在大约30分钟后移除冰浴，并将反应在室温下过夜搅拌。用Na2CO3水溶液将反应猝灭。除去有机层，并用CHCl3萃取水相。将合并的有机相用水反向冲洗几次，在无水Na2SO4上干燥，并使用旋转式蒸发器除去溶剂。通过柱色谱将所得的粗产物纯化以提供2.31g、产率为39.8％的浅黄色粘稠油状(R)-N'-(1-环己基-丁-3-烯基)-肼羧酸苄酯。Rf＝0.41(3:1己烷:乙酸乙酯)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.4(5H，m)，6.3(1H，br)，5.9(1H，br s)，5.25(2H，s)，5.2(2H，br s)，2.95(1H，br s)，2.35(1H，br d)，2.17(1H，br m)，1.8(2H，br m)，1.75(2H，br d)，1.55(1H，br t)，1.0-1.4(6H，m)ppm；HRMS(ESI)m/z计算得到C18H27N2O2[M+H]+303.2072，实测303.2079，计算得到C18H26NaN2O2[M+Na]+325.1892，实测325.1899。
化合物5：将R-N'-(1-环己基-丁-3-烯基)-肼羧酸苄酯(2.20g，7.27毫摩尔)在带有磁力搅拌器的管形瓶中溶于2mL二氯甲烷。将K2CO3水溶液(4mL中1.51g，10.91毫摩尔)加入，并将混合物在冰上冷却。将无水酰基氯缓慢地加入，并使用大约1mL二氯甲烷追踪并冲洗。将混合物过夜搅拌，首先在冰上然后在室温下，同时用TLC监测。将水和/或CH2Cl2加入反应混合物以协助操作，并收集有机层。用CH2Cl2将水层萃取一次，并将有机层合并而且在固体Na2SO4上干燥。在真空中除去溶剂，并用2:1 己烷:醚研磨残留物以产出2.93g(92.7％)的白色固体(R)-N'-(1-环己基-丁-3-烯基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)肼羧酸苄酯。Rf＝0.33(3:1己烷:乙酸乙酯)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.8+9.65(0.5H，NH，2s)，7.1-7.5(3.5H，m)，6.9-7.1(5H，m)，6.05(0.5H，m)，5.9(0.5H，m)，5.2(1H，m)，5.0(2H，m)，4.8(1H，m)，4.35(1H，m)，2.35(2H，br m)，2.25(6H，s)，0.8-2.0(11H，m)；HMS(ESI)m/z计算得到C27H35N2O3[M+H]+435.2647，实测435.2659，计算得到C27H34NaN2O3[M+Na]+457.2467，实测457.2470。
化合物6：将(R)-N'-(1-环己基-丁-3-烯基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)肼羧酸苄酯(2.91g，6.7毫摩尔)悬浮在大约50mL冰醋酸中。将102mg的10％的碳载钯加入几mL冰醋酸中成为浆。用醋酸将混合物稀释至75mL，并在20-30psi下于帕尔氢化器上摇动90分钟。将悬液静置两天以允许碳沉淀出来。将上清液滤过0.45微米的注射器式滤器进入结晶皿，并将溶剂蒸发以留下2.06g(102％的质量平衡)的赤褐色粘稠油状(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-环己基-丁基)-酰肼。Rf＝0.24(2:1己烷:乙酸乙酯)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.05(1H，s)，7.0(2H，s)，4.55+3.35(1H，2t)，2.4(6H，s)，0.8-1.9(15H，m)，0.9(3H，t)；HRMS(ESI)m/z计算得到C19H31N2O[M+H]+303.2436，实测303.2441，计算得到C19H30N2NaO[M+Na]+325.2256，实测325.2262。
化合物7(标题化合物)：将(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-环己基-丁基)-酰肼(0.14g，0.46毫摩尔)在带有磁力搅拌器的管形瓶中溶于1mL的二氯甲烷。将K2CO3水溶液(0.1g，0.69毫摩尔，2.77mL)加入。将烧瓶在冰上冷却，并将无水酰基氯加入。使用大约0.8mL另外的二氯甲烷追踪并冲洗。将混合物过夜搅拌，首先在冰上然后在室温下，同时用TLC监测反应。将水和CH2Cl2加入反应混合物以协助操作，并用CH2Cl2将水层萃取一次。将有机层合并而且在固体Na2SO4上干燥。在真空中除去溶剂，并用层析法纯化粗产物以产出143mg(67.9％产率)的赤褐色粘稠油状(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-环己基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.4(1H，2s)，7.0-7.25(5H，m)， 6.2(1H，m)，4.45(1H，m)，3.8(3H，s)，2.35(6H，s)，2.0-2.2(2H，m)，0.9-2.0(15H，m)，0.9(6H，m)。
使用实施例52中所述的方法学制备实施例53至55。通过手性HPLC确定百分比对映体过量(ee)。
实施例56
(S)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-环己基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰 肼
合成
化合物1：如实施例52中所述制备N'-环己亚甲基-肼羧酸苄酯。
化合物2：使用实施例1中所述的方法学用R,R-假麻黄碱制备(R,R)-2-烯丙基-2-氯代-3,4-二甲基-5-苯基-[1,3,2]oxazasilolidine。
化合物3：使用实施例52中所述的方法学以69％的产率制备淡黄色粘稠油状(S)-N'-(1-环己基-丁-3-烯基)-肼羧酸苄酯。分析数据：Rf＝0.41(3:1己烷:乙酸乙酯)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.65(1H，br s)，7.4(5H，m)，5.85(1H，br)，5.1(4H，m)，4.2(1H，s)，2.7(1H，br s)，2.1(1H，br m)，2.0(1H，br m)，1.8(2H，br m)，1.65(2H，br m)，1.45(1H，br m)1.0-1.2(6H，br m)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.4(5H，m)，6.3(1H，br)，5.9(1H，br s)，5.25(2H，s)，5.2(2H，br s)，2.95(1H，br s)，2.35(1H，br d)，2.17(1H，br m)，1.8(2H，br m)， 1.75(2H，br d)，1.55(1H，br t)，1.0-1.4(6H，m)；HRMS(ESI)m/z计算得到C18H27N2O2[M+H]+303.2072，实测303.2057，计算得到C18H26NaN2O2[M+Na]+325.1892，实测325.1873。
化合物4：使用实施例52中所述的方法学以84.8％的产率制备白色固体(S)-N'-(1-环己基-丁-3-烯基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-肼羧酸苄酯。分析数据：ee≥80％。Rf＝0.34(3:1己烷:乙酸乙酯)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.8+9.65(0.5H，NH，2s)，7.1-7.5(3.5H，m)，6.9-7.1(5H，m)，6.05(0.5H，m)，5.9(0.5H，m)，5.2(1H，m)，5.0(2H，m)，4.8(1H，m)，4.35(1H，m)，2.35(2H，br m)，2.25(6H，s)，0.8-2.0(11H，m)；HRMS(ESI)m/z计算得到C27H35N2O3[M+H]+435.2647，实测435.2655，计算得到C27H34NaN2O3[M+Na]+457.2467，实测457.2469。
化合物5：使用实施例52中所述的方法学制备(S)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-环己基-丁基)-酰肼。分析数据：Rf＝0.24(2:1己烷:乙酸乙酯)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.05+6.95(1H，s)，7.0+6.85(2H，2s)，4.55+4.05(2H，2s)，4.3+3.15(1H，2t)，2.3(6H，2s)，0.6-1.9(15H，m)，0.9+0.8(3H，2t)；(400MHz，CDCl3)δ7.05(1H，s)，7.0(2H，s)，4.55+3.35(1H，2t)，2.4(6H，s)，0.8-1.9(15H，m)，0.9(3H，t)；HRMS(ESI)m/z计算得到C19H31N2O[M+H]+303.2436，实测303.2440，计算得到C19H30N2NaO[M+Na]+325.2256，实测325.2260。
化合物6(标题化合物)：使用实施例52中所述的方法学以37％的ee制备(S)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-环己基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼。
使用实施例56中所述的方法学制备实施例57至59。通过手性HPLC确定百分比对映体过量(ee)。表3提供实施例57至59的分析数据。
表3：分析数据
实施例60
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-环己基-丁-3-烯基)-N'-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰)-酰肼
化合物1：如实施例50中所述制备3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸酰肼。
化合物2：将10.0g(55.5毫摩尔)的3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸酰肼溶解在200mL的无水乙醇中。加入环己烷甲醛(6.85g，61.0毫摩尔)和冰醋酸(3mL)，并将反应混合物搅拌18h，同时用TLC监测。经过滤收集沉淀物，并用己烷冲洗。获得白色固体产物3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸环己亚甲基-酰肼(9.36g，产率61％)：Rf＝0.20(3:1EtOAc:n-己烷)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ11.17(s，1H)，7.91(s，1H)，7.50(d，J＝4.8Hz，1H)，7.25(t，J＝6.4Hz，1H)，6.99(t，J＝5.6Hz，1H)，3.89(s，3H)，2.28(s，3H)，1.92-1.62(m，5H)，1.38-1.14(m，6H)；HRMS(ESI)m/z计算得到C16H23N2O2[M+H]+275.1760，实测275.1752，计算得到 C16H22N2NaO2[M+Na]+297.1579，实测297.1568。
化合物3：使用实施例1中所述制备(S,S)-2-烯丙基-2-氯代-3,4-二甲基-5-苯基-[1,3,2]oxazasilolidine。
化合物4：向带有搅拌器和氮气入口的圆底烧瓶中加入3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸环己亚甲基-酰肼(2.8g，10.2毫摩尔)和干燥的CHCl3(50mL)。逐滴加入(S,S)-oxazasilolidine(3.28g，12.20毫摩尔)。将反应在50℃下搅拌6h，然后在室温下18h。加入饱和的NaHCO3溶液(30mL)以将反应猝灭。将CHCl3层分离并用CHCl3(2×30mL)萃取水层。将CHCl3溶液合并，且在无水Na2SO4上干燥。将溶剂在真空中蒸发，并用快速色谱将粗制混合物纯化以获得白色固体(R)-3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸N'-(1-环己基-丁-3-烯基)酰肼(1.74g，54％产率)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.69(s，1H)，7.24(t，J＝8.0Hz，1H)，7.05(d，J＝8.0Hz，1H)，6.88(d，J＝7.6Hz，1H)，5.92(m，1H)，5.15(dd，J＝1.6，17.2Hz，1H)，5.08(dd，J＝1.6，10.4Hz，1H)，4.91(dd，J＝3.6，6.8Hz，1H)，3.83(s，3H)，2.75(m，1H)，2.26-2.22(m，1H)，2.16(s，3H)，2.14-2.08(m，1H)，1.81-1.08(m，11H)；HRMS(ESI)m/z计算得到C19H29N2O2[M+H]+317.2229，实测317.2221，m/z计算得到C19H29N2O2[M+Na]+C19H28N2NaO2339.2048，实测339.2037。
化合物5(标题化合物)：向(R)-3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸N'-(1-环己基-丁-3-烯基)酰肼(1.3g，4.11毫摩尔)的CH2Cl2(5mL)溶液中加入K2CO3(2.27g，16.44毫摩尔)、H2O(5mL)以及最后3,5-二甲基苯甲酰氯(727mg，4.31毫摩尔)。将反应在室温下搅拌24h。加入另外的CH2Cl2和H2O以协助操作，将CH2Cl2层分离，并用CH2Cl2萃取水层。将CH2Cl2溶液合并，而且在无水Na2SO4上干燥。将溶剂在真空中蒸发并用快速色谱纯化残留物以得到白色固体(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-环己基-丁-3-烯基)-N'-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰)-酰肼(1.45g，78％产率)。Rf＝0.21(3:1EtOAc:n-己烷)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.47+10.39(2s，1H)，7.20-7.01(m，5H)，6.37(d，J＝7.2Hz，1H)，6.22-5.89(m，1H)，5.18(dd，1H)，5.02(dd，1H)，4.46(m，1H)，3.79(s，3H)，2.44-2.34(m， 2H)，2.29(s，3H)，2.02-1.53(m，8H)，1.26-1.02(m，3H)；HRMS(ESI)m/z计算得到C28H37N2O3[M+H]+449.2804，实测449.2793，计算得到C28H36N2NaO3[M+Na]+471.2624，实测471.2615。
实施例61
(R)-4-甲氧基-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-环己基-丁-3-烯基)-N'-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰)-酰肼
合成
使用实施例60中所述的方法学以71％的产率制备(R)-4-甲氧基-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-环己基-丁-3-烯基)-N'-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰)-酰肼。分析数据：Rf＝0.14(1:3EtOAc:n-己烷)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.46+10.38(2s，1H)，7.21-6.42(m，5H)，6.16-5.93(m，1H)，5.23(dd，1H)，5.01(dd，1H)，4.45(m，1H)，3.79(s，3H)，3.77(s，6H)，2.42-2.28(m，2H)，2.04(s，3H)，1.88-1.05(m，14H)；HRMS(ESI)m/z计算得到C29H38N2O5[M+H]+495.2859，实测495.2848，计算得到C29H38N2NaO5[M+Na]+517.2678，实测517.2667。
实施例62
(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N'-(4-乙基-苯甲酰)-N-(1-苯乙基-丁-3-烯基)-酰肼
合成
化合物1：4-乙基-苯甲酸酰肼是商业上可得的。
化合物2：将4-乙基-苯甲酸酰肼(10g，60.9毫摩尔)溶于32mL甲醇。加入醋酸(1mL)，将混合物至回流，并且然后缓慢加入氢化肉桂醛(5.77g，67毫摩尔)。将反应混合物回流10h并用TLC监测。通过过滤收集沉淀物并用己烷冲洗。获得白色固体4-乙基-苯甲酸(3-苯基-亚丙基)-酰肼(9.34g，54.7％产率)。Rf＝0.36(1:1EtOAc:n-己烷)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.87(s，1H)，7.72-7.24(m，10H)，2.87(t，J＝15.2Hz， 2H)，2.79-2.57(m，4H)，1.24(t，J＝8Hz，3H)。
化合物3：将(R)-(+)-甲基ρ-甲苯基亚砜(0.5g，3.21毫摩尔)和四丁基三苯基二氟代硅酸铵(TBAT)(0.12g，0.214毫摩尔)在氮气中和磁力搅拌下溶解在0.038mL的2-甲基-2-丁烯和2.4mL无水二氯甲烷中。将烯丙基三氯硅烷(0.23mL，1.61毫摩尔)在-78℃加入，并将反应搅拌15分钟。将4-乙基-苯甲酸(1-甲基-3-苯基-亚丙基)酰肼(0.3g，1.07毫摩尔)溶解在11.6mL的无水二氯甲烷中并在30分钟的时间段里加入反应。将反应混合物在氮气中搅拌5小时并维持在-78℃至-70℃，且用TLC监测。用1.5mL三乙胺和3mL无水甲醇在-78℃将反应猝灭。然后加入盐水并允许混合物温暖至室温。除去有机层，与三种二氯甲烷萃取物合并，而且在硫酸钠上干燥。将溶剂蒸发，并通过快速色谱用不连续梯度的2:1和1:1戊烷:乙酸乙酯将粗制混合物纯化。获得澄清油状的纯化的(R)-4-乙基-苯甲酸N’-(1-苯乙基-丁-3-烯基)-酰肼(0.145g，41.4％产率，在Chiralcel ADH上通过手性HPLC得到57.6％ee)。Rf＝0.50(1:1EtOAc:n-己烷)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.64-7.13(m，9H)，5.91(m，1H)，5.15(t，J＝28.0Hz，2H)，3.12(m，1H)，2.76-2.63(m，4H)，2.38-2.24(m，2H)，1.88-1.74(m，2H)，1.23(t，J＝8.0Hz，3H)。
化合物4(标题化合物)：将(R)-4-乙基-苯甲酸N’-(1-苯乙基-丁-3-烯基)-酰肼(0.1g，0.31毫摩尔)经磁力搅拌溶解于0.47mL二氯甲烷。将0.7mL去离子水中的碳酸氢钾(0.064g，0.37毫摩尔)以及3,5-二甲基苯甲酰氯(0.063g，0.37毫摩尔)加入混合物。首先将反应混合物在冰上搅拌，然后允许其经过周末温暖至室温，同时用TLC监测。将有机层除去并将水层用二氯甲烷萃取三次且在硫酸钠上干燥。将溶剂蒸发，并用快速色谱将粗制混合物纯化，其使用2:1己烷:乙酸乙酯作为洗脱液。获得黄色油状的纯化的(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(4-乙基-苯甲酰)-N-(1-苯乙基-丁-3-烯基)-酰肼(0.102g，产率72.9％，在Chiralcel ADH上通过手性HPLC得到51.2％ee)。Rf＝0.34(2:1己烷:EtOAc)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.8-7.02(m，12H)，5.99(br，1H)，5.22(d，J＝24.0Hz，2H)，2.73(d，J＝8Hz，2H)，2.31(s，6H)，2.12-2.03(m，2H)，1.87(s，1H)，1.61(s， 2H)，1.29(t，J＝8.0Hz，3H)；HRMS(ESI)m/z计算得到C30H35N2O2[M+H]+455.2699，实测455.2685，计算得到C30H34N2NaO2[M+Na]+477.2518，实测477.2505。
实施例63
(S)-N'-(1-叔-丁基-4-羟基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-肼羧酸苄酯
合成
化合物1：如实施例31中所述制备化合物1。
化合物2(标题化合物)：在0℃下向(S)-N'-(1-叔-丁基-丁-3-烯基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-肼羧酸苄酯(200mg，0.49毫摩尔)的THF(3mL)溶液中加入硼烷二甲基硫化物(THF中2M，125μL，0.25毫摩尔)。将混合物在室温下搅拌16h。在真空中除去过量的硼烷和THF，并加入另外的THF(3mL)，之后是H2O2(61微升，0.54毫摩尔)和3N NaOH(90微升，0.27毫摩尔)。在50-55℃下搅拌1h之后，加入更多水，用醚萃取混合物，在无水Na2SO4上将醚层干燥。在真空中除去溶剂并通过快速色谱将残留物纯化以得到白色固体(S)-N'-(1-叔-丁基-4-羟基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-肼羧酸苄酯(128mg，产率61％)。Rf＝0.30(1:1EtOAc:n- 己烷)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.71+9.63(2s，1H)，7.44-6.88(m，8H)，5.06(dd，J＝3.6，12.8Hz，1H)，4.79(dd，J＝12.4，25.2Hz，1H)，4.43(d，J＝10.8Hz，1H)，4.28(t，J＝5.2Hz，1H)，3.47(m，2H)，2.27(s，6H)，1.86-1.21(m，4H)，1.01(s，9H)；HRMS(ESI)m/z计算得到C25H35N2O4[M+H]+427.2597，实测427.2587，计算得到C25H34N2NaO4[M+Na]+449.2416，实测449.2407。
实施例64
(R)-N'-(1-叔-丁基-4-羟基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-肼羧酸苄酯
合成
使用实施例63中所述的方法学以>99％的ee制备(R)-N'-(1-叔-丁基-4-羟基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-肼羧酸苄酯。
实施例65
该实施例举例说明用于确定本发明的化合物对映体过量(ee)的分析方法。
如图2A-C所示，外消旋-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2,6-二氯代-苯甲酰)-酰肼(实施例16)、(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2,6-二氯代-苯甲酰)-酰肼和(S)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2,6-二氯代-苯甲酰)-酰肼(实施例41)的手性HPLC层析谱举例说明用来确定对映体过量的方法。外消旋-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2,6-二氯代-苯甲酰)-酰肼含有50％的R-同分异构体 (在大约16分钟处有峰1)和50％的S-同分异构体(在大约19分钟处有峰2)。(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2,6-二氯代-苯甲酰)-酰肼的对映体富集的样品基本上不含S-同分异构体，其ee为>99％。(S)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2,6-二氯代-苯甲酰)-酰肼的对映体富集的样品基本上不含R-同分异构体，其ee为>99％。在该实验中，使用4.6mm×25cm Regis Rexchrom(S,S)ULMO柱子来产生数据，其流速为2.0mL/min，使用在己烷中的2％甲醇作为溶剂，20μL的注射体积。以相似的方式确定式II或III的其他化合物的对映体过量，除非另外说明。
实施例66
该实施例举例说明本发明化合物的体外测试。
基因表达盒
GAL4 DBD(1-147)-CfEcR(DEF)/VP16AD-βRXREF-LmUSPEF：将来自云杉食心虫Choristoneura fumiferana EcR的野生型D、E和F结构域(“CfEcR-DEF”；SEQ ID NO:1)融合至GAL4 DNA结合结构域(“Gal4DBD1-147”；SEQ ID NO:2)并置于磷酸甘油酸激酶启动子(“PGK”；SEQ ID NO:3)的控制之下。来自人类RXRβ的EF结构域的螺旋1至8(“HsRXRβ-EF”；SEQ ID NO:4的核苷酸1-465)和飞蝗超气门蛋白的EF结构域的螺旋9至12(“LmUSP-EF”；SEQ ID NO:5的核苷酸403-630)被融合至来自VP16的反式激活结构域(“VP16AD”；SEQ ID NO:6)并被置于延伸因子-1α启动子(“EF-1α”；SEQ ID NO:7)的控制之下。五个共有GAL4应答元件结合位点(“5XGAL4RE”；其包括5个拷贝的GAL4RE，其包括SEQ ID NO:8)被融合至合成的TATA最小启动子(SEQ ID NO:9)并被置于荧光素酶报道基因(SEQ ID NO:10)的上游。
稳定细胞系
CHO细胞被由单个质粒上的遍在的活性细胞启动子(分别为PGK和EF-1α)所控制的GAL4DBD(1-147)CfEcR(DEF)和VP16ADβRXREF-LmUSPEF的转录盒瞬时转染。通过Zeocin抗性来筛选稳定转染 的细胞。用GAL4RE-荧光素酶报道分子(pFR Luc)瞬时转染单独分离的CHO细胞克隆。使用潮霉素选择27-63个克隆。
用手性二酰基肼配体处理
将细胞胰蛋白酶化并稀释至2.5×104细胞mL的浓度。将100μL细胞悬液置于96孔板的每个孔中并在37℃下于5％CO2中孵化24h。在DMSO中配制配体储液并稀释300倍用于所有处理。剂量响应测试由从33μM至0.01μM范围内的8个浓度所组成。
报道基因测定
在用来自Promega的Bright-GloTM荧光素酶测定系统(E2650)处理细胞之后48h，测量荧光素酶报道基因的表达。在室温下使用Dynex MLX微量滴定板光度计检测发光。
稳定细胞系
获得了稳定转化的细胞群体，其含有如Suhr等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:7999-804(1998)中所述的CVBE和6XEcRE。人293肾细胞，也被称作HEK-293细胞，被编码第一开关构建体CVBE的逆转录病毒载体以及接下来的报道分子构建体6XEcRE Lac Z顺序感染。所述开关构建体含有来自家蚕EcR(BE)(Iatrou)的氨基酸26-546的编码序列，其被插入框内并位于VP16反式激活结构域(VBE)的下游。将合成的ATG起始密码子置于细胞巨化病毒(CVBE)立即早期启动子的控制之下，并且被夹在长末端重复序列(LTR)之间。报道分子构建体含有六个拷贝的蜕皮素应答元件(EcRE)结合位点，其被置于LacZ的上游并在两侧有LTR序列(6XEcRE)。
使用稀释克隆法来分离单个的克隆。使用450ug/mL的G418和100ng/mL的嘌呤霉素对克隆进行选择。基于对存在和不存在测试配体的应答来评估单个克隆。为了筛选和SAR的目的来选择克隆Z3。
用CVBE和6XEcRE LacZ稳定转化的人293肾细胞在37℃下含有5％CO2的气氛中被维持在含有10％FBS(Life Technologies，26140-087)，450胶G418(Mediates，30-234-CR)和100gnome promising(Sigma，P-7255) 的极限必需培养基(Mediates，10-010-CV)中，并在它们达到75％汇合的时候被继代培养。
用手性二酰基肼配体处理
将Z3细胞以每孔2.5×103个细胞的浓度种在96孔组织培养板上，并在37℃下于5％CO2中孵化24小时。配体的储液是在DMSO中配制的。将配体储液在培养基中稀释100倍，并将50μL该稀释的配体溶液(33μM)添加到细胞。对照组和处理组二者中DMSO的终浓度被维持在0.03％。
报道基因测定
在处理细胞48小时之后评估报道基因的表达。使用来自Tropix的Gal ScreenTM生物发光报道基因测定系统(GSY1000)来测量β-半乳糖苷酶活性。通过将用配体处理的细胞中的相对光单位(“RLU”)除以用DMSO处理的细胞中的RLU来计算诱导活性的倍数。在室温下使用Dynex MLX微量滴定板光度计检测发光。
开关构建体CVBE和报道分子构建体6XEcRE Lac Z的简图被显示在图1中。所述两个构建体两侧是长末端重复序列，G418和嘌呤霉素是可选的标志物，CMV是细胞巨化病毒启动子，VBE是被插入VP16反式激活结构域下游的来自家蚕EcR的氨基酸26-546的编码序列，6X EcRE是六个拷贝的蜕皮素应答元件，lacZ编码报道酶β-半乳糖苷酶。
基因表达盒
GAL4 DBD-CfEcR(DEF)/VP16AD-MmRXRE：将来自云杉食心虫Choristoneura fumiferana EcR的野生型D、E和F结构域(“CfEcR-DEF”；SEQ ID NO:1)融合至GAL4DNA结合结构域(“Gal4DBD1-147”；SEQ ID NO:2)并置于pM载体(PT3119-5，Clontech，Palo Alto，CA)的SV40e启动子的控制之下。来自小家鼠RXR(“MmRXR-DE”；SEQ ID NO:11)的D和E结构域被融合至来自VP16的反式激活结构域(“VP16AD”；SEQ ID NO:6)并被置于pVP16载体(PT3127-5，Clontech，Palo Alto，CA)的SV40e启动子的控制之下。
稳定细胞系
CHO细胞被由SV40e启动子所控制的GAL4 DBD CfEcR(DEF)和VP16AD-MmRXRE的转录盒瞬时转染。使用潮霉素来选择稳定转染的细胞。用GAL4RE-荧光素酶报道分子(pFR-Luc，Stratagene，La Jolla，CA)瞬时转染单独分离的CHO细胞克隆。使用Zeocin选择13B3克隆。
用手性二酰基肼配体处理
将细胞胰蛋白酶化并稀释至2.5×104细胞mL的浓度。将100μL细胞悬液置于96孔板的每个孔中并在37℃下于5％CO2中孵化24h。在DMSO中配制配体储液并稀释300倍用于所有处理。剂量响应测试由从33μM至0.01μM范围内的8个浓度所组成。
基因开关测定–人工改造的EcR:USP/PXR系统
通过将下面的构建体瞬时转染进小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)来进行细胞基因开关测定。将来自云杉色卷蛾EcR的野生型D、E和F结构域或其V390I/Y410E/E274V突变体融合至GAL4-DBD并置于pBIND载体(Promega Corporation，Madison，WI，USA)中CMV启动子的控制之下。使用基于5’和3’末端的20-25nt序列所设计的引物将所显示的EcR的DEF结构域扩增。分别将限制酶位点EcoR I/BamH I和Xba I添加到5’和3’引物。用适当的限制酶将PCR产物消化并克隆进pBIND载体。通过测序来确认被克隆进pBIND载体的EcR LBD。按以前所述(Kumar P & Katakam A，于Gene Transfer(基因转移),Friedmann T和Rossi J,编辑,pp.643-651(2007),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)构建了来自人类RXRβ和飞蝗RXR的嵌合RXR，其被融合至VP16-AD并置于SV40e启动子的控制之下。可诱导的荧光素酶报道质粒pFRLuc(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA，USA)含有五个拷贝的GAL4应答元件和合成的最小启动子。
NIH3T3细胞被维持在37℃和5％CO2条件下的补充有10％小牛血清的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)中，其二者都获得自Mediatech Inc.，Manassas，VA。将细胞以2,500个细胞/孔的密度种在96孔板中的50μl生长培养基中。在接下来的一天里首先将细胞用35μL含有二甲基亚砜(DMSO；对照)的不含血清的DMEM或者含配体的DMSO溶液处理。 然后根据制造商的说明使用SuperFectTM转染试剂(Qiagen Inc.，Valencia，CA，USA)，将细胞用每孔含有0.04μg的EcR构建体、0.04ug的RXR构建体和0.16μg的荧光素酶报道分子构建体的15μl不含血清的DMEM转染。以0.01-33μM的8个剂量测试配体，并且在对照和处理孔中DMSO的终浓度为0.33％。在48个小时后处理和转染孵化之后，按照制造商的说明使用Bright-GloTM荧光素酶测定系统(Promega Corporation，Madison，WI，USA)来测定细胞的荧光素酶活性。最少一式二份地测量EC50值。
报道基因测定
在用来自Promega的Bright-GloTM荧光素酶测定系统(E2650)处理细胞之后48h，测量荧光素酶报道基因的表达。在室温下使用Dynex MLX微量滴定板光度计检测发光。
在两个分开的孔中进行单个测定，并将两个值平均。通过将用配体处理的细胞中的相对光单位(“RLU”)除以用DMSO处理的细胞中的RLU来计算诱导倍数。使用三参数逻辑模型从剂量响应数据计算EC50。相对最大FI被确定为在任何浓度下观测的被测配体(本发明一个实施方案)的最大诱导倍数相对于在任何浓度下观测的GSTM-E配体(3,5-二甲基-苯甲酸N-叔-丁基-N’-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼)的最大诱导倍数。
实施例67
该实施例举例说明本发明化合物的体内测试。在含有基因开关的C57BL/6小鼠模型系统中评估本发明的手性二酰基肼配体对报道酶的体内诱导。
基因表达盒
将来自云杉食心虫Choristoneura fumiferana EcR的野生型D、E和F结构域(“CfEcR-DEF”；SEQ ID NO:1)突变[V107(gtt)→I107(att)和Y127(tac)→E127(gag)]并融合至GAL4 DNA结合结构域(“Gal4DBD1-147”；SEQ ID NO:2)。来自人类RXRβ的EF结构域的螺旋1至8(“HsRXRβ-EF”；SEQ ID NO:4的核苷酸1-465)和飞蝗超气门蛋白的EF结构域的螺旋9至12(“LmUSP-EF”；SEQ ID NO:5的核苷酸403-630)被融合至来自VP16的反式激活结构域(“VP16AD”；SEQ ID NO:6)，其调控人类分泌的碱性磷酸酶的报道基因(“SEAP”，SEQ ID NO:12)，所述报道基因被置于6xGAL4应答元件(SEQ ID NO:13)和运甲状腺素蛋白启动子(SEQ ID NO:14)的控制之下。基因开关的每个元件是在分开的质粒上。受体表达是在CMV启动子(SEQ ID NO:15)的控制之下。通过在配体存在下表达的报道蛋白的量来对诱导进行评估。
基因开关的电穿孔
在将基因开关电穿孔导入小鼠四头肌之后，对小鼠血清中的SEAP表达进行评估。用2μL/g的氯胺酮(100mg/mL)和甲苯噻嗪(20mg/mL)混合物将小鼠麻醉。然后为动物剃毛，将DNA载体在体积为2×50μL的聚谷氨酸(12mg/mL水)中注射进肌肉，应用电极导电性凝胶，并将电极口径(1cm×1cm；384型)置于后腿。用200V/cm，20msec/脉冲，以1秒的时间间隔对肌肉进行8次电穿孔。在动物接受了一半的脉冲之后，将横向电场的方向逆转。使用来自BTX Molecular Delivery Systems的ECM830电穿孔仪进行电穿孔。
用手性二酰基肼配体处理
在一些实验中，在基因开关的电穿孔后3天，小鼠接受在50μL DMSO 中的2.6μmol的配体的腹膜内注射(IP)。在其他实验中，配体浓度被降至26nmol/50μL DMSO/小鼠。在配体施用之后2-11天对SEAP表达进行评估。在其他实验中通过啮齿类饲料(rodent chow)将配体施用。通过将2g配体溶解于20mL丙酮并将其加入来自Purina Mills的1kg的LabDiet 5010可高温高压消毒的饲料来制备所述饲料。在Hobart混合器中将其彻底混合，然后在Cross Blend混合器中再混合15min。动物随意地接受饲料1、2或3天。所有数值是来自四只动物的平均数。不加入配体而单独用载体处理的动物的血清中的背景SEAP是0-11ng/mL血清。
报道分子测定
对用小玻璃毛细管进行眶后放血获得的血液进行离心而获得小鼠血清。使用Clontech Great Escape化学发光试剂盒并与Clontech SEAP标准比较来确定SEAP定量。
为了评估(R)-2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼(实施例1)对于诱导治疗系统(RTS)基因表达的相对体内有效性，用下述质粒将十二只C57BL6小鼠电穿孔：pCMV/GEVY(DEF)、pCMV/VP16-Hs-LmRXR和p6XGAL4RE-TTR-SEAP。质粒pCMV/GEVY(DEF)由来自云杉色卷蛾的EcR的D、E和F结构域所组成，其载有被融合到酵母GAL4-DBD(aa 1-147)下游并受到pBIND载体(Promega Corporation，Madison，WI，USA)CMV启动子和下游的SV40多腺苷酸化信号控制的突变V390I/Y410E/E274V。使用基于5’和3’末端的20-25nt序列而设计的引物将所示的EcR的DEF结构域扩增。将限制性内切酶位点BamH I和Xba I分别加到5’和3’引物。使用适当的限制性内切酶消化PCR产物并克隆进pBIND载体(图20)。载体pCMV/VP16-Hs-LmRXR含有来自人类RXRβ(E结构域的螺旋1-8)和飞蝗RXR(E结构域的螺旋9-12)的嵌合RXR，其被融合到VP16激活结构域的下游并被置于pBIND载体中CMV启动子的控制之下(图21)。可诱导的SEAP报道载体p6xGAL4RE-TTR-SEAP含有人类分泌的碱性磷酸酶报道基因，其被置于可诱导的启动子的控制之下，所述启动子由在运甲状腺素蛋白(TTR)启动子上游的6拷贝的Gal4应答元件所组成(图22)。 将质粒DNA电穿孔导入小鼠四头肌之后3天，以26nmol/小鼠(11.4μg/小鼠，大约570μg/kg)的比率通过腹膜内注射向小鼠施用三种配体制剂。接下来在配体施用后对人类分泌的碱性磷酸酶(SEAP)在小鼠血清中的表达监测17天。为了比较，评估了(S)-2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼(实施例31)和外消旋-2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的相对体内有效性。如图3所示，(S)-2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼(●—●)不诱导RTS基因报道分子表达。外消旋-2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼诱导适度的RTS基因报道分子表达(▲—▲)。(R)-2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼(○—○)诱导大量的RTS基因报道分子表达。
实施例68
2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的R对映体和外消旋物的物理性质：
形态形式：在图4中报道了固体样品批。关于R对映体，从甲醇/水或甲苯/庚烷快速结晶/沉淀获得的样品产生相同的粉末X-射线衍射图型(数据未显示)，并具有互相相比和与得自CH3OH结晶的标准(165.1-166.5℃)相比基本上相同的熔点([甲苯/庚烷]166.2-167.1℃，[CH3OH/H2O]166.5-167.4℃)。关于外消旋物，通过甲醇蒸发获得的两个单独的制剂显示了在实验误差内相同的熔点(170-171℃，169-170℃)和纯度的微小变化。2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的外消旋物和R对映体的形态形式看来是最常见的。
微粒化和粒度：为了将粒度正常化，2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的R对映体和外消旋物的每个通过20筛目被预先筛选并被微粒化。通过称出约20mg测试物质并放入15mL的Falcon管中来确定粒度。将10mL去离子水加进粉末。将悬液混合，用声波处理20分钟，然后立即使用Malvern Mastersizer装置通过激光衍射 来分析粒度。尺寸分布显示在图5和6中。虽然外消旋物看上去具有比R外消旋物稍大的整体粒度，但该二样品非常相似。
堆密度和拍实密度分析：使用在10mL量筒中测量的重量和体积来计算微粒化的2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的R对映体和外消旋物的堆密度。使用物质的重量和拍实体积来计算微粒化的物质的拍实密度。使用拍实密度分析器(型号：Stampfvolumeter，JEL的STAV2003)来测量拍实体积，当其变得恒定时记录拍实体积(图7)。R对映体具有稍低的堆密度和拍实密度。两种物质都是絮状的(低的堆密度)。
热重分析/差热分析(TGA/DTA)：通过热重分析/差热分析来分析微粒化的2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的R对映体和外消旋物。热重曲线图显示在图8中。两种物质都在DTA概况上显示了吸热事件。R对映体的起始温度(163.6℃)显著低于外消旋物的起始温度(171.2℃)。R对映体的熔化热(59.8uv.s/mg)也显著低于外消旋物的熔化热(80.8uv.s/mg)。这说明两种物质是不同的晶体形式。R对映体较低的熔点和较低的熔化热反映在不同的溶解特性。
在加热到150℃以上后，R对映体失去0.4％的总重量而外消旋物失去0.8％的总重量(图8)。两种物质的含水量(可被热除去的水分)稍微不同。
动态蒸汽吸收分析：当被暴露于干燥条件(20％RH)时，外消旋物未显示任何显著的总量减轻，而R对映体失去0.9％的总重量(数据未显示)，其可能对应于在样品转移或储存中获得的松散地伴随的水分。当在干燥条件下脱水后，在暴露于低(30-40％RH)、中(50-60％RH)和高(70-80％RH)湿度时，该二物质显示了可比的重量增加。在70％RH，重量增加对于R对映体为6.3％而对外消旋物为6.2％(数据未显示)，这表明二种物质适中的吸湿性。
在药物赋形剂中的溶解度：测定1：在商业上可得的赋形剂中定量地评估了微粒化的2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的R对映体和外消旋物的溶解度(图9)。通过在室温下超声处理15分钟(以5分钟的间隔回荡30秒)并且接下来在铝砧上以50℃ 加热12分钟(以3分钟的间隔回荡30秒)来制备玻璃管形瓶中10mg/g(检品/赋形剂)的初始溶液/悬液。基于该初始的10mg/g赋形剂样品的表现，通过在如下几点的间隔处向上或向下取样来扫描2-4点浓度连续谱：5、10、15、20、30、50mg/g(检品/赋形剂)。在所有被测的药物赋形剂中R对映体比外消旋物更可溶，除了在无水聚山梨醇酯80中R对映体和外消旋物看上去具有可比较的溶解度(参见图9)。对任何样品都未观察到颜色改变。为透明玻璃管形瓶中的几种制剂照了相(未显示)。
测定2：对于每种赋形剂，鉴定了图9的测定中2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的R对映体和外消旋物不能溶解的最低浓度。在管形瓶中制备该相同浓度的两种物质的悬液。在室温下将每个样品搅拌≤2.5hr(处理1)。作为单独的实验，将检品/赋形剂组合在90℃下于铝砧上加热5分钟或按需要更长的时间；如图10中所示，并允许其冷却至室温，并用少量相同的微粒化的物质撒种(处理2)。在72hr或标明的时间记录物理性质(图10)。在所有情况下未观察到颜色变化。该溶解度测定是在完全溶解的条件下操作的，在其中最初的粒度和形态形式是不相关的。在用任何形态形式的结晶外消旋物向过饱和的2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的外消旋物溶液撒种后观察到沉淀/结晶，而R对映体保持完全溶解(特别在不加热时)，表明了在被测浓度下外消旋物和R对映体之间的溶解度差异。为透明玻璃管形瓶中的制剂照相(在测定1条件下不加热到90℃的R对映体，以及在90℃处理、冷却并撒种后的外消旋物，未显示)。
测定3：将2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的R对映体和外消旋物与20％PEG 1000在蒸馏水中混合，pH 7.0，每mL含1-2mg的粉末。将混合物在37℃孵化，在室温下漩涡混合大约2小时，并允许在室温下静置另外12小时。将溶液过滤或离心，并且使用具有最小4点校准曲线的普通LC/MS/MS方法通过重复的LC/MS/MS注射对浓度进行定量(图11)。参见R,等，Solubility as a limiting factor to drug absorption(作为药物吸收限制因素的溶解度)，在Oral Drug Absorption(口服药物吸收)中，J.B.Dressman(编辑)，Marcel Dekker,NY,2000和Mader WJ,Grady LT，Determination of solubility(溶解度的确定)，第5章，Techniques of Chemistry(化学技术),Physical Methods in Chemistry(化学中的物理方法)，第1卷，第V部分，Weissberger,V.A.,Rossiter,B.W.，编辑，Wiley，纽约，1971。
测定4：在制剂赋形剂和生物液体中的平衡溶解度影响药物的生物利用率，虽然溶解的动力学也可能是确定生物利用率时的一个限制因素。在药物表面活性剂聚山梨醇酯80的水制剂中定量地确定2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的R对映体和外消旋物的溶解度，然后观测了压缩的被测物质内在的溶解速率。通过将20+/-1mg被测物质接着是500mg聚山梨醇酯溶液加入2mL的Eppendorf管形瓶来制备在0.5％、1％和1.5％聚山梨醇酯80溶液中的外消旋物和R对映体混合物。将混合物用小珠打击120秒，在25℃下摇动16至24小时，并用Spin-X(0.2μM)过滤。记录滤液的pH。通过定量HPLC分析来测量滤液中被测物质的浓度(图12)。在1.0和1.5％聚山梨醇酯80溶液中R对映体具有2-3X更高的溶解度。在去离子水和0.5％聚山梨醇酯80中，外消旋物和R对映体的溶解度是可比较的。
接下来，在37℃下使用去离子水中1％的聚山梨醇酯80中压缩的小丸(7mm直径，100mg)来确定2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的R对映体和外消旋物的内在的溶解概况，其根据如下的测试条件：
容器：1000mL
介质：去离子水中1％聚山梨醇酯80(通过0.8μM滤器真空过滤)
介质容积：1000mL
速度：100RPM
温度：37℃
采样点：15、30、45、60、90和120min
采样容积：1mL(滤过30微米)
分析：HPLC(从每批制备标准溶液)
样品尺寸：n＝2个小丸/被测物质
在至多120分钟内，外消旋物和R对映体的释放是在HPLC的检测限内的。120分钟以后，据观察，两种物质的小丸在介质中都保持完整。
实施例69
2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的R对映体和外消旋物的细胞膜通透性：
穿过Caco-2细胞单层的双向通透性(参见Sambuy Y,等，The Caco-2cell line as a model of the intestinal barrier:influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics(作为小肠屏障模型的Caco-2细胞系：细胞和培养相关的因素对Caco-细胞功能特性的影响).Cell Biol Toxicol.2005 Jan；21(1):1-26和Artursson P等，Caco-2 monolayers in experimental and theoretical predictions of drug transport(在药物运输的实验和理论预测中的Caco-2单层).Adv Drug Deliv Rev.2001Mar 1；46(1-3):27-43)：
数据在图13中显示。在HBSSg中制备5μM的被测化合物，其中最大DMSO浓度≤1％。制备了21至28天的汇合的Caco-2细胞单层。用改良的Hanks缓冲液HBSSg中1％的BSA制备接受孔，并将顶端和基底侧的Caco-2细胞维持在pH 7.4±0.2。对两个单层向各方向给药(N＝2)：为了评估(A→B)对顶端侧给药，而为了评估(B→A)对基底侧给药。使用带有最小4点校准曲线的普通LC/MS/MS方法在120分钟的时间点为顶端和基底侧二者测量被测化合物的浓度。图13中的值为：被测化合物从含有Caco-2细胞单层的孔的百分比回收；两个方向的表观通透性(Papp)；外流比率(Papp B→A)/(Papp A→B)；被分类为低或高的被测化合物的吸收潜力；当外流≥3.0且Papp(B→A)≥1.0×10-6cm/s时外流分类是显著的。R对映体在两个方向上的通透性都比外消旋物更强。而且，R对映体的外流速率较低。
使用MDR1-MDCK细胞对血脑屏障穿透潜力的确定(参见Taub ME,等,Functional assessment of multiple P-glycoprotein(P-gp)probe substrates:Influence of cell line and modulator concentration on P-gp activity(多个P-糖蛋白(P-gp)探针底物的功能评价：细胞系和调节剂浓度对P-gp活性的影响).Drug Metab Dispos.2005 Nov；33(11):1679-87和Wang Q,等,Evaluation of the MDR-MDCK cell line as a permeability screen for the blood-brain barrier(血脑屏障通透性筛选时MDR-MDCK细胞系的评价).Int J Pharm.2005Jan 20；288(2):349-59.(从Absorption Systems Inc.简报修饰而得))：
数据在图14中显示。在HBSSg中制备5μM的被测化合物溶液，其中最大DMSO浓度≤1％。制备了7至11天的汇合的MDR1-MDCK细胞单层。用改良的Hanks缓冲液(HBSSg)中1％的BSA制备接受孔，并将顶端和基底侧维持在pH 7.4±0.2。对两个单层向各方向给药(N＝2)：为了评估(A→B)对顶端侧给药，而为了评估(B→A)对基底侧给药。使用带有最小4点校准曲线的普通LC/MS/MS方法在120分钟的时间点为顶端和基底侧二者测量被测化合物的浓度。图14中报道的值：被测化合物从含有MDR1-MDCK细胞单层的孔的百分比回收；两个方向的表观通透性(Papp)；外流比率(Papp B→A)/(Papp A→B)；和血脑屏障穿透潜力分类。2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的R对映体在MDR1-MDCK细胞中在A→B和B→A两个方向都比外消旋物具有更强的通透性。而且，R对映体经历更少的外流。R对映体被归类为适度地穿透血脑屏障，而外消旋体被归类为低地穿透血脑屏障。较高的血脑屏障穿透对医疗指征具有显著优势，其中中枢神经系统(CBS)的穿透是必需的。
实施例70
2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的R对映体和外消旋物的微粒体代谢(参见Jeffrey P,等,Utility of metabolic stability screening:comparison of in vitro and in vivo clearance(代谢稳定性筛选效用：体外和体内清除的比较).Xenobiotica.2001 Aug-Sep； 31(8-9):591-8和Lin JH,等,Role of pharmacokinetics and metabolism in drug discovery and development(药代学和代谢作用在药物发现和研究中的作用).Pharmacol Rev.1997Dec；49(4):403-49)
在DMSO(浓度小于0.25％)、甲醇或乙腈中制备5μM的被测化合物溶液。从≥10个供给者集合了混合性别人的肝脏微粒体，并将其用1mM NADPH孵化。在37℃下于含有1.0mg/mL微粒体蛋白的缓冲液中与1mM的NADPH一起孵化被测化合物。在0和60分钟，对混合物取样并通过LC/MS/MS监测对应于被测化合物的峰面积，其范围是10-100％。一式二份地进行该测定(N＝2次分开孵化)。图15中报道的数据是睾酮标准物的百分比残留和被测化合物的百分比残留。R对映体对于人肝脏微粒体的代谢比外消旋物稍微更稳定。
实施例71
2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的R对映体和外消旋物的生物利用率
通过口服管饲法将Labrasol中的化合物施用于C57BL/6N:Crl(野生型)小鼠(Charles River Laboratories)，所述口服管饲法是在人身上期望的施用途径。剂量被设置在3、10、30或50mg/kg/天和2.5mL/kg/剂(图16)。施用该剂9天(第一次18只雌性/组)或12天(第二次18只雌性/组)(图16)。在9天和12天的时间点抽血。通过反相HPLC对浓度进行定量。
对于每个浓度，通过将Labrasol加到烧杯中的固体R对映体或外消旋物，用声波处理以打碎可见的聚集物并用磁力搅拌直到获得均匀的形态来制备样品。将混合物转移到量筒并使用Labrasol对烧杯的冲洗液加到需要的体积。通过倒置将量筒的内含物混合并将其磁力搅拌直到给药。
这些Labrasol给药制剂利用了微粒化的R对映体，但是非微粒化的外消旋物。为了解决非微粒化的外消旋物标本可能使其在Labrasol中的溶解速率发生偏差的可能性，进行了独立的实验。在该实验中，检验了微粒化和非微粒化的外消旋物的20mg/mL制剂的溶解度和表现。将微粒化的外 消旋物(批REH-28-9-1/PYAP-2-8-2-2M)、非微粒化的外消旋物(批#PYAP-2-8-2-2)和微粒化的R对映体(批#REH-28-4-2)各自悬浮在Labrasol中，用手振荡，然后在Branson 2100桌面超声波仪上于25-28℃以3×5min的间隔和1×10min的间隔经超声波处理，经手振荡使其散布。R对映体容易地溶解而微粒化的和未微粒化的外消旋物混合物保持含有悬浮微小粒子的浑浊(照片未显示)。通过目检，微粒化的和未微粒化的外消旋物样品中未溶解的物质的量基本上相同。显微术(图17)揭示，微粒化的和未微粒化的外消旋物悬浮液中多数粒子小于25微米(图17)。一些较大的晶体片段保持为未微粒化的样品。既然微粒化的和未微粒化的外消旋物样品二者都导致相似量的未溶解物质，看来R对映体和外消旋物Labrasol制剂之间的主要区别是内在的溶剂性而非溶质的起始粒度。
通过定量HPLC来测量作为时间的函数的小鼠血清水平。Labrasol中的R对映体在30和50mg/kg/天(施用了12和20mg/mL的Labrasol)的较高剂量获得显著较高的血清水平。外消旋物血清水平基本上保持较低(<4-5倍AUC)(图18和19)。外消旋物和R对映体之间初始粒度的不同可能是血清水平不同的一部分原因。而且，R对映体比外消旋物在Labrasol中具有较大的内在溶解度可能是血清水平不同的一部分原因。此外，血清水平不同可能是由于膜通透性(每Caco-2细胞和MDCK细胞实验；图13和14)、吸收、分布或分泌的不同。
实施例72
2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的R对映体和外消旋物关于在体内诱导基因修饰的肿瘤细胞中转基因IL-12产生方面的对比
在该样品中被测的转基因是在RTS控制之下的鼠IL-12。用载有RTS控制的鼠IL-12转基因的腺病毒载体Ad-RTS-mIL-12转导小鼠黑素瘤细胞(B16)。通过皮下(s.c.)将这些细胞注射进C57BL/6小鼠(与B16细胞是组织相容的)，并用2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的R对映体和外消旋物的不同剂量对小鼠处理三天。 对照组包括了接受未转导的B16细胞和较高剂量配体的小鼠，以及接受转导的B16细胞而不含配体的另一组。为了评估由配体直接诱导的转基因表达，在皮下注射之后72小时从每组中一半的小鼠中采集肿瘤和血清。制备肿瘤提取物和血清并使用ELISA分析其中IL-12。
将余下的小鼠用来测试当配体施用中断另外72小时的时候的转基因的关闭。结果表明用配体的外消旋物和R对映体处理的小鼠中肿瘤转基因IL-12的表达以及血清水平的不同。配体施用的中断以相似的方式导致了所有组中转基因的关闭。
材料和方法：用Ad.-RTS-mIL-12(MOI＝100)在体外将B16细胞感染。48h后，通过皮下将5×105个(B16，右侧)细胞注射进C57BL/6小鼠(10只小鼠/组)。通过在50℃将10mg/mL混合物加热5分钟来使R对映体和外消旋物配体溶解于Labrasol。根据目检，两种配体都溶解于Labrasol。在3天中每天通过口服管饲法提供如下剂量(0mg/kg；3mg/kg；10mg/kg；30mg/kg和50mg/kg)的激活配体。另外的对照包括只接受配体的含有B16的小鼠(在3天中50mg/kg/天且未处理的含肿瘤小鼠)。收集了五只小鼠/组用来分离肿瘤损伤和外周血。在总共1mL的磷酸盐缓冲盐水中将组织搅匀。将溶解物/血清冷冻保存在-80℃。在没有进一步施用配体的情况下允许替代的5只小鼠/组进行另外的72h。收集了这些后来的5只小鼠/组用来分离肿瘤损伤和外周血。如上述将组织搅匀，并冷冻保存，且将溶解物/血清冷冻保存在-80℃。在37℃水浴中将标本解冻并用特殊的ELISA(BD-Pharmingen)分析其中的mIL-12p70以及mIFN-γ，即对于将CTL运输进肿瘤是重要的推论的依赖于IL-12的细胞因子。
结果：肿瘤中转基因IL-12的表达以及血清水平对于所述配体二者都遵循了剂量依赖型(图24和25)。然而，在用2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的R对映体处理的小鼠中的表达水平高出2.5至3倍。在肿瘤提取物和血清中观察到该类型。对照组未显示任何IL-12的表达，在所述对照组中，小鼠接受未转导的B16细胞加上最大剂量的配体，或转导的B16细胞而没有配体的施用。在配体处理被中断3天的组中，表达水平下降到所有处理组中相似的比例，这表明，所 述配体被清除且当所述配体被撤出时RTS激活是可逆的。当在肿瘤和血清中测定IFN-γ水平时，R对映体组清晰地显示增强的表达。
实施例73
包括2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的药物组合物
表1显示包括2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼、PL90G、维生素E TPGS、BHT和Miglyol 812N的药物组合物。PL90G是来自大豆的高度纯化的磷脂酰胆碱。PL90G的制造商是PHOSPHOLIPID GmbH，即Lipoid的子公司。维生素E TPGS是一种GRAS(公认为安全的)化合物且符合当前的国家配方集(NF)专著的所有要求。Miglyol 812N含有分馏的植物C8和C10脂肪酸的甘油三酯。用来产生Miglyol 812N的脂肪酸被归类为GRAS且符合当前NF和EP专著关于中链甘油三酯的要求。BHT[MeC6H2(CMe3)2OH]是有机化合物，其为广泛用作抗氧化剂食品添加剂的亲脂的(脂溶性的)酚。该制剂被配制成硬明胶胶囊。
实施例74
疾病的动物模型中的效力
在(R)-2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼存在的情况下，被分别编码RTS和mIL-12或hIL-12的腺病毒载体所转导的鼠或人树突细胞(DC)在体外以剂量依赖的方式表达细胞因子。在不存在(R)-2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的情况下，IL-12表达是在基础水平。
在B16黑素瘤小鼠模型上进行了(R)-2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的各种施用途径和剂量对瘤内运送的DC的抗肿瘤效力的对比分析，其中所述DC被编码鼠白细胞介素-12p70(DC-SP1(IL-12p70))的腺病毒载体所转导。结果表明， (DC-SP1(IL-12p70))疗法与通过腹膜内(i.p.)注射、口服管饲或饮食混合施用的(R)-2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼相结合证明了抗肿瘤效力。最佳的抗肿瘤作用发生在与(DC-SP1(IL-12p70))疗法一起施用的≥30mg/kg的(R)-2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼剂量。
在鼠B16黑素瘤模型中，载有被注射进肿瘤的鼠IL-12基因的被转导的AdDC介导了完全的肿瘤退行和延长的动物存活，其依赖于在AdDC注射后48个小时内于全身施用的(R)-2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼，在所述鼠B16黑素瘤模型中小鼠在治疗开始之前被肿瘤接种(对C57/BL6小鼠皮下注射B16细胞以形成肿瘤)。该药物依赖作用与如下相关：在肿瘤和DLN中的转基因表达；在肿瘤微环境中延长的Ad-DC存活；AdDC在DLN中的迁移和存留；以及抗B16CD8+T细胞的诱导。
在上面的鼠B16黑素瘤模型中，由107 AdDC的注射所组成的瘤内疗法与用(R)-2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼进行的13天处理一起显示了肿瘤特异性的保护性免疫。当不含肿瘤的动物被再次攻击，在第50天(最初的肿瘤接种之后)，这些动物对B16黑素瘤而非MC38结肠癌的进展是抗拒的。
实施例75
包含RTS和hIL-12的不能够复制的重组腺病毒
图23是Ad-RTS-hIL-12的图示，在所述Ad-RTS-hIL-12中E1和E3区域缺失且RTS-IL12组分替换E1区域(图23不是按比例描绘的)。用于图23的术语具有如下的含义：
RTS-IL-12：在治疗系统控制之下的人IL-12
Preg：受到活性药物调控的、驱使IL12表达的启动子
hIL-12：被IRES序列分开的人IL-12的p40和p35亚基的编码序列
polyA：多腺苷酸化信号
PUbC：泛素C启动子
VP16-RXR：VP16转录激活结构域和嵌合RXR之间的融合
IRES：内核糖体进入位点
Gal4-EcR：Gal4 DNA结合结构域和蜕皮素受体配体结合结构域之间的融合蛋白
Ad：含有E1和E3基因缺失的腺病毒-5主链
如Anderson等，Gene Therapy，4：1034-1038(2000)所述制备重组的腺病毒载体Ad-RTS-hIL-12。按如下方式生产Ad-RTS-hIL-12载体。由EMCV-IRES(内核糖体进入位点)分开的受体融合蛋白VP16-RXR和Gal4-EcR的编码序列被插入人泛素C启动子(组成性启动子)控制下的腺病毒穿梭载体。接下来，被置于合成的可诱导启动子的控制之下的、由IRES分开的hIL-12的p40和p35亚基的编码序列被插入泛素C启动子和受体序列的上游。穿梭载体含有从左末端至mu16的腺病毒血清型5序列，从所述m16开始E1序列缺失并被RTS和IL-12序列(RTS-hIL-12)所替换。通过在HT-1080细胞中的瞬时转染来测试载有RTS-hIL-12的穿梭载体的配体依赖性IL-12表达。然后通过向HEK 293细胞中共转染将穿梭载体与E3缺失的腺病毒主链重组以获得重组的腺病毒Ad-RTS-hIL-12。在cGMP装置中生产临床级的腺病毒载体。
实施例76
含有hIL-12转基因和治疗系统的腺病毒对自体未成熟树突细胞的转导
通过白细胞分离法收集PBMC：受试者在Hillman门诊病人CTRC进行了90-120分钟的白细胞分离。白细胞分离过程包括从一条臂的静脉抽血；使血液通过离心机(细胞分离器)，其中它的成分被分离且一种或多种成分被除去；以及使残留成分返回到受试者相同或另一条臂的静脉。当 血通过细胞分离器装置被加工时，任何一次抽取出受试者不超过15％的全血容积。在细胞分离器中，血被分离成血浆、血小板、白细胞和红血细胞。白血细胞(WBC)被除去且所有其他成分被返回到受试者的循环中。每次都试图使用该过程的两条外周IV线。如果那不可能，中线可能是必要的。医师必须清理受试者以进行白细胞分离，并且在所述过程之前常规地筛选生命体征(包括血压)。
加工：采集之后，用手将leukapack输送到CPL，并且马上在ELUTRATM上用离心淘洗来加工。这是一个被批准为临床使用的封闭系统。单核细胞级分被回收，且在细胞的回收和生活力被建立之后，它们被转移到Aastrom药筒中在IL-4和GM-CSF的存在下培养6天。所有加工和冲洗过程是在无菌条件下进行的。
最初的铺板：在台盼蓝染料的存在下对从单个leukapack回收的单核细胞进行计数以确定活细胞的数量。使用流式细胞术来评估单核细胞的纯度。在不含血浆和抗生素但每SOP-CPL-0166含有1,000IU/mL的IL-4和1,000IU/mL的GM-CSF的CellGenix培养基中将单核细胞再悬浮，并置于Aastrom药筒中。盒接种必需最小为50ml的加样体积和最少的细胞数量。
培养：Aastrom药筒被置于Replicell系统的孵化器中，所述系统为用于不成熟DC生成的完全封闭的、cGMP相容的自动化培养设备。
不成熟DC的采集：在第6天，从孵化器中取出Aastrom药筒并采集不成熟的DC。通过用1,500rpm离心将细胞回收，用CellGenix培养基冲洗，在台盼蓝染料的存在下计数并检查形态和表型特征。
生活力：这是通过在台盼蓝的存在下进行血细胞计数器的细胞计数来确定的。通常，>95％的被采集细胞是有生活力的，也就是将台盼蓝染料排除在外。如果生活力小于70％，不成熟的DC将被丢弃。
确定表型：通过在血细胞计数器上用显微镜观察来对培养中所生成的细胞进行计数，并使用台盼蓝染料获得初步的分类计数(DC对比淋巴细胞)。通过流式细胞术，门控DC和淋巴细胞，并使用不成熟DC的高的前向和侧向散射特性作为鉴定它们的标准来对分类计数进行确认。不成熟的 DC通常含有>80％的带有树突细胞形态的细胞且具有DC表型。
IL-12p70效价测定：已经确认，成熟的DC(mDC)具有自发或者用CD40L进行激活时产生IL-12p70的能力，其中加入或不加入先天的免疫信号(例如，LPS)。标准化的IL-12p70生产测定最近被建立且适用于在各种条件下产生的小样品或大批DC疫苗。当前的效价测定由两个不同步骤组成，第一个步骤包括应答DC与用人CD40配体基因作为刺激剂稳定转染的J588淋巴瘤细胞的共同孵化。第二个步骤包括测试来自这些共同培养物的上清液中由DC分泌的IL-12p70的水平，其中所述DC是由Luminex系统中的J558/CD40L+/-LPS刺激的。该效价测定具有18.5％(n＝30)的测定间CV和大的动态范围，其促进对各种DC产物的评估，所述DC产物的特点是具有非常不同的IL-12p70生成水平。使用产自13个正常供给者的单核细胞的DC产物所建立的测定的正常范围是8-999pg/mL，其平均值为270pg/mL。
实施例77
不成熟的DC的腺病毒转导
采集不成熟的DC，计数并测试其生活力。在最佳的感染复数(最佳的MOI，在500和1000之间，待定)用腺病毒载体将大约6-7×107个DC转导了最佳的病毒吸附时间(在2h和5h之间，待定)。转导后，将细胞反复冲洗以除去任何未吸附的病毒颗粒。将等份试样进行除菌、内毒素、支原体、DC表型和IL-12转基因诱导测定。5×107个细胞的靶剂量保持在4℃的盐水中直至放行测试完成。
将已经通过了所有放行测试的被转导的DC(AdDC)送至临床以进行下述的患者施用。
被转导的AdDC对IL-12转基因的诱导的体外测试花了最少两天才得到可用的结果，并且因此，IL-12的产生作为对(R)-2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的响应，将不是AdDC瘤内注射的放行标准。然而，基于对来自三个健康志愿者的AdDC的初步研 究，所诱导的IL-12表达作为对(R)-2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N'-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3,5-二甲基-苯甲酰)-酰肼的响应，已经在24小时内每百万个细胞80至300ng的IL-12的靶范围内实现了(在3个AdDC制剂中的2个中观测到80ng/百万个细胞/24h的表达水平)。因此，将体外IL-12诱导结果用于治疗结果的分析。像这样，在病毒转导和冲洗之后将被转导的AdDC用于注射。任何剩余的未被转导的和被转导的DC被冷冻保存以应将来的分析所需。
AdDC对患者的施用：0.9％盐溶液中的AdDC的单独瘤内注射在每次注射中150微升的体积内含有大约5×107个细胞(或大约90％的DC是从实验受试者产生的)。应该以最大可行的AdDC剂量对受试者给药，但每次注射不超过5×107个细胞。
实施例78
对人施用被腺病毒转导的自体树突细胞，其被人工改造以在携带III和IV期黑素瘤的受试者中治疗系统的控制下表达hIL-12
组群1将由12个受试者组成而组群2将由28个受试者组成，其所有将在(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼的第一次给药之后大约24小时接受单独瘤内注射的转导的自体AdDC。组群1受试者将被分成4个组(A、B、C、D)每组3个受试者以接受增加剂量的(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼。组群2，受试者将接受最大耐受口服剂量的(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼(如组群1中所确定的)。在注射AdDC之后马上将受试者用(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼的每日给药处理另外的13天。在招募受试者接受更高剂量的(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼之前，在注射了AdDC之后至多一个月，将其对组群1中每组的所有受试者的安全性、耐受性和转基因功能进行评估。在组群1完成了住院病人治疗阶段之后30天且在被转导的自体树突细胞的瘤内注射之后至少6至8周，如果受试者期望再治 疗且受试者符合再治疗的标准，可以施用另外的DC注射，使用14个连续日剂量的(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼。(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼的剂量(0.01mg/kg、0.1mg/kg、1.0mg/kg或10.0mg/kg)将为组群1的最大耐受剂量。
将通过体检(包括ECOG性能状况)、生命体征、血清化学、尿分析、血液学、有害事件、抗体以及对腺病毒载体和治疗系统成分的细胞免疫应答来对患者进行评估。还将评价口服的(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼及其主要代谢物的单独剂量和稳态的药物代谢动力学/ADME，通过测量靶肿瘤和/或引流淋巴结的活组织检查中的hIL-12水平来对转基因功能进行的分析，通过测量靶肿瘤、引流淋巴结和外周循环的活组织检查中的细胞免疫应答(T细胞)来对免疫作用进行的评估，以及血清细胞因子概况。
需要理解的是，上述的实施方案和例证不是想在任何方面对本发明的范围加以限制，而且本文所呈现的权利要求旨在涵盖所有实施方案和例证，不管其是否被明确地呈现在本文中。