一种果糖基转移酶及其编码基因与应用.pdf

本发明涉及基因工程领域，具体地，一种果糖基转移酶FWT01及其编码基因与应用。本发明提供了一种来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的果糖基转移酶FWT01，其氨基酸序列如序列1所示，且本发明提供了编码上述果糖基转移酶的编码基因FWT-01。本发明的果糖基转移酶具有以下性质：1)可在毕赤酵母(Pichia pastoris)、大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等宿主中异源表达；2)具有较宽的温度稳定性性，在50以下酶稳定；3)具有较宽的pH稳定范围：在pH4.0-9.0条件下稳定(酶活力残留＞90％)；4)具有高低聚果糖转化率，其浓度为57.3％(w/w)。

权利要求书
1.  一种果糖基转移酶FWT01，其特征在于：
1)由序列1所示氨基酸序列组成的蛋白质；
2)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加且具有果糖基转移酶功能的由序列表序列1衍生的序列相似度大于90％的蛋白质。

2.  一种果糖基转移酶基因FWT-01，其特征在于，编码权利要求1所述的果糖基转移酶FWT01。

3.  根据权利要求2所述果糖基转移酶基因FWT-01，其特征在于：
1)其DNA序列如序列2所示；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有果糖基转移酶活性蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有果糖基转移酶活性蛋白的DNA分子。

4.  包含权利要求2或3所述的果糖基转移酶基因FWT-01的重组载体。

5.  根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述载体可使果糖基转移酶在毕赤酵母(Pichia pastoris)、大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等宿主中进行异源表达。

6.  一种制备果糖基转移酶FWT的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞P.pastoris、E.coli或S.cerevisiae，得重组菌株。
2)培养重组菌株，实现重组果糖基转移酶表达。
3)回收并纯化所表达的果糖基转移酶FWT01。

7.  权利要求1所述果糖基转移酶的应用，其主要应用于催化蔗糖生产低聚果糖，其中蔗糖浓度为5-900g/L。

说明书一种果糖基转移酶及其编码基因与应用
技术领域
发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种果糖基转移酶FWT01及其编码基因与应用。
背景技术
低聚果糖又称寡果糖或蔗果三糖族低聚糖，分子式为：G-F-Fn，n＝1～3(G为葡萄糖，F为果糖)。低聚果糖是蔗糖分子的果糖残基上通β-1-2糖苷键连接1～3个果糖基而形成的果糖寡聚体：蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖及其混合物。与传统糖类相比，新型低聚果糖可作为益生元，促进双歧杆菌的生长、减少有害菌。低聚果糖具有水溶性膳食纤维的功效，且无任何毒副作用。低聚果糖广泛存在于大麦、西红柿、黑麦等植物中，但其含量较少(<1％)，开发较难。利用微生物低聚果糖生产酶(果糖基转移酶)可得到高纯度、高产量的低聚果糖，果糖基转移酶是一种具有果糖基转移活性的酶，能作用于蔗糖催化获得蔗果三糖等低聚糖。
在果糖转移酶研究方面，目前国内主要集中在野生菌筛选、性质测定等方面。王立梅等对一株曲霉果糖转移酶酶学性质及底物特异性进行研究，在pH 5.5，30℃条件下，果糖基转移酶具有最高活性。郑氏金云等研究了在不同蔗糖浓度下从黑曲霉AS0023纯化的转化酶(INV)和果糖转移酶(FTS)的酶催化活力。在将来的研究过程中，具有优良催化性能的优良果糖基转移酶基因的挖掘与发现显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种催化蔗糖生产高纯度低聚果糖的果糖基转移酶、其氨基酸序列、编码该果糖基转移酶的基因、含有该基因的重组载体、含有该重组载体的重组菌株、一种制备果糖基转移酶的基因工程方法、该果糖基转移酶的应用。
具体包括： 
本发明提供了一种果糖基转移酶FWT01，其氨基酸序列如序列1所示。
序列1：
MKLQTASVLLGSAAAASPSMQTRASVVIDYNVAPPNLSTLPNGSLFETWRPRAHVLPPNGQIGDPCLHYTDPSTGLFHVGFLHDGSGISSATTDDLATYKDLNQGNQVIVPGGINDPVAVFDGSVIPSGINGLPTLLYTSVSFLPIHWSIPYTRGSETQSLAVSSDGGSNFTKLDQGPVIPGPPFAYNVTAFRDPYVFQNPTLDSLLHSKNNTWYTVISGGLHGKGPAQFLYRQYDPDFQYWEFLGQWWHEPTNSTWGNGTWAGRWAFNFETGNVFSLDEYGYNPHGQIFSTIGTEGSDQPVVPQLTSIHDMLWVSGNVSRNGSVSFTPNMAGFLDWGFSSYAAAGKVLPSTSLPSTKSGAPDRFISYVWLSGDLFEQAEGFPTNQQNWTGTLLLPRELRVLYIPNVVDNALARESGASWQVVSSDSSAGTVELQTLGISIARETKAALLSGTSFTESDRTLNSSGVVPFKRSPSEKFFVLSAQLSFPASARGSGLKSGFQILSSELESTTVYYQFSNESIIVDRSNTSAAARTTDGIDSSAEAGKLRLFDVLNGGEQAIETLDLTLVVDNSVLEIYANGRFALSTWVRSWYANSTNISFFQNGVGGVAFSNVTVSEGLYDAWPDRQS 
其中，该酶基因编码628个氨基酸，其理论分子量为67.89kDa。
本发明提供了编码上述果糖基转移酶的基因FWT-01，具体的，该酶的基因序列如序列2所示：
ATGAAGCTTCAAACGGCTTCCGTACTGCTCGGCAGTGCTGCTGCTGCCTCGCCTTCCATGCAGACGCGGGCCTCCGTTGTCATCGACTACAATGTCGCACCTCCAAACCTATCCACTCTGCCCAATGGCTCCCTCTTCGAAACATGGCGTCCCCGCGCCCACGTCCTGCCCCCCAACGGCCAGATCGGTGACCCCTGCCTGCATTACACCGATCCCTCCACGGGCCTCTTCCACGTCGGCTTCCTTCACGATGGCAGCGGCATCTCCAGCGCCACCACTGATGATCTAGCCACCTACAAGGACCTCAACCAAGGCAACCAAGTCATTGTTCCCGGGGGTATCAACGACCCCGTCGCCGTCTTCGATGGCTCCGTCATCCCCAGCGGCATCAACGGCCTCCCCACTCTCCTCTACACCTCCGTCTCCTTCCTTCCCATCCACTGGTCCATCCCCTACACCCGCGGCAGTGAGACCCAATCCCTCGCTGTCTCCTCGGATGGCGGCAGCAACTTCACCAAGCTCGACCAGGGCCCCGTCATCCCTGGCCCTCCCTTCGCCTACAACGTCACCGCATTCCGGGACCCCTACGTCTTCCAAAACCCCACCCTCGACTCCCTCCTGCACAGCAAGAACAACACCTGGTATACCGTCATCTCCGGTGGTCTGCACGGCAAGGGCCCCGCCCAGTTCCTCTACCGCCAGTACGACCCGGACTTCCAGTACTGGGAGTTCCTCGGCCAATGGTGGCACGAGCCCACCAACTCCACTTGGGGTAACGGCACCTGGGCCGGCCGATGGGCCTTCAACTTCGAGACCGGCAACGTCTTCAGTCTCGACGAGTACGGATACAACCCCCACGGCCAGATCTTCTCCACGATCGGCACCGAGGGCTCTGACCAGCCCGTCGTGCCCCAGCTCACCAGCATCCACGACATGCTCTGGGTGTCCGGCAACGTCTCTCGCAATGGCTCTGTCTCGTTCACCCCGAACATGGCGGGCTTCCTCGACTGGGGCTTCTCCTCTTACGCAGCTGCCGGAAAGGTCCTCCCCTCGACTTCTCTGCCCTCGACGAAGAGCGGCGCCCCGGACCGCTTCATCTCGTACGTCTGGCTGTCCGGTGACCTGTTCGAACAGGCCGAAGGGTTCCCCACGAACCAGCAGAATTGGACCGGTACGCTGTTGCTTCCGCGAGAGTTGCGCGTGCTGTATATCCCCAACGTGGTGGACAATGCTCTGGCTCGGGAATCTGGTGCCTCGTGGCAGGTCGTGAGCAGCGATAGCAGTGCGGGCACCGTCGAGCTGCAGACCCTGGGTATCTCCATTGCCCGGGAAACCAAGGCCGCCCTGCTGTCGGGAACGTCGTTCACCGAGTCCGACCGTACTCTGAACAGCAGTGGTGTCGTGCCGTTCAAGCGCTCCCCGTCCGAGAAGTTCTTTGTTTTGTCCGCGCAGCTGTCCTTCCCTGCTTCGGCTAGGGGATCGGGACTCAAGAGTGGATTCCAGATTCTCTCGTCGGAGCTGGAGAGTACTACCGTGTACTACCAGTTCTCGAATGAGTCGATTATCGTCGACCGCAGTAACACCAGTGCTGCGGCGCGCACGACGGATGGTATCGATAGCAGCGCGGAGGCTGGCAAGTTGCGCCTGTTTGACGTGTTGAATGGCGGAGAGCAGGCGATTGAGACGTTGGATTTGACTCTCGTGGTGGATAACTCGGTCTTGGAGATCTATGCCAATGGTCGCTTTGCGTTGAGTACTTGGGTTCGTTCTTGGTACGCCAATTCCACGAACATCAGTTTCTTCCAGAATGGCGTGGGTGGTGTTGCGTTCTCCAACGTGACTGTTTCCGAGGGCTTGTATGATGCTTGGCCGGATCGTCAGTCT 
本发明通过RT-PCR方法克隆了果糖基转移酶基因FWT-01，DNA全序列分析结果表明，果糖基转移酶FWT01的编码基因FWT-01全长1884bp。
将上述果糖基转移酶基因FWT-01序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该序列与来源于A.niger的β-D-呋喃果糖苷酶(suc1)序列相似性最高(98％)，说明FWT01是一种新的果糖基转移酶。
对于P pastoris表达系统，本发明提供了包含上述果糖基转移酶基因FWT-01的重组载体，如pPIC9K。将本发明的果糖基转移酶基因插入至表达载体相应的限制酶切位点，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接，作为本发明的一个最优选实验方案，优选果糖基转移酶基因插入到质粒pPIC9K，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组P.pastoris表达质粒pPIC9K-FWT-01。本发明还提供了包含上述果糖基转移酶基因FWT-01的重组菌株，优选所述菌株为P.pastoris GS115，优选为重组菌株P.pastoris  GS115/FWT-01。
对于E.coli表达系统，本发明采用E.coli表达系统载体，如pET-22b(+)。将果糖基转移酶基因插入E.coli表达载体，获得重组载体。将获得的重组载体，转化E.coli表达系统，如E.coli BL21(DE3)，获得可表达果糖基转移酶的E.coli重组表达菌株。本发明中优选质粒为pET-22b(+)，优选表达宿主为E.coli BL21(DE3)。
对于S.cerevisiae表达系统，本发明采用S.cerevisiae表达系统载体，如pYX212。将果糖基转移酶基因插入S.cerevisiae表达载体，获得重组载体。通过电转化方法，将重组质粒转化S.cerevisiae表达系统，如S.cerevisiae W303-1A，获得果糖基转移酶S.cerevisiae表达菌株。本发明中优选质粒为pYX212，优选表达宿主为S.cerevisiae W303-1A。
本发明还提供了一种制备果糖基转移酶FWT01的方法，包括以下步骤：
1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株。
2)培养重组菌株，诱导(如果是诱导型启动子)、过量表达重组果糖基转移酶。
3)回收并纯化所表达的果糖基转移酶FWT01。
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有优良性质的、可高效催化蔗糖生产高纯度低聚果糖的果糖基转移酶、及其氨基酸序列、基因序列。
附图说明
图1为果糖基转移酶在P.pastoris GS115中的异源表达。
图2为温度对果糖基转移酶酶活力与稳定性影响曲线。
图3为pH对果糖基转移酶酶活力与稳定性影响曲线。
具体实施方式
实施例1：果糖基转移酶在P.pastoris GS115中的异源表达
实验过程中，采用转入pPIC9K空质粒的P.pastoris GS115转化子作为对照株。将6株筛选获得的高拷贝数转化子分别接种25mL BMGY培养基(250mL摇瓶)，30℃，220rpm摇瓶培养24h。进一步将其转接25mL BMMY培养基(250mL摇瓶)，30℃，220rpm摇瓶诱导培养120h，其中每24h补加250μL甲醇。如图1所示，果糖基转移酶高拷贝数阳性转化子P.pastoris 03的胞外果糖基转移酶酶活力最高，可达117.3U/mL。
实施例2：果糖基转移酶在S.cerevisiae W303-1A中的异源表达
将阳性S.cerevisiae重组子接种YPD培养基，30℃发酵56h。随着发酵的逐步进行，果糖基转移酶的产量逐渐增加，当发酵至48h时，酶活达到最大，为19.8U/mL。同时，随着发酵的不断进行，重组S.cerevisiae的菌体浓度也逐渐增加。当发酵至48h时，菌体浓度达到最大，OD600＝3.2。
实施例3：温度对果糖基转移酶酶活力与稳定性的影响
酶最适温度测定时的条件为：温度范围为30～70℃、底物为蔗糖、100mM磷酸-柠檬酸缓冲液(pH 5.5)。在不同温度下测定的最高酶活力设为100％。研究过程中，分析了酶在40℃、50℃、60℃条件下的温度稳定性。在各温度条件下，处理前的初始酶活力设为100％。
如图2A所示，果糖基转移酶的最适反应温度为55℃。当反应温度低于55℃时，随着温度的逐渐升高，果糖基转移酶的酶活力逐渐增加。在最适反应温度(55℃)条件下，果糖基转移酶的酶活力是30℃条件下酶活力的2.3倍。但当温度高于55℃时，随着反应温度的逐渐升高，果糖基转移酶的酶活力迅速降低。当反应温度为70℃时，果糖基转移酶的酶活力仅为55℃时酶活力的25.4％。对于果糖基转移酶的热稳定性，分别分析了酶在40℃、50℃、60℃条件下的稳定性(图2B)。在40℃条件下，处理60min，果糖基转移酶基本不失活(酶活力残留＞95％)，这说明其在该温度条件下稳定。在50℃条件下，处理60min，果糖基转移酶酶活力残留约为60％，这说明其在该温度条件下也较稳定。
实施例4：pH对果糖基转移酶酶活力与稳定性的影响
酶的最适pH是在不同pH条件下进行分析的，如pH 3.0～8.0(磷酸-柠檬酸缓冲液，100mM)。在不同pH条件下测定的最高酶活力设为100％。酶pH稳定性测定的前处理条件为：不同pH缓冲液、25℃保温24h。采用的缓冲液为：磷酸-柠檬酸缓冲液(100mM，pH 3.0～8.0)、磷酸缓冲液(100mM，pH 8.0～9.0)、甘氨酸-NaOH缓冲液(100mM，pH 9.0～11.0)。在不同pH缓冲液处理条件下，测得的最高残留酶活力设为100％。果糖基转移酶的最适pH为5.5(图3A)。当pH＜5.5时(3.0～5.5)，随着pH值的增加，果糖基转移酶的相对酶活力逐渐增大。果糖基转移酶在pH 5.5条件下的酶活力为pH 3.0条件下酶活力的4倍。但当pH＞5.5时，随着pH值的增加，果糖基转移酶的相对酶活力迅速降低。如图3B所示，分析了果糖基转移酶在pH 2.0～11.0条件下的稳定性。在pH 6.0条件下，果糖基转移酶最为稳定。在pH 4.0～9.0条件下，果糖基转移酶的稳定性较高(酶活力残留＞90％)。由此可确定，果糖基转移酶具有较宽的pH稳定范围。实施例5：果糖基转移酶催化蔗糖生产低聚果糖
采用上述果糖基转移酶催化底物蔗糖(600g/L)，40℃条件催化处理12h，采用HPLC测定反应体系中低聚果糖的浓度。通过测定分析计算，确定低聚果糖的含量可达57.3％(w/w)。