皮肤纤维母细胞制剂及其制备方法、应用.pdf

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种皮肤纤维母细胞制剂的制备方法及制得的皮肤纤维母细胞制剂，以及皮肤纤维母细胞制剂在制备促进皮肤修复药物、化妆品、食品、保健品中的应用。本发明提供一种皮肤纤维母细胞制剂的制备方法及制得的皮肤纤维母细胞制剂，以及皮肤纤维母细胞制剂在制备促进皮肤修复药物、化妆品、食品、保健品中的应用。纤维母细胞作用于供体真皮层，能够分泌出具有高活性、高稳定性的成纤维细胞生长因子，促进受损皮肤的康复愈合，修复效果显著提高(P＜0.05)。

权利要求书
1.  一种皮肤纤维母细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：获得皮肤纤维母细胞，培养；
步骤2：待细胞爬出70％以上时，对贴壁细胞消化、终止消化、重悬、计数、接种培养，获得纤维母细胞；
步骤3：消化纤维母细胞，终止消化，离心，弃上清，洗涤，收集沉淀重悬，获得皮肤纤维母细胞制剂。

2.  根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1所述培养采用完全培养基和双抗培养；所述完全培养基包括高糖DMEM培养基+10％FBS；所述双抗为青霉素100U/mL和链霉素100μg/mL；
所述皮肤纤维母细胞接种培养密度为5～10×105cell/mL；
所述双抗的浓度为1％。

3.  根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述消化为采用0.25％胰蛋白酶消化2～3min。

4.  根据权利要求1至3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述终止消化采用完全培养基，所述完全培养基包括高糖DMEM培养基+10％FBS。

5.  根据权利要求1至4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤3所述消化采用胰蛋白酶溶液，所述胰蛋白酶的酶活为50万U/g；所述胰蛋白酶溶液的浓度为0.25％，所述加入胰蛋白酶溶液的体积为淹没过纤维母细胞。

6.  根据权利要求1至5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤3所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为2～3min。

7.  根据权利要求1至6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤3所述离心为1000rpm/min离心5min。

8.  根据权利要求1至7任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤3所述重悬采用生理盐水和白蛋白重悬。

9.  根据权利要求1至8任一项所述的皮肤纤维母细胞制剂的制备方法获得的皮肤纤维母细胞制剂。

10.  根据权利要求9所述的皮肤纤维母细胞制剂在制备皮肤再生修复的药物、化妆品、食品、保健品中的应用。

说明书皮肤纤维母细胞制剂及其制备方法、应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及皮肤纤维母细胞制剂及其制备方法、应用。
背景技术
皮肤创伤修复是一个复杂的生物学过程。纤维母细胞是这一生物过程中的主要修复细胞之一。皮肤纤维母细胞能够大量合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白、糖蛋白等多种细胞外成分，在伤口愈合和免疫调节等方面具有广泛和明显的作用，具有广阔的应用前景。纤维母细胞还能够维持各种生长因子、细胞素、基质金属蛋白酶及金属蛋白酶组织抑制因子的合成与分解平衡；被认为是创伤修复的工程师、建筑者和管理员。了解与控制纤维母细胞的生物学行为是促进软组织损伤修复、创伤愈合、预防瘢痕形成的基础与关键。
目前流通于市面的烧烫伤皮肤再生修复膏。该烫伤膏在中草药高效有机成分提纯基础上，添加了成纤维细胞生长因子(FGF)，从而在具有抗感染，收敛结痂，减少创面渗液的基础上增加了促进上皮细胞生长，促进坏死组织脱落，减轻瘢痕组织增生的作用。
以上所提及的烧烫伤皮肤再生修复膏虽然比传统药物更好的解决了对烧烫伤治疗时间长、易感染、愈后留有疤痕等问题。但是成纤维细胞生长因子(FGF)在常温下容易被降解，难以保持原有的生物活性。
发明内容
有鉴于此，本发明提供皮肤纤维母细胞制剂及其制备方法、应用。纤维母细胞制成活细胞制剂作用于供体真皮层，很好地克服了上述技术问题，纤维母细胞能够马上分泌出成纤维细胞生长因子(FGF)，并且保持很高的活性，在促进皮肤修复的层面上效果更为明显，而且无任何毒副作用，安全可靠。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种皮肤纤维母细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：
本发明提供了一种皮肤纤维母细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：获得皮肤纤维母细胞，培养；
步骤2：待细胞爬出70％以上时，对贴壁细胞消化、终止消化、重悬、计数、接种培养，获得纤维母细胞；
步骤3：消化纤维母细胞，终止消化，离心，弃上清，洗涤，收集沉淀重悬，获得皮肤纤维母细胞制剂。
在本发明的一些具体实施方案中，皮肤纤维母细胞制剂的制备方法中步骤1所述培养采用完全培养基和双抗培养；所述完全培养基包括高糖DMEM培养基+10％FBS；所述双抗为青霉素100U/mL和链霉素100μg/mL；
所述皮肤纤维母细胞接种培养密度为5～10×105cell/mL。
所述双抗的浓度为1％。
在本发明的一些具体实施方案中，皮肤纤维母细胞制剂的制备方法中步骤2所述消化为采用0.25％胰蛋白酶消化2～3min。
在本发明的一些具体实施方案中，皮肤纤维母细胞制剂的制备方法中步骤2所述终止消化采用完全培养基，所述完全培养基包括高糖DMEM培养基+10％FBS。
在本发明的一些具体实施方案中，皮肤纤维母细胞制剂的制备方法中步骤3所述消化采用胰蛋白酶溶液，所述胰蛋白酶的酶活为50万U/g；所述胰蛋白酶溶液的浓度为0.25％，所述加入胰蛋白酶溶液的体积为淹没过纤维母细胞。
在本发明的一些具体实施方案中，皮肤纤维母细胞制剂的制备方法中步骤3所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为2～3min。
在本发明的一些具体实施方案中，皮肤纤维母细胞制剂的制备方法中步骤3所述离心为1000rpm/min离心5min。
作为优选，洗涤采用生理盐水洗涤。
在本发明的一些具体实施方案中，皮肤纤维母细胞制剂的制备方法中步骤3所述重悬采用生理盐水和白蛋白重悬。
本发明还提供了所述皮肤纤维母细胞制剂的制备方法获得的皮肤纤维母细胞制剂。
纤维母细胞不仅可以合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白等成分，还可以分泌一些重要的细胞生长因子如纤维母细胞生长因子(FGF)，并保持着较高的活性，刺激皮肤肉芽组织的形成和促进肉芽组织的上皮化，从而缩短创伤的愈合时间以及减少疤痕的形成。而且是自体的细胞，不存在排斥性，安全可靠。
本发明还提供了所述皮肤纤维母细胞制剂在制备皮肤再生修复的药物、化妆品、食品、保健品中的应用。
本发明提供一种皮肤纤维母细胞制剂的制备方法及制得的皮肤纤维母细胞制剂，以及皮肤纤维母细胞制剂在制备促进皮肤修复药物、化妆品、食品、保健品中的应用。皮肤纤维母细胞制剂的制备方法流程如图1所示，制得的纤维母细胞制剂作用于供体真皮层，很好地克服了上述技术问题，纤维母细胞能够马上分泌出成纤维细胞生长因子(FGF)，并且保持很高的活性，在促进皮肤修复的层面上效果更为明显，而且无任何毒副作用，安全可靠。
1、纤维母细胞来源广泛，易于获取。
2、纤维母细胞能够合成大量胶原蛋白和弹性蛋白，有利于皮肤修复。
3、本发明把纤维母细胞作用于供体真皮层，不具有排斥反应。
4、本发明把纤维母细胞作用于供体真皮层，能够分泌出具有高活性、高稳定性的成纤维细胞生长因子，促进受损皮肤的康复愈合，修复效果显著提高(P＜0.05)。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明提供的皮肤纤维母细胞制剂的制备流程；
图2示显微镜下观察本发明制得的皮肤纤维母细胞制剂中细胞生长状态；放大倍数为(100×)；
图3示流式细胞仪检测P6代细胞表面标记物(Vimentin，CK15)表达情况。
具体实施方式
本发明公开了皮肤纤维母细胞制剂及其制备方法、应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了皮肤纤维母细胞制剂及其制备方法、应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1、纤维母细胞的分离与培养：
1)选取3只形态、年龄相仿的大鼠，在不威胁大鼠生命活动的前提下剥取一点背部皮肤，用含双抗PBS和75％乙醇漂洗干净，剪碎成1mm3组织块。接种于6孔板中，每孔5～6块并添加1mL完全培养基(高糖DMEM培养基+10％FBS)以及1％双抗(青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL)，即10μL。
2)次日换液，往后每2～3天进行换液。
3)待细胞爬出70％以上，移去组织块，并用1mL0.25％胰蛋白酶对贴壁细胞进行消化2～3min，待细胞大部分变圆的时候用1mL完全培养基进行终止消化，对细胞1000rpm/min离心5min，用2mL完全培养基重悬细胞，吸取20μL于倒置显微镜下计数，按5～10×105cell/mL接种于培养皿中培养。
4)每天观察细胞生长状况，并及时换液和传代处理。
5)对纤维母细胞进行形态学鉴定和流式鉴定。
结果：显微镜下观察细胞生长状态，如图2，细胞呈梭形或扁的星状，具有突起，符合成纤维细胞形态特征；流式细胞仪检测P6代细胞表面标记物(Vimentin，CK15)表达情况，如图3，波形蛋白(Vimentin)表达量>95％，角蛋白(CK15)<5％，是纤维母细胞标志。综合以上鉴定结果，可确定该细胞为纤维母细胞。
2、收集纤维母细胞。
1)用0.25％胰蛋白酶37℃消化纤维母细胞3min，用完全培养基(高糖DMEM培养基+10％FBS)终止，1500rpm/min离心5min，弃上清，加入5mL生理盐水清洗2次。
2)弃上清，用2.5mL生理盐水+0.5mL白蛋白重悬纤维母细胞，用5mL注射器吸取悬液制成含有纤维母细胞的制剂备用。
实施例2
把实施例1制备的纤维母细胞作用于相应供体大鼠真皮层，评价损伤皮肤修复效果。
1)分别对3只大鼠背部3处相同部位的毛修剪，并用相同的镊子在火焰下烧烫，对以上3个部位进行同样的损伤处理(1cm2)，但不对大鼠造成生命威胁。
2)对以上3个部位分别进行不同处理，部位1不作任何处理，部位2加入含有纤维母细胞的制剂，而部位3则涂抹烧烫伤皮肤再生修复膏。
3)每天观察背部受伤皮肤康复情况，并做好相应记录。
表1大鼠背部皮肤康复情况记录表(受伤面积)

结果：由表1数据可看出，经过5天的持续观察，3只大鼠背部皮肤受伤面积愈合情况均表现为：部位2<部位3<部位1，即含有纤维母细胞的制剂对于皮肤修复能力要强于烧烫伤皮肤再生修复膏的修复能力，而且由以上数据可以知道，含有纤维母细胞的制剂对于大鼠皮肤康复效果几乎是烧烫伤皮肤再生修复膏效果的两倍，差异显著(P＜0.05)，具有统计学意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。