一种造纸废水复合微生物菌剂的制备方法.pdf

本发明提供了一种造纸废水复合微生物菌剂的制备，将云芝栓孔菌、黄孢原平革菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和产碱假单胞菌与纤维素酶混合制成复合微生物菌剂，纤维素酶能够分解废水中的纤维素成葡萄糖，复合微生物也能将废水中的固形物和木质素等进行降解，本发明的复合微生物菌剂是一种不含化学药品、环保、无毒、无二次污染的微生物菌剂，使用简便，且不受环境因素等的影响，处理废水效果稳定，出水水质达到国家标准。

权利要求书
1.  一种造纸废水复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、活化和扩大培养各菌种：
首先将云芝栓孔菌、黄孢原平革菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和产碱假单胞菌分别在固体培养基平板上进行活化，然后将活化后各个固体培养基上的单菌落分别进行液体培养基扩大培养，使菌体含量达到1.0×108-1.0×109个/mL；
步骤2、离心分离、干燥得到各微生物菌粉：
将步骤1扩大培养得到的各个微生物菌液经过离心分离，收集沉淀即为微生物菌体，干燥后得到各个微生物菌粉；
步骤3、制备复合微生物菌剂：
将步骤2得到的云芝栓孔菌、黄孢原平革菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和产碱假单胞菌的菌粉与纤维素酶混合制成复合微生物菌剂，以质量份数计，其中云芝栓孔菌15-30份、黄孢原平革菌10-20份、枯草芽孢杆菌10-20份、短小芽孢杆菌3-10份、产碱假单胞菌5-20份、纤维素酶1-3份。

2.  根据权利要求1所述的一种造纸废水复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述云芝栓孔菌和黄孢原平革菌的液体培养基为KH2PO4 1.0g，Na2HPO4 0.2g，MgSO4·7H2O 0.5g，VB1 0.1mg，CaCl2 0.1mg，FeSO4·7H2O 0.1mg，ZnSO4·7H2O 0.01mg，CuSO4·5H2O 0.2mg，葡萄糖1.0g，酒石酸铵0.1g和蒸馏水1L混合均匀，并调节pH值为5-6；
所述枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的液体培养基为葡萄糖20g，蛋白胨15g，牛肉膏0.5g，NaCl 5g和蒸馏水1L混合均匀，并调节pH值为7.0；
所述产碱假单胞菌的液体培养基为胰蛋白胨10g，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，甘油10mL和蒸馏水1L混合均匀，并调节pH值为7.2；
以上各菌种的固体培养基为在其液体培养基中加入15g琼脂粉制成，液体培养基和固体培养基均要经过121℃灭菌30min。

3.  根据权利要求1所述的一种造纸废水复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述纤维素酶活力为1-10万U/g。

4.  根据权利要求1所述的一种造纸废水复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述液体培养基扩大培养为在28-30℃培养。

5.  根据权利要求1所述的一种造纸废水复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述液体培养基扩大培养包括三角瓶一级扩大培养和发酵罐二级扩大培养。

6.  根据权利要求5所述的一种造纸废水复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述液体培养基扩大培养具体包括以下步骤，首先将各个菌种的液体培养基加入三角瓶中，然后将各个固体培养基上的单菌落分别接入相对应的三角瓶中，培养至各个三角瓶中菌体含量达到1.0×108-1.0×109个/mL；然后将各个菌种的液体培养基加入发酵罐中，并将三角瓶中的菌体接入相对应的发酵罐中，培养至各个发酵罐中菌体含量达到1.0×108-1.0×109个/mL。

7.  根据权利要求1所述的一种造纸废水复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤二的干燥温度为30-40℃。

说明书一种造纸废水复合微生物菌剂的制备方法
技术领域
本发明涉及污水处理技术领域，尤其涉及一种造纸废水复合微生物菌剂的制备。
背景技术
造纸工业中废水是一种水量大、悬浮物含量大、色度高、有机物浓度高的难处理有机废水，使用的原料以稻草、木材、芦苇、破布为主，经过高温高压蒸煮而分离出纤维素，制成纸浆。
造纸废水又分为浆造纸废水、洗浆漂白中段造纸废水和抄纸工序中生成的白水，制纸浆造纸废水俗称黑液，黑液中含有大量的纤维素、色素、木质素和无机盐等；而中段水和白水中则有大量纤维素和填料等，造纸废水中黑液是危害最大的，它的污染物占到造纸工业污染排放总量的90％以上，由于黑液颜色深、碱性大、泡沫多，臭味重、并且大量消耗水中的溶解氧，严重污染水源，给人类健康和环境都带来危害，目前采用传统多介质过滤、砂滤、活性炭过滤工艺对废水回用处理，也只能在一定程度上降低水中悬浮物浓度，对废水中的氨氮、可溶性污染物、COD和盐分等无法进一步除去，传统的活性污泥法就是利用活性污泥对废水进行处理，它会受到环境等因素影响而应用受限制。
发明内容
本发明根据造纸废水特有的污染物，提供一种复合微生物菌剂，能有效降低废水中固形物含量，改善水体颜色，使出水水质达到国家排放标准。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案包括以下步骤：
步骤1、活化和扩大培养各菌种：
首先将云芝栓孔菌、黄孢原平革菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和产碱假单胞菌分别在固体培养基平板上进行活化，然后将活化后各个固体培养基上的单菌落分别进行液体培养基扩大培养，使菌体含量达到1.0×108-1.0×109个/mL；
步骤2、离心分离、干燥得到各微生物菌粉：
将步骤1扩大培养得到的各个微生物菌液经过离心分离，收集沉淀即为微生物菌体，干燥后得到各个微生物菌粉；
步骤3、制备复合微生物菌剂：
将步骤2得到的云芝栓孔菌、黄孢原平革菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和产碱假单胞菌的菌粉与纤维素酶混合制成复合微生物菌剂，以质量份数计，其中云芝栓孔菌15-30份、黄孢原平革菌10-20份、枯草芽孢杆菌10-20份、短小芽孢杆菌3-10份、产碱假单胞菌5-20份、纤维素酶1-3份。
所述云芝栓孔菌和黄孢原平革菌的液体培养基为KH2PO41.0g，Na2HPO40.2g，MgSO4·7H2O 0.5g，VB10.1mg，CaCl20.1mg，FeSO4·7H2O 0.1mg，ZnSO4·7H2O 0.01mg，CuSO4·5H2O 0.2mg，葡萄糖1.0g，酒石酸铵0.1g和蒸馏水1L混合均匀，并调节pH值为5-6；
所述枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的液体培养基为葡萄糖20g，蛋白胨15g，牛肉膏0.5g，NaCl 5g和蒸馏水1L混合均匀，并调节pH值为7.0；
所述产碱假单胞菌的液体培养基为胰蛋白胨10g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，甘油10mL和蒸馏水1L混合均匀，并调节pH值为7.2；
以上各菌种的固体培养基为在其液体培养基中加入15g琼脂粉制成，液体培养基和固体培养基均要经过121℃灭菌30min。
所述纤维素酶活力为1-10万U/g。
所述液体培养基扩大培养为在28-30℃培养。
所述液体培养基扩大培养包括三角瓶一级扩大培养和发酵罐二级扩大培养。
所述液体培养基扩大培养具体包括以下步骤，首先将各个菌种的液体培养基加入三角瓶中，然后将各个固体培养基上的单菌落分别接入相对应的三角瓶中，培养至各个三角瓶中菌体含量达到1.0×108-1.0×109个/mL；然后将各个菌种的液体培养基加入发酵罐中，并将三角瓶中的菌体接入相对应的发酵罐中，培养至各个发酵罐中菌体含量达到1.0×108-1.0×109个/mL。
所述步骤二的干燥温度为30-40℃。
本发明中提到的复合微生物为云芝栓孔菌、黄孢原平革菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和产碱假单胞菌，具体为：
云芝栓孔菌(Trametes versicolor)CGMCC No.5987；
黄孢原平革菌(Phanerochaete chrysosporium)CGMCC No.5776；
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillus)CGMCC No.17408；
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CGMCC No.1326
产碱假单胞菌(Pseudomonas alacaligenes)CGMCC No.11805。
本发明提到的上述菌种均可以从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)购买得到。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果，本发明针对造纸废水的特点设计了一种复合微生物菌剂，单独扩大各个菌种，采用了逐级扩大培养，可达到各菌种的最优化生产，在此基础上将微生物与纤维素酶相结合，使废水中多余的纤维素分解为葡萄糖可作为微生物的碳源，微生物对废水中的木质素进行降解，使废水水质得到净化，达到国家排放标准；而且本发明的出水效果好且无二次污染，因此在造纸废水处理方面，本发明前景可观。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步地说明，所述是对本发明的解释而不是限制，任何扩大培养使菌体浓度达到要求的培养方式均可。
本发明中提到的复合微生物为云芝栓孔菌、黄孢原平革菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和产碱假单胞菌，具体为：
云芝栓孔菌(Trametes versicolor)CGMCC No.5987；
黄孢原平革菌(Phanerochaete chrysosporium)CGMCC No.5776；
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillus)CGMCC No.17408；
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CGMCC No.1326
产碱假单胞菌(Pseudomonas alacaligenes)CGMCC No.11805。
本发明提到的上述菌种均可以从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)购买得到。
本发明实施例涉及到的各菌种的液体培养基：
云芝栓孔菌和黄孢原平革菌的液体培养基为KH2PO41.0g，Na2HPO40.2g，MgSO4·7H2O0.5g，VB10.1mg，CaCl20.1mg，FeSO4·7H2O 0.1mg，ZnSO4·7H2O 0.01mg，CuSO4·5H2O 0.2mg，葡萄糖1.0g，酒石酸铵0.1g和蒸馏水1L混合均匀，并调节pH值为5-6；
枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的液体培养基为葡萄糖20g，蛋白胨15g，牛肉膏0.5g， NaCl 5g和蒸馏水1L混合均匀，并调节pH值为7.0；
产碱假单胞菌的液体培养基为胰蛋白胨10g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，甘油10mL和蒸馏水1L混合均匀，并调节pH值为7.2；
本发明实施例涉及到的各菌种的固体培养基：
以上各菌种的固体培养基为在其液体培养基中加入15g琼脂粉制成，液体培养基和固体培养基均要经过121℃灭菌30min。
实施例1
步骤1、活化和扩大培养各菌种：
首先将云芝栓孔菌、黄孢原平革菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和产碱假单胞菌分别在固体培养基平板上进行活化；然后，将各个菌种的液体培养基加入不同的三角瓶中，并将各个固体培养基上的单菌落分别接入相对应的三角瓶中，在28-30℃下培养至各个三角瓶中菌体含量达到1.0×108-1.0×109个/mL；然后将各个菌种的液体培养基加入不同的发酵罐中，并将三角瓶中的菌体接入相对应的发酵罐中，在28-30℃下培养至各个发酵罐中菌体含量达到1.0×108-1.0×109个/mL；
步骤2、离心分离、干燥得到各微生物菌粉：
将步骤1发酵罐扩大得到的各个微生物菌液经过离心分离，收集沉淀即为微生物菌体，30℃干燥得到各个微生物菌粉；
步骤3、制备复合微生物菌剂：
将步骤2的云芝栓孔菌、黄孢原平革菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和产碱假单胞菌菌粉与纤维素酶混合制成复合微生物菌剂，以质量份数计，其中云芝栓孔菌20份、黄孢原平革菌15份、枯草芽孢杆菌10份、短小芽孢杆菌3份、产碱假单胞菌5份、纤维素酶3份，其中纤维素酶活力为1-10万U/g。
实施例2
步骤1、活化和扩大培养各菌种：
首先将云芝栓孔菌、黄孢原平革菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和产碱假单胞菌分别在固体培养基平板上进行活化；然后，将各个菌种的液体培养基加入不同的三角瓶中，并将各个 固体培养基上的单菌落分别接入相对应的三角瓶中，在28-30℃下培养至各个三角瓶中菌体含量达到1.0×108-1.0×109个/mL；然后将各个菌种的液体培养基加入不同的发酵罐中，并将三角瓶中的菌体接入相对应的发酵罐中，在28-30℃下培养至各个发酵罐中菌体含量达到1.0×108-1.0×109个/mL；
步骤2、离心分离、干燥得到各微生物菌粉：
将步骤1发酵罐扩大得到的各个微生物菌液经过离心分离，收集沉淀即为微生物菌体，35℃干燥得到各个微生物菌粉。
步骤3、制备复合微生物菌剂：
将步骤2的云芝栓孔菌、黄孢原平革菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和产碱假单胞菌菌粉与纤维素酶混合制成复合微生物菌剂，以质量比计，其中云芝栓孔菌25份、黄孢原平革菌10份、枯草芽孢杆菌15份、短小芽孢杆菌5份、产碱假单胞菌15份、纤维素酶1份，其中纤维素酶活力为1-10万U/g。
实施例3
步骤1、活化和扩大培养各菌种：
首先将云芝栓孔菌、黄孢原平革菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和产碱假单胞菌分别在固体培养基平板上进行活化；然后，将各个菌种的液体培养基加入不同的三角瓶中，并将各个固体培养基上的单菌落分别接入相对应的三角瓶中，在28-30℃下培养至各个三角瓶中菌体含量达到1.0×108-1.0×109个/mL；然后将各个菌种的液体培养基加入不同的发酵罐中，并将三角瓶中的菌体接入相对应的发酵罐中，在28-30℃下培养至各个发酵罐中菌体含量达到1.0×108-1.0×109个/mL；
步骤2、离心分离、干燥得到各微生物菌粉：
将步骤1发酵罐扩大得到的各个微生物菌液经过离心分离，收集沉淀即为微生物菌体，35℃干燥得到各个微生物菌粉。
步骤3、制备复合微生物菌剂：
将步骤2的云芝栓孔菌、黄孢原平革菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和产碱假单胞菌菌粉与纤维素酶混合制成复合微生物菌剂，以质量比计，其中云芝栓孔菌15份、黄孢原平革菌 13份、枯草芽孢杆菌20份、短小芽孢杆菌9份、产碱假单胞菌10份、纤维素酶2份，其中纤维素酶活力为1-10万U/g。
实施例4
步骤1、活化和扩大培养各菌种：
首先将云芝栓孔菌、黄孢原平革菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和产碱假单胞菌分别在固体培养基平板上进行活化；然后，将各个菌种的液体培养基加入不同的三角瓶中，并将各个固体培养基上的单菌落分别接入相对应的三角瓶中，在28-30℃下培养至各个三角瓶中菌体含量达到1.0×108-1.0×109个/mL；然后将各个菌种的液体培养基加入不同的发酵罐中，并将三角瓶中的菌体接入相对应的发酵罐中，在28-30℃下培养至各个发酵罐中菌体含量达到1.0×108-1.0×109个/mL；
步骤2、离心分离、干燥得到各微生物菌粉：
将步骤1发酵罐扩大得到的各个微生物菌液经过离心分离，收集沉淀即为微生物菌体，40℃干燥得到各个微生物菌粉。
步骤3、制备复合微生物菌剂：
将步骤2的云芝栓孔菌、黄孢原平革菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和产碱假单胞菌菌粉与纤维素酶混合制成复合微生物菌剂，以质量比计，其中云芝栓孔菌20份、黄孢原平革菌20份、枯草芽孢杆菌15份、短小芽孢杆菌10份、产碱假单胞菌8份、纤维素酶3份，其中纤维素酶活力为1-10万U/g。
实施例5
步骤1、活化和扩大培养各菌种：
首先将云芝栓孔菌、黄孢原平革菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和产碱假单胞菌分别在固体培养基平板上进行活化；然后，将各个菌种的液体培养基加入不同的三角瓶中，并将各个固体培养基上的单菌落分别接入相对应的三角瓶中，在28-30℃下培养至各个三角瓶中菌体含量达到1.0×108-1.0×109个/mL；然后将各个菌种的液体培养基加入不同的发酵罐中，并将三角瓶中的菌体接入相对应的发酵罐中，在28-30℃下培养至各个发酵罐中菌体含量达到1.0×108-1.0×109个/mL；
步骤2、离心分离、干燥得到各微生物菌粉：
将步骤1发酵罐扩大得到的各个微生物菌液经过离心分离，收集沉淀即为微生物菌体，38℃干燥得到各个微生物菌粉。
步骤3、制备复合微生物菌剂：
将步骤2的云芝栓孔菌、黄孢原平革菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和产碱假单胞菌菌粉与纤维素酶混合制成复合微生物菌剂，以质量比计，其中云芝栓孔菌30份、黄孢原平革菌16份、枯草芽孢杆菌18份、短小芽孢杆菌8份、产碱假单胞菌20份、纤维素酶2份，其中纤维素酶活力为1-10万U/g。
实施例6
步骤1、活化和扩大培养各菌种：
首先将云芝栓孔菌、黄孢原平革菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和产碱假单胞菌分别在固体培养基平板上进行活化；然后，将各个菌种的液体培养基加入不同的三角瓶中，并将各个固体培养基上的单菌落分别接入相对应的三角瓶中，在28-30℃下培养至各个三角瓶中菌体含量达到1.0×108-1.0×109个/mL；然后将各个菌种的液体培养基加入不同的发酵罐中，并将三角瓶中的菌体接入相对应的发酵罐中，在28-30℃下培养至各个发酵罐中菌体含量达到1.0×108-1.0×109个/mL；
步骤2、离心分离、干燥得到各微生物菌粉：
将步骤1发酵罐扩大得到的各个微生物菌液经过离心分离，收集沉淀即为微生物菌体，30℃干燥得到各个微生物菌粉。
步骤3、制备复合微生物菌剂：
将步骤2的云芝栓孔菌、黄孢原平革菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和产碱假单胞菌菌粉与纤维素酶混合制成复合微生物菌剂，以质量比计，其中云芝栓孔菌28份、黄孢原平革菌18份、枯草芽孢杆菌15份、短小芽孢杆菌10份、产碱假单胞菌13份、纤维素酶1份，其中纤维素酶活力为1-10万U/g。
本发明采用了逐级扩大培养，可达到各菌种的最优化生产，在此基础上将微生物与纤维素酶相结合，使废水中多余的纤维素分解为葡萄糖可作为微生物的碳源，微生物对废水中的木质 素进行降解，使废水水质得到净化，达到国家排放标准；而且本发明的出水效果好且无二次污染，因此在造纸废水处理方面前景可观。