转化虎杖苷的虎杖内生菌株烟曲霉J3菌株.pdf

一种转化虎杖苷的虎杖内生菌株，其分类命名为烟曲霉J3(Aspergillus fumigatus)J3菌株，已于2015年3月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2015161。该菌株于含底物10mg虎杖苷的PDB培养基中进行生物转化发酵培养。经分离纯化后的生物转化产物组分B在体外具有清除DPPH·自由基和OH·自由基的能力，且清除OH·自由基的能力强于底物虎杖苷。如此，本发明菌株J3能对虎杖苷进行生物转化，形成抗氧化活性更高的衍生物，为天然抗氧化活性药物筛选提供了更多先导化合物。

权利要求书
1.  一种转化虎杖苷的虎杖内生菌株，其分类命名为烟曲霉J3(Aspergillus  fumigatus)J3菌株，已于2015年3月25日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为CCTCC M2015161。

2.  一种制备虎杖内生菌发酵液的方法，其特征在于，所述方法是将权利要 求1所述菌株接入含底物10mg虎杖苷的PDB培养基中进行生物转化发酵培养。

3.  如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵条件为：接种量18-22％， 温度26-29℃，转速160-200r/min，时间90-98h。

4.  如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵条件为：接种量20％， 温度28℃，转速180r/min，时间96h。

5.  如权利要求2-4中任一项所述方法制得的发酵液。

6.  如权利要求1所述的菌株在转化虎杖苷为更高抗氧化活性物质中的应用。

7.  如权利要求1所述的菌株在制备天然抗氧化活性药物中的应用。

8.  如权利要求5所述的发酵液在制备天然抗氧化活性药物中的应用。

说明书转化虎杖苷的虎杖内生菌株烟曲霉J3菌株
技术领域
本发明涉及一种虎杖内生菌，具体涉及一种能转化虎杖苷形成具抗氧化活性 物质的虎杖内生菌J3菌株。
背景技术
虎杖为蓼科蓼属多年生草本植物，其干燥的根茎中富含虎杖苷，含量可达 2.55％。虎杖苷化学名为3,4'-5-三羟基二苯乙烯-3-β-D-葡萄糖苷，属二苯乙烯 类多酚物质，具有保护心血管、抗血栓、降血脂、镇咳平喘、抗氧化和抗病原 微生物等多种药理作用。在植物中虎杖苷以稳定的反式异构体为主，糖基为主 要取代基，近年来研究发现，虎杖苷的两羟基、糖基或苯环上的氢被甲基或异 戊烯基等基团取代，形成的衍生物或类似物也具有多种生物活性，并被广泛应 用于食品、医药、保健品、植物保护等领域，故虎杖苷及其衍生物的研究引起 广泛关注。
为获得新颖结构虎杖苷类活性衍生物，现常用的途径有化学方法合成或改 造其结构及微生物转化，但化学方法副产物多、反应步骤繁琐、污染环境，而 微生物转化具有区域和立体选择性强、操作简单、反应条件温和、成本低廉等 优点，能完成一些化学方法难以实现的反应。
植物内生菌是生活在植物健康组织内不引起宿主植物出现明显病害症状的 一类微生物。大量研究表明，从虎杖根茎中可分离得到具转化能力的内生菌， 由于虎杖内生菌与宿主虎杖互惠共利协同进化，具有特定生活史，以虎杖内生 菌为反应器对虎杖中虎杖苷进行发酵转化有其天然协调性，对发现新的高活性、 高稳定性、低毒副作用的衍生物或类似物具有重要意义。因此，近年来研究虎 杖内生菌转化虎杖苷形成衍生物或类似物成为热点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种虎杖 内生菌J3菌株，该菌株能转化虎杖苷形成具抗氧化活性物质。
本发明所述的虎杖内生菌J3，其分类命名为烟曲霉J3(Aspergillus  fumigatus)J3菌株，已于2015年3月25日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2015161。
本发明菌株J3的特性如下：
采用点植法将本发明菌株J3分别点种于CYA、MEA、G25N、CA、PDA平板中 心，25℃培养7天。本发明菌株J3在G25N、CA培养基中生长速度较慢，在CYA、 MEA培养基中生长速度中等，在PDA培养基中生长最快。各培养基下菌落形态、 大小、颜色变化较大，具体如下：
CYA培养基：菌落表面有较明显放射状沟纹和皱缩，边缘整齐，中心突起， 正面中央青灰色、边缘白色菌丝、有明显环带、孢子青灰色，反面浅黄色；
PDA培养基：菌落表面平整、绒状，边缘整齐，中心小突起，正面淡绿色、 无明显环带、孢子黑色，反面菌丝淡绿色；
MEA培养基：菌落表面平整、有较明显环带，边缘整齐，中心平整，正面中 心区白色、向外呈青灰色、边缘白色、孢子青灰色，反面中央青色，边缘菌丝白 色；
CA培养基：菌落表面平整、绒状、有较明显环带、中央具明显褶皱，边缘绒 毛状，中心突起、褶皱，正面中心区青绿色，有明显环带、边缘白色绒状菌丝， 反面中央青色，边缘菌丝白色；
G25N培养基：菌落表面有较明显放射状沟纹和皱缩，边缘绒毛状，中心有凹 陷，正面呈青绿色、菌落边缘为白色菌丝，反面呈浅黄褐色，有黄褐色渗出液， 具焦香味。
光学显微镜下观察本发明菌株J3，菌丝细长、交织分布，有隔膜，无假根， 分生孢子梗发生于菌丝，顶囊烧瓶形，分生孢子圆球形、光滑。
根据菌株的菌落、显微形态特征，参考《真菌鉴定手册》和《常见及常用 真菌》，初步鉴定该菌株为半知菌亚门丛梗孢目丛梗孢科曲霉属真菌。
采用天根试剂盒法提取本发明菌株J3菌丝体的总DNA，选用通用引物 ITS1/ITS4扩增ITS-5.8S rDNA基因序列。序列与GenBank数据库中BLAST同源性 比对，结果表明：本发明菌株J3与烟曲霉Aspergillus fumigatus(NR 121481.1) 同源性最高，相似性为100％，命名为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)J3。
将本发明菌株J3接入含底物10mg虎杖苷的PDB培养基中进行生物转化， 制得发酵液，发酵条件为：接种量18-22％，温度26-29℃，转速160-200r/min， 时间90-98h，最佳发酵条件为：接种量为20％，温度为28℃、转速为180r/min， 时间为96h。
利用大孔吸附树脂、高效液相色谱分离纯化生物转化产物；得到的转化产 物组分B在体外具有清除DPPH·自由基和OH·自由基的能力，且清除OH·自由基 的能力强于底物虎杖苷。本发明菌株J3能对虎杖苷进行生物转化，形成抗氧化 活性更高的衍生物，为天然抗氧化活性药物筛选提供了更多先导化合物。
附图说明
图1是HPLC分离样品图谱。
具体实施方式
实施例1 本发明菌株J3的制备
取从湖南省涟源采集的野生虎杖茎杆，用无菌水冲洗干净，然后用灭菌滤 纸吸干水分，75％乙醇浸泡消毒3-5min，无菌水冲洗3-4次，0.1％升汞消毒30s， 再用75％乙醇消毒1min。将根、茎秆韧皮部切去，取木质部用无菌剪刀剪成0.5cm ×0.5cm的小块。无菌水冲洗3-4次，于灭菌的研钵中研磨成浆液。研磨浆液无 菌水稀释10倍后，移取1ml研磨稀释液，在初筛培养基上常规涂布。每种材料 平行3次，分别在28℃培养72-120h，挑选长势良好的不同形态菌落于PDA平 板上划线分离，28℃培养72h后，取单菌落3次重复划线分离，得到纯化的本 发明菌株转接到PDA斜面保藏备用。
实施例2 本发明菌株J3发酵液的制备
将本发明菌株J3接种至PDA斜面培养基中28℃、72h活化，然后以20％接 种量接入转化培养基即含底物10mg虎杖苷的PDB培养基(PDB培养基：马铃薯 200克、葡萄糖20克、水1000毫升，自然pH)中，28℃、180r/min生物转化 96h，制得发酵液。
实施例3 本发明菌株J3发酵液生物转化产物的分离纯化
将上述制得的发酵液10000r/min离心10min，除去菌丝体和杂质，收集上 清液。取3L上清液，经300g AB-8大孔树脂吸附，依次用30％、50％、70％、90％、 无水乙醇解吸，直至各段流出液无色，分别收集，以氯仿：甲醇为5:1作为展 开剂，根据TLC跟踪检测转化产物(与已知6种标准品虎杖苷、白藜芦醇、α- 葡萄素、ε-葡萄素、紫檀芪及氧化白藜芦醇TLC展开后Rf值不同的展开点为 目标组分)，合并Rf值相同的收集液体、浓缩；用制备薄层色谱(PTLC)分离 浓缩液，氯仿：甲醇(5:1)展开，刮下Rf值一致的目标组分展开点，收集刮 下的硅胶粉，装柱，冲洗展开剂，蒸干，最后采用高效液相色谱(HPLC)进行 纯化，得转化产物，HPLC图谱见图1，出现两个主要吸收峰A和B，出峰时间(Rt) 分别为2.552、10.166min，说明本发明菌株通过生物转化形成了两物质A和B， 按此图谱手动收集各吸收峰。
上述HPLC条件为：色谱柱为ODS-C18(4.6mm×250mm，5μm)，流速 1.0mL/min，柱温25℃，紫外检测波长306nm，流动相为甲醇和水，梯度程序： 0-5min甲醇为80％-40％；5-20min甲醇为40％-35％；20-25min甲醇为35％-30％； 25-30min甲醇为30％-0；30-35min甲醇为0。
实施例4 转化产物抗氧化活性测定
准确称取各标准品(虎杖苷、白藜芦醇、α-葡萄素、ε-葡萄素、紫檀芪、 氧化白藜芦醇)、VC、BHT及转化产物(A和B)，用无水乙醇配制成浓度分别为 0.01、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2μg/mL的待测液，于4℃冰箱避光保存备 用。
1)清除DPPH·自由基能力测定
精确配制0.1mmol/L DPPH·无水乙醇溶液，摇匀，于4℃冰箱避光保存备 用。分别在1.0mL DPPH·溶液中加入1.0mL不同浓度的待测样品，混匀放置30min 后，以无水乙醇为参比，于517nm处测定吸光度，即为Ai；用1.0mL溶剂取代 1.0mL待测样品，同样条件下测定吸光度，即为A0；用1.0mL溶剂取代DPPH·溶 液所测吸光值即为Aj，以VC、BHT为阳性对照，按下式计算DPPH·清除率(Y)： Y(％)＝[1–(Ai-Aj)/A0]×100％。
IC50表示清除率为50％时体系中的供试物浓度，即半数清除浓度，IC50值越 小表明清除能力越强，抗氧化能力越高。以清除率为纵坐标，各供试物浓度为 横坐标，建立回归方程，计算IC50，并进行显著性分析，结果见表1。
表1 各样品清除DPPH·自由基及OH·自由基的IC50

注：同列不同小写字母表示在0.05水平显著差异。
由上表可知，各物质清除DPPH·自由基的能力强弱依次为VC＞氧化白藜芦 醇＞白藜芦醇＞ε-葡萄素>BHT＞虎杖苷＞紫檀芪＞B＞α-葡萄素＞物质A。由 此可知，经本发明菌株J3转化后分离得的物质A无清除DPPH·自由基能力，物 质B具有清除DPPH·自由基能力，且清除能力强于α-葡萄素，但比底物虎杖 苷及其它4种虎杖苷衍生物(氧化白藜芦醇、白藜芦醇、ε-葡萄素、紫檀芪) 弱。
2)清除OH·自由基能力测定
精确配制6mmol/L水杨酸溶液、6mmol/L H2O2溶液、6mmol/L FeSO4溶液， 摇匀，于4℃冰箱避光保存备用。采用水杨酸法，分别加入6mmol/L的FeSO4溶 液0.7mL，不同浓度待测样品各0.7mL，6mmol/L的水杨酸溶液0.7mL，最后加 入6mmol/L的H2O2溶液0.7mL启动反应，摇匀，静置30min后，以无水乙醇为 参比，于510nm处测定各反应体系的吸光度AX；0.7mL溶剂取代待测样品测吸 光度A0；同时用蒸馏水代替双氧水，测得本底吸收吸光度AX0，以VC、BHT为阳 性对照，根据下式计算待测液的清除率(Y)：Y(％)＝[1-(AX-AX0)/A0]×100％。
以清除率为纵坐标，各供试物浓度为横坐标，建立回归方程，计算IC50，并 进行显著性分析，结果见上表1。IC50值越小表明清除能力越强，抗氧化能力越 高。
由表1可知，各物质清除OH·自由基的能力强弱依次为VC＞白藜芦醇＞BHT ＞紫檀芪＞α-葡萄素＞B＞虎杖苷＞ε-葡萄素＞氧化白藜芦醇＞物质A。由此 可知，经本发明菌株J3转化后分离得的物质A无清除OH·自由基能力，B具清 除OH·自由基能力，且清除能力比底物虎杖苷及ε-葡萄素、氧化白藜芦醇更 强，但弱于白藜芦醇、紫檀芪及α-葡萄素。
由上分析可知，本发明菌株经生物转化物质B在体外具清除DPPH·自由基 和OH·自由基的能力，且清涂OH·自由基能力强于底物虎杖苷。表明，本发明 菌株经生物转化发酵形成了具有比原来底物作用更强的抗氧化活性物质。