一种辅酶Q10提取新工艺.pdf

本发明属于生物技术领域，公开了一种辅酶Q10提取新工艺，以辅酶Q10发酵液为原料，通过有机溶剂萃取、碱醇皂化、硅胶柱层析、无水乙醇结晶、抽滤、真空干燥得到辅酶Q10产品。本发明工艺操作简单、污染低、对仪器设备要求低和成本低廉。

权利要求书
1.  一种从发酵液中提取辅酶Q10的新工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤： 1)将深红酵母(Rhodotorula rubra)ATCC74283、球形红细菌 (Rhodobacter sphaeroides)ATCC17025和脱氮副球菌(Paracoccus  denitrificans)ATCC19367分别培养至成浓度为1×108个/mL的菌液，按照1∶ 1∶2的体积比混合得到混合菌液，然后按照5％的接种量接种于发酵培养基，培 养温度29℃，100rpm摇床培养30小时得到发酵液；
2)在4000-5000rpm下离心步骤1)所得发酵液30min，分离上清液与菌体细胞， 将菌体细胞洗至中性，60℃烘干后粉碎；将粉碎的菌体细胞与正己烷按质量比 1-2∶2-3混合，混匀后磁力搅拌浸提，温度55-60℃，浸提1.5-2h，然后经微 滤膜过滤，收集提取液和截留物；
3)将步骤2)得到的提取液和碱醇溶液按体积比1-2∶2-3混合，振荡5min，静 置分层，取有机相，在温度55-60℃真空度0.04-0.06Mpa条件下，旋转蒸发浓 缩，所得浓缩液用正己烷重溶；
4)对步骤3)所得液体进行硅胶柱层析，然后在温度55-60℃，真空度 0.04-0.06Mpa条件下旋转蒸发浓缩；将所得浓缩液溶解于无水乙醇中，0-4℃冷 藏过夜，抽真空过滤得辅酶Q10胶体；最后在温度2-10℃条件下真空干燥，即得 辅酶Q10产品；
5)将步骤2)所得上清液和截留物合并得到复合物A，然后往复合物A中添加豆 粕、酒糟、水稻秸秆粉以及麦麸，2000rpm搅拌10min，通入蒸汽升温至100℃， 蒸馏30分钟；然后将蒸馏物烘干，粉碎机粉碎制得饲料；其中，复合物A、豆 粕、酒糟、水稻秸秆粉以及麦麸的质量比为100∶3∶2∶1∶1。

2.  根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述碱醇溶液为：氯化钠80g、氢 氧化钠20g、甲醇80mL，余量为水，定容至1L。

3.  根据权利要求1或2所述的工艺，其特征在于，所述发酵培养基为：葡萄糖 10g，蛋白胨5g，(NH4)2SO45g，KH2PO41.0g，Na2HPO40.5g，MgSO40.5g，水1000mL， pH7.0。

4.  根据权利要求1或3所述的工艺，其特征在于，所述微滤膜为无机陶瓷膜， 截留分子量为2000Da，微滤温度为40℃。

说明书一种辅酶Q10提取新工艺
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及辅酶Q10的提取方法，尤其涉及一种从发酵液中 提取辅酶Q10的新工艺。
背景技术
辅酶Q10是一种脂溶性天然维生素类物质，在生物体内起递氢的作用，是生命体不可 缺少的重要元素之一。辅酶Q10作为细胞代谢的激活剂和天然抗氧化剂在心血管疾病的治 疗中起着重要作用，还可提高人体免疫力，已成为生物医药领域研究的热点。近年来也 广泛应用于保健品、化妆品和食品行业中。
目前辅酶Q10的生产方法主要有动植物组织提取法、化学合成法和微生物发酵法。动 植物组织提取法原料来源有限、目标产物含量低，因此成本较高，不利于工业化生产； 化学合成法主要采用茄尼醇和3，4，5-三甲氧基甲苯为原料合成辅酶Q10，化学合成茄尼 醇得到的是顺、反异构体的混合物，异构体分离困难、副产物较多，提纯成本高，因此 化学合成法生产辅酶Q10也受到限制；微生物发酵法具有原料来源丰富、反应条件温和、 产品生物活性好、可实现工业化生产等优点，是最具发展潜力的辅酶Q10生产方法。目前 的微生物发酵法仍然有需要改进的地方。根据目前的报道，在用微生物发酵法生产辅酶 Q10时，菌体浓度和产品产率较低，这使得生产成本偏高，企业利润率大大降低。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是，克服了现有技术中存在的不足之处，提供了一种从 发酵液中提取辅酶Q10的新工艺，该工艺操作简单，产率和纯度高，能够实现废物利用， 并且合理配伍菌株，大大提高了发酵效率，可大规模推广使用。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的：
一种从发酵液中提取辅酶Q10的新工艺，包括如下步骤：
1)将深红酵母(Rhodotorula rubra)ATCC 74283、球形红细菌 (Rhodobacter sphaeroides)ATCC 17025和脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans) ATCC 19367分别培养至成浓度为1×108个/mL的菌液，按照1∶1∶2的体积比混合得到 混合菌液，然后按照5％接种量，将混合菌液接种于发酵培养基，培养温度29℃，100rpm 摇床培养30小时得到发酵液；
2)在4000-5000rpm下离心步骤1)所得发酵液30min，分离上清液与菌体细胞，将菌体 细胞洗至中性，60℃烘干后粉碎；将粉碎的菌体细胞与正己烷按质量比1-2∶2-3混合， 混匀后磁力搅拌浸提，温度55-60℃，浸提1.5-2h，然后经微滤膜过滤，收集提取液和 截留物；
3)将步骤2)得到的提取液和碱醇溶液按体积比1-2∶2-3混合，振荡5min，静置分层， 取有机相，在温度55-60℃，真空度0.04-0.06Mpa旋转蒸发浓缩，所得浓缩液用正己烷 重溶；
4)对步骤3)所得液体进行硅胶柱层析，然后在温度55-60℃，真空度0.04-0.06Mpa条 件下旋转蒸发浓缩；将所得浓缩液溶解于无水乙醇中，0-4℃下冷藏过夜，抽真空过滤得 辅酶Q10胶体；最后在温度2-10℃条件下真空干燥，即得；
5)将步骤2)所得上清液和截留物合并得到复合物A，然后往复合物A中添加豆粕、酒 糟、水稻秸秆粉以及麦麸，2000rpm搅拌10min，通入蒸汽升温至100℃，蒸馏30分钟； 然后将蒸馏物烘干，粉碎机粉碎制得饲料；其中，复合物A、豆粕、酒糟、水稻秸秆粉以 及麦麸的质量比为100∶3∶2∶1∶1。
优选地，
所述碱醇溶液为：氯化钠80g、氢氧化钠20g、甲醇80mL，余量为水，定容至1L。
所述发酵培养基为：葡萄糖10g，蛋白胨5g，(NH4)2SO4 5g，KH2PO4 1.0g，Na2HPO4 0.5g， MgSO4 0.5g，水1000mL，pH 7.0。
所述微滤膜为无机陶瓷膜，截留分子量为2000Da，微滤温度为40℃。
本发明所述菌种均可以从美国模式培养物集存库(ATCC)等商业渠道购买得到；其 培养方式可按照现有技术来完成，其并未本发明的创新点，此处并不一一赘述。
本发明的技术方案具有以下突出优点及独特性：
本发明在现有技术的基础上，通过大量试验发现，采用三种菌液按照一定比例混合， 各菌株之间具备一定的协同作用，比常规的单一菌株发酵方法，能够大大提高辅酶Q10 的产量，其他条件不变的前提下，较产量较酵母单一菌株发酵可提高20％以上。
本发明采用有机溶剂-碱醇皂化萃取相结合的方法，有机溶剂萃取成本低、对辅酶Q10破坏性较小；碱醇皂化能去除脂肪酸甘油酯和及各种游离脂肪酸，是适用于大规模生产 的提取方法。
本发明选用特殊皂化液，避免采用单一碱溶液(如氢氧化钠溶液)皂化产生乳化现 象；又避免碱性-乙醇溶液皂化使辅酶Q10的甲氧基和乙醇的乙氧基换位，从而导致新杂 质的产生；产率和纯度均可提高10％以上。
本发明在提取辅酶Q10过程中，对菌体蛋白、大分子多糖等进行回收利用，几乎无废 水外排，避免此类物质的废液对环境造成的污染，绿色环保；而且获得了营养丰富的菌 体蛋白饲料，变废为宝，增加经济效益。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体 实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本 申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人 员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范 围。
实施例1
一种从发酵液中提取辅酶Q10的新工艺，其包括如下步骤：
1)将深红酵母(Rhodotorula rubra)ATCC74283(可参见US5474919A)、球形红细菌 (Rhodobacter sphaeroides)ATCC17025(可参见Journal of Biological Chemistry2001， V276，No44，P41161-41164)和脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)ATCC 19367(可参见 J.Bacteriol.April 1996V178，No7，p1866-1871)分别培养至成浓度为1×108个/mL 的菌液，按照1∶1∶2的体积比混合得到混合菌液，然后按照5％(v/v)接种量，接种于 发酵培养基(葡萄糖10g，蛋白胨5g，(NH4)2SO4 5g，KH2PO41.0g，Na2HPO40.5g，MgSO40.5g， 水1000mL，pH 7.0)，培养温度29℃，100rpm摇床培养30小时得到发酵液，测得细胞干 重为120g/L；
2)在4000rpm下离心发酵液30min，分离上清液与菌体细胞，将菌体细胞洗至中性，60 ℃烘干后粉碎；将粉碎的菌体细胞与正己烷按质量比1∶2混合，混匀后磁力搅拌浸提， 温度55℃，浸提1.5h，经微滤膜过滤，收集提取液和截留物；所述微滤膜为无机陶瓷膜， 截留分子量为2000Da，过滤温度为40℃；
3)将步骤2)得到的提取液和碱醇溶液(1L溶液中含氯化钠80g、氢氧化钠20g、甲醇 80mL，余量为水)按体积比1∶2混合，振荡5min，静置分层，取有机相，在温度55℃， 真空度0.04Mpa旋转蒸发浓缩，所得浓缩液用正己烷重溶；
4)对步骤3)所得液体进行硅胶柱层析，采用含3％(V/V)异丙醚的正己烷溶液进行洗 脱，洗脱流速为每小时1倍柱体积，洗脱至无明显黄色为止；然后将所得辅酶Q10洗脱液 在温度55℃，真空度0.04Mpa条件下旋转蒸发浓缩；将所得浓缩液溶解于无水乙醇中，0 ℃下冷藏过夜，抽真空过滤得辅酶Q10胶体；最后在温度2℃条件下真空干燥，即得。按 照100kg菌体干重计算，产量为5786.5g辅酶Q10，含量为998.7mg/g，纯度为99.87％； 检测方法参照(参照中国药典2005年版HPLC法)。
5)将步骤2)所得上清液和截留物合并得到复合物A，然后往复合物A中添加豆粕、酒 糟、水稻秸秆粉以及麦麸，2000rpm搅拌10min，通入蒸汽升温至100℃，蒸馏30分钟； 然后将蒸馏物烘干，粉碎机粉碎制得饲料；其中，复合物A、豆粕、酒糟、水稻秸秆粉以 及麦麸的质量比为100∶3∶2∶1∶1。
实施例2
一种从发酵液中提取辅酶Q10的新工艺，其包括如下步骤：
1)将深红酵母(Rhodotorula rubra)ATCC 74283、球形红细菌 (Rhodobacter sphaeroides)ATCC 17025和脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans) ATCC 19367分别培养至成浓度为1×108个/mL的菌液，按照1∶1∶2的体积比混合得到 混合菌液，然后按照5％(v/v)接种量，接种于发酵培养基(葡萄糖10g，蛋白胨5g，(NH4)2SO45g，KH2PO41.0g，Na2HPO40.5g，MgSO40.5g，水1000mL，pH 7.0)，培养温度29℃，100rpm 摇床培养30小时得到发酵液，测得细胞干重为120g/L；
2)在5000rpm下离心发酵液30min，分离上清液与菌体细胞，将菌体细胞洗至中性，60 ℃烘干后粉碎；将粉碎的菌体细胞与正己烷按质量比2∶2混合，混匀后磁力搅拌浸提， 温度60℃，浸提2h，经微滤膜过滤，收集提取液和截留物；所述微滤膜为无机陶瓷膜， 截留分子量为2000Da，过滤温度为40℃；
3)将步骤2)得到的提取液和碱醇溶液(1L溶液中含氯化钠80g、氢氧化钠20g、甲醇 80mL，余量为水)按体积比2∶3混合，振荡5min，静置分层，取有机相，在温度60℃， 真空度0.06Mpa旋转蒸发浓缩，所得浓缩液用正己烷重溶；
4)对步骤3)所得液体进行硅胶柱层析，采用含5％(V/V)异丙醚的正己烷溶液进行洗 脱，洗脱流速为每小时2倍柱体积，洗脱至无明显黄色为止；然后将所得辅酶Q10洗脱液 在温度60℃，真空度0.06Mpa条件下旋转蒸发浓缩；将所得浓缩液溶解于无水乙醇中，4 ℃下冷藏过夜，抽真空过滤得辅酶Q10胶体；最后在温度10℃条件下真空干燥，即得。按 照100kg菌体干重计算，产量为5692.7g辅酶Q10，含量为998.3mg/g，纯度为99.83％； 检测方法参照(参照中国药典2005年版HPLC法)。
5)将步骤2)所得上清液和截留物合并得到复合物A，然后往复合物A中添加豆粕、酒 糟、水稻秸秆粉以及麦麸，2000rpm搅拌10min，通入蒸汽升温至100℃，蒸馏30分钟； 然后将蒸馏物烘干，粉碎机粉碎制得饲料；其中，复合物A、豆粕、酒糟、水稻秸秆粉以 及麦麸的质量比为100∶3∶2∶1∶1。
实施例3
选取60天的仔猪200头，分为两个组别，每组100头，其中实验组用本实施例1制 备的饲料饲养，对照组用通威中大猪饲料；其他饲养条件两个组完全相同。饲养9周之 后检测各项指标参见表1。
表1
指标 实验组 对照组 试验初始个体重(kg) 21.4 21.5 试验终止个体重(kg) 71.6 68.9 日增重(kg) 0.797 0.752 头均消耗料(kg) 110 108 料重比 2.19 2.28
结论：本发明制备的饲料饲养效果较好，日增重以及料重比优于市场常用猪饲料， 并且成本较市售饲料低廉。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范 围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人 员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。