一种不同分子量Β壳聚糖的制备方法.pdf

本发明属于海洋化学工程技术，具体涉及一种不同分子量β-壳聚糖的制备方法。以乙酸溶解β-壳聚糖，在过氧化氢的作用下，采用微波辅助方法降解高分子量、高粘度的β-壳聚糖，得不同分子量的β-壳聚糖。本发明方法简单、高效，重复性好，可广泛应用于工业及相关产业生产，为β-壳聚糖的开发与应用奠定理论基础。

权利要求书
1.  一种不同分子量β-壳聚糖的制备方法,其特征在于:以乙酸溶解β- 壳聚糖，在过氧化氢的作用下，采用微波辅助方法降解高分子量、高粘度 的β-壳聚糖，得不同分子量的β-壳聚糖。

2.  按权利要求1所述的不同分子量β-壳聚糖的制备方法,其特征在 于：将分子量为2000-6000KDa的β-壳聚糖溶于乙酸中，获得浓度为1-3％ (wt)的β-壳聚糖，而后加入的过氧化氢，在400-800w的微波作用下， 反应温度为70-90℃，即可获得不同分子量的β-壳聚糖。

3.  按权利要求2所述的不同分子量β-壳聚糖的制备方法,其特征在 于：以乙酸溶解2000-6000KDa的β-壳聚糖，在加入浓度0.5-3％过氧化 氢，经过氧化氢催化作用下，于70-90℃，500-800r/min的搅拌转速下， 采用微波方法降解溶解并催化后的高分子量、高粘度的β-壳聚糖，降解 10-40min即可得分子量低至10KDa左右的β-壳聚糖，微波降解时间延长 至60-180min，可获得分子量8-3KDa的β-壳聚糖。

4.  按权利要求2所述的不同分子量β-壳聚糖的制备方法,其特征在 于：以乙酸溶解2000-6000KDa的β-壳聚糖，在加入浓度达10-20％的过氧 化氢，经过氧化氢催化作用下，于70-90℃，500-800r/min的搅拌转速 下，采用微波方法降解溶解并催化后的高分子量、高粘度的β-壳聚糖， 降解10min时即可获得5KDa左右的β-壳聚糖，降解30min时即可获得分 子量可达到2KDa左右的β-壳聚糖,降解时间延长至60min即可获得1KDa 左右的β-壳寡糖。

说明书一种不同分子量β-壳聚糖的制备方法
技术领域
本发明属于海洋化学工程技术，具体涉及一种不同分子量β-壳聚糖 的制备方法。
背景技术
β-壳聚糖多存在于软体动物软骨中，有异于α-壳聚糖的螺旋结构， 为空间平行结构，具有很好的生物活性、生物安全性、化学可修饰性等。 因此，继α-壳聚糖以后，近年来β-壳聚糖的开发与应用受到了广泛关 注，有效应用于医药、食品、工业絮凝等多个方面。然而，天然制备的β -壳聚糖分子量通常较高，多在2000KDa以上，溶解性困难，且粘度较 大。这与其原料所具备的高分子量有极大关系，在食品、农业、保健品的 应用、开发方面造成阻碍，且不同分子量的β-壳聚糖所表现出的化学、 生物活性也有极大不同。因此为了更好研究β-壳聚糖分子量对其吸附 性、降解性、亲和性、抑菌性等各项生物活性的影响及相关关系，我们迫 切需要一种简单有效的方法制备不同分子量的β-壳聚糖。由于结构的不 同，β-壳聚糖与α-壳聚糖在制备和降解方面也存在着一定差异，初期β -壳聚糖分子量表现出较快的下降趋势，但在制备小分子量β-壳聚糖时却 面临较大困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种不同分子量β-壳聚糖的制备方法。
为实现上述目的本发明采用的技术方案为：
一种不同分子量β-壳聚糖的制备方法,以乙酸溶解β-壳聚糖，在过 氧化氢的作用下，采用微波辅助方法降解高分子量、高粘度的β-壳聚 糖，得不同分子量的β-壳聚糖。
进一步的说，将分子量为2000-6000KDa的β-壳聚糖溶于乙酸中，获 得浓度为1-3％(wt)的β-壳聚糖，而后加入的过氧化氢，在400-800w的 微波作用下，反应温度为70-90℃，即可获得不同分子量的β-壳聚糖。
再进一步说，以乙酸溶解2000-6000KDa的β-壳聚糖，在加入浓度 0.5-3％过氧化氢，经过氧化氢催化作用下，于70-90℃，500-800r/min的 搅拌转速下，采用微波方法降解溶解并催化后的高分子量、高粘度的β- 壳聚糖，降解10-40min即可得分子量低至10KDa左右的β-壳聚糖，微波 降解时间延长至60-180min，可获得分子量8-3KDa的β-壳聚糖。
更进一步的说，以乙酸溶解2000-6000KDa的β-壳聚糖，在加入浓度 达10-20％的过氧化氢，经过氧化氢催化作用下，于70-90℃，500- 800r/min的搅拌转速下，采用微波方法降解溶解并催化后的高分子量、高 粘度的β-壳聚糖，降解10min时即可获得5KDa左右的β-壳聚糖，降解 30min时即可获得分子量可达到2KDa左右的β-壳聚糖,降解时间延长至 60min即可获得1KDa左右的β-壳寡糖。
本发明的优点
1.本发明采用微波辅助条件下制备不同分子量β-壳聚糖的方法，同 时在较高的过氧化氢浓度和较长的反应时间下，均未对β-壳聚糖的构型 造成任何的影响。其采用微波辅助反应条件有利于β-壳聚糖分子量的降 解，使得高分子量的β-壳聚糖能够快速简单的制备成不同目标分子量的 β-壳聚糖，使其在实际应用中更加方便灵活，为今后研究分子量对β-壳 聚糖的吸附、抑菌、免疫等多项活性的影响奠定基础，进一步扩大其在医 疗、食品、化学修饰等方面的应用。
2.本发明制备不同分子量β-壳聚糖的方法相比于酶法等其他方法， 具有所需试剂较少、操作简单、耗时低，环境污染小等特点。
3.本发明制备不同分子量β-壳聚糖的方法重复性好、条件可控，通 过对微波时间、反应温度和过氧化氢浓度的控制，可有效制备不同目标分 子量的β-壳聚糖。
4.本发明制备不同分子量β-壳聚糖的方法在微波辅助条件下，控制 反应温度和过氧化氢浓度，可在较短的时间内制备得到分子量1KDa左右 的β-壳寡糖，由于其高粘度、难溶解的特性，这是其他方法所不可比拟 的。
5.本发明全面探讨了不同浓度过氧化氢对微波辅助降解β-壳聚糖的 影响，发现在0.5-3％的过氧化氢浓度下，β-壳聚糖分子量可快速有效的 降解至10KDa左右，延长时间可显著降低β-壳聚糖的分子量到3KDa左 右。将过氧化氢浓度提高到6-20％，则能快速有效的降解分子量至1-5KDa 左右。但与α-壳聚糖不同的是，对于α-壳聚糖的降解延长反应时间和增 加过氧化氢浓度，对分子量影响相对较小。
附图说明
图1A为本发明实施例提供的β-壳聚糖原料高效液相谱图，β-壳聚 糖原料分子量为4717KDa；
图1B为本发明实施例提供的获得分子量为5743Da的低分子量β-壳 聚糖高效液相谱图；
图1C为本发明实施例提供的获得分子量为1271Da的低分子量β-壳 聚糖高效液相谱图。
图2A为为本发明实施例提供分子量为4717KDa的β-壳聚糖红外色谱 图；
图2B为本发明实施例提供的获得分子量为5743Da的低分子量β-壳 聚糖红外色谱图；
图2C为本发明实施例提供的获得分子量为1271Da的低分子量β-壳 聚糖红外色谱图。
由上述图2A-2C中在1670cm-1附近，β-壳聚糖只有一个氨基峰，而 另一氨基峰则位于1580cm-1附近，符合β-壳聚糖结构特征，表明在分子 量降解过程中，并没有发生构型的变化。
具体实施例
下面结合说明书附图对本发明作进一步说明，并且本发明的保护范围 不仅局限于以下实施例。
本发明将β-壳聚糖溶于乙酸后，控制微波反应时间、反应温度和过 氧化氢浓度能有效、可控的制备不同目标分子量的β-壳聚糖。当高分子 量、高粘度β-壳聚糖降低到一定分子量时，不再受粘度对搅拌的干扰因 素影响后，分子量随着微波时间的增加而降低，后趋于平衡。T同时增加 过氧化氢的用量，可有效提高β-壳聚糖的降解效率、获得更低分子量的 β-壳聚糖。
实施例1
称取12gβ-壳聚糖，分子量为4717KDa、脱乙酰度为91.04％，溶解于 400mL 2％(体积浓度)的冰乙酸溶液，搅拌溶解直至获得澄清、均质的浓 度为3％(质量浓度)的β-壳聚糖。取多个100ml微波反应器，每个反应 器中加入上述溶解后的β-壳聚糖50ml，而后分别加入30％过氧化氢 1.5mL，在600W，70℃条件下，搅拌转速为600r/min，分别反应10min、 15min、20min、25min、30min、40min、60min、80min、100min、 180min，将获得不同的反应溶液透析、冻干并进行分子量及结构的测定 (参见图1A、图1B、图2A和图2B)。采用高效凝胶排阻色谱对β-壳聚 糖降解产物的重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)进行分析(表1)。 具体分析条件如下，色谱柱：TSK G3000-PWXL、TSK G5000-PWXL；流动 相：0.2M醋酸/0.1M醋酸钠溶液；流速：G3000-0.8mL/min，G5000- 0.6mL/min；柱温：30℃；检测器：示差检测器。样品浓度为0.4％ (w％)。采用不同分子量的葡聚糖2000000,1100000，670000,410000, 270000,80000,50000,25000，12000，5000，1000Da，对凝胶色谱柱进 行校准。
分子量为4717KDa、脱乙酰度为91.04％的β-壳聚糖可通过市售获 得，或是按如下方式制备获得：
将日本枪乌贼(Loligo Japonica)软骨表面的组织残留物清洗干净 后烘干，称取500g鱿鱼骨置于过量的4％的盐酸中浸泡7h，洗净至中性后 置于过量的1％的氢氧化钠中，90℃水浴反应3h，洗净至中性烘干，即得 β-甲壳素，称重170g，产率为34％。称取170gβ-甲壳素，将其粉碎(粉 碎成末，无杂质，即60目左右)后与40(wt)％的氢氧化钠溶液按照质量 体积比1:8的比例混合95℃反应6小时,获得133gβ-壳聚糖，产率为 78.24％，紫外光谱法测定脱乙酰度为91.04％、高效液相法测定分子量为 4717KDa(参见图1A、2A)。
表1：2％过氧化氢浓度下不同微波时间对分子量的影响

实施例2
称取12gβ-壳聚糖，分子量为4717KDa、脱乙酰度为91.04％，溶解于 400ml体积浓度比为2％的冰乙酸溶液，搅拌溶解直至获得澄清的、均质的 浓度为3％的β-壳聚糖。取多个100ml微波反应器，每个反应器中加入上 述溶解后的β-壳聚糖50ml，再依次向反应器加入不同量的30％过氧化 氢，不同量的30％过氧化氢为0.5mL、1mL、1.5mL、3mL、4mL、5mL、 10ml，600W，70℃条件下，700r/min。反应不同时间，将获得的溶液分别 采用透析袋透析2-3天清除盐离子、高压50℃旋蒸后减压冻干，并进行分 子量及结构的测定(参见图1A、图1C、图2A和图2C)。采用高效凝胶排 阻色谱对β-壳聚糖降解产物的重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)进 行分析(参见表2和表3)。具体分析条件如下，色谱柱：TSK G3000- PWXL、TSK G5000-PWXL；流动相：0.2M醋酸/0.1M醋酸钠溶液；流速： G3000-0.8mL/min，G5000-0.6mL/min；柱温：30℃；检测器：示差检测 器。样品浓度为0.4％(w％)。采用不同分子量的葡聚糖2000000, 1100000，670000,410000,270000,80000,50000,25000，12000， 5000，1000Da，对凝胶色谱柱进行校准。
表2：不同过氧化氢浓度对微波降解β-壳聚糖分子量的影响

表3：较高浓度过氧化氢对微波降解β-壳聚糖分子量的影响