检测EZH2基因的引物和方法.pdf

本发明公开了检测骨髓增生异常综合征，特别是检测骨髓增生异常综合征患者EZH2基因突变的引物和方法，其包括(i)扩增EZH2基因第7、8、17号外显子序列的引物；采用Sanger测序技术和测序引物。本发明可快速地将骨髓增生异常综合征患者体内EZH2基因第7、8、17号外显子的突变检测出来。利用本发明完成的检测结果准确，可以为是髓系恶性血液病（包括MDS）提示不良预后指标。

权利要求书
1.  检测EZH2基因的引物，其特征在于，包括：
扩增EZH2基因的引物，其碱基序列为：
EZH2-7 F： TGTAAAACGACGGCCAGTTTTTGTTTTTGACTGACTGGCA
EZH2-7 R：AACAGCTATGACCATGAAACAAAGTGTAGTGGCTCATCC
EZH2-8 F：TGTAAAACGACGGCCAGTATTCTTGATAACACCATGCACAA
EZH2-8 R：AACAGCTATGACCATGCAGAGCAATCCTCAAGCAACA
EZH2-17 F： TGTAAAACGACGGCCAGTGGTCCAGTATTCACTCTGTGCG
EZH2-17 R：AACAGCTATGACCATGCACTGACCTCTACCCTCGTTTC。

2.  如权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括测序引物，其碱基序列为：
检测EZH2基因的测序引物碱基序列为：
CQ F：TGTAAAACGACGGCCAGT
CQ R：AACAGCTATGACCATG。

3.  如权利要求1所述的引物，其特征在于，引物序列EZH2-7 F和EZH2-7 R是扩增EZH2基因第7外显子序列的引物，引物序列EZH2-8 F和EZH2-8 R是扩增EZH2基因第8外显子序列的引物，引物序列EZH2-17 F和EZH2-17 R是扩增EZH2基因第17外显子序列的引物。

4.  如权利要求2所述的引物，其特征在于，引物序列CQ-F和CQ-R是测序EZH2基因扩增产物包含第7、8、17号外显子序列的引物。

5.  检测EZH2基因多态热点突变情况的方法，包括以下步骤：
抽提血液中的组织DNA；
用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
对步骤2中的扩增产物进行测序；
对测序结果进行判断，确定EZH2基因是否发生突变；
其中PCR扩增引物为：
EZH2-7 F： TGTAAAACGACGGCCAGTTTTTGTTTTTGACTGACTGGCA
EZH2-7 R：AACAGCTATGACCATGAAACAAAGTGTAGTGGCTCATCC
EZH2-8 F：TGTAAAACGACGGCCAGTATTCTTGATAACACCATGCACAA
EZH2-8 R：AACAGCTATGACCATGCAGAGCAATCCTCAAGCAACA
EZH2-17 F： TGTAAAACGACGGCCAGTGGTCCAGTATTCACTCTGTGCG
EZH2-17 R：AACAGCTATGACCATGCACTGACCTCTACCCTCGTTTC。

6.  如权利要求5所述的方法，其特征在于，测序引物碱基序列为：
CQ F：TGTAAAACGACGGCCAGT
CQ R：AACAGCTATGACCATG。

说明书检测EZH2基因的引物和方法
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测EZH2基因第7、8、17号外显子突变率的引物，采用普通PCR技术和Sanger测序，可用于快速检测骨髓增生异常综合征患者体内EZH2基因多态位点的突变情况。
背景技术
骨髓增生异常综合征(MDS)是一组异质性克隆性疾病，其特征是血细胞减少，髓系细胞一系或多系发育异常，无效造血，骨髓造血功能衰竭以及演变为急性髓系白血病的风险增加，近年来发现MDS患者存在表观遗传调节子(epigenetic regulator)基因如EZH2等基因的突变，提示这些基因的突变可能参与了MDS的发生。
EZH2基因位于人类第7号染色体上，总长76978bp，共20个外显子。EZH2基因编码的蛋白为一组蛋白甲基转移酶。EZH2基因在MDS中突变率达6％，多亚型均可见，难治性贫血(RA)是MDS相对早期阶段，在这类患者中检测到EZH2突变，说明该基因异常是疾病发生的早期事件。EZH2基因可能参与MDS发病机制，Bejar等运用基因测序及质谱基因分型法对493例诊断为MDS的患者检测了18种基因的点突变，对这些突变进行COX多因素回归分析发现，EZH2突变与患者的外周血小板数减少、血红蛋白含量降低、骨髓幼稚细胞数量增加有明确联系，EZH2突变对整体生存率有预后不良的趋势。另外Nikoloski等和Ernst等通过对EZH2发生的缺失、错义及移码突变的研究发现，EZH2突变是髓系恶性血液病(包括MDS)的不良预后指标。目前导致MDS的具体机制尚不明确，但对EZH是的突变检测无疑能一定程度上提示不良预后。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测EZH2基因多态突变热点的引物，采用PCR技术，可用于快速检测骨髓增生异常综合征患者体内EZH2基因多态位点的突变情况。所述检测EZH2基因多态热点突变情况的引物，包括：
扩增EZH2基因的引物，其碱基序列为：
EZH2-7F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTTTGTTTTTGACTGACTGGCA
EZH2-7R：AACAGCTATGACCATGAAACAAAGTGTAGTGGCTCATCC
EZH2-8F：TGTAAAACGACGGCCAGTATTCTTGATAACACCATGCACAA
EZH2-8R：AACAGCTATGACCATGCAGAGCAATCCTCAAGCAACA
EZH2-17F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGTCCAGTATTCACTCTGTGCG
EZH2-17R：AACAGCTATGACCATGCACTGACCTCTACCCTCGTTTC。
进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：
检测EZH2基因的测序引物碱基序列为：
CQ F：TGTAAAACGACGGCCAGT
CQ R：AACAGCTATGACCATG。
进一步地，引物序列EZH2-7F和EZH2-7R是扩增EZH2基因第7外显子序列的引物，引物序列EZH2-8F和EZH2-8R是扩增EZH2基因第8外显子序列的引物，引物序列EZH2-17F和EZH2-17R是扩增EZH2基因第17外显子序列的引物。
本发明还提供了检测EZH2基因第7、8、17号外显子突变情况的方法，包括以下步骤：
1.抽提血液/中的DNA；
2.用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
3.对步骤2中的扩增产物进行测序；
4.对测序结果进行判断，确定EZH2基因是否发生突变；
其中PCR扩增引物为：
扩增EZH2基因的引物，其碱基序列为：
EZH2-7F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTTTGTTTTTGACTGACTGGCA
EZH2-7R：AACAGCTATGACCATGAAACAAAGTGTAGTGGCTCATCC
EZH2-8F：TGTAAAACGACGGCCAGTATTCTTGATAACACCATGCACAA
EZH2-8R：AACAGCTATGACCATGCAGAGCAATCCTCAAGCAACA
EZH2-17F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGTCCAGTATTCACTCTGTGCG
EZH2-17R：AACAGCTATGACCATGCACTGACCTCTACCCTCGTTTC。
进一步地，测序引物碱基序列为：
检测EZH2基因的测序引物碱基序列为：
CQ F：TGTAAAACGACGGCCAGT
CQ R：AACAGCTATGACCATG。
本发明还提供了一种检测EZH2基因多态突变位点的试剂盒，包括：
(i)血液DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR扩增反应液；
(iii)测序体系试剂；
其中PCR扩增反应液引物为：
(ⅰ)扩增EZH2基因的引物，其碱基序列为：
EZH2-7F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTTTGTTTTTGACTGACTGGCA
EZH2-7R：AACAGCTATGACCATGAAACAAAGTGTAGTGGCTCATCC
EZH2-8F：TGTAAAACGACGGCCAGTATTCTTGATAACACCATGCACAA
EZH2-8R：AACAGCTATGACCATGCAGAGCAATCCTCAAGCAACA
EZH2-17F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGTCCAGTATTCACTCTGTGCG
EZH2-17R：AACAGCTATGACCATGCACTGACCTCTACCCTCGTTTC。
进一步地，测序引物碱基序列为：
CQ F：TGTAAAACGACGGCCAGT
CQ R：AACAGCTATGACCATG。
有益效果：本发明设计了扩增EZH2第7、8、17号外显子序列的引物。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。EZH2基因的突变类型不定，因此本发明所述引物既能将所述EZH2全部7、8、17外显子序列都扩增出来，也保证无论外显子的何处位置发生突变，都不会出现漏检的情况。相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计多个探针，成本高，检测难度大。
附图说明
图1为EZH2基因在染色体上定位图。
图2为EZH2-7F/R的电泳图，M为Marker DL 2000，1-24为送检的MDS患者血液样本1-24号，如图2所示，引物EZH2-7F/R扩增有效，且条带单一。
图3为EZH2-8F/R的电泳图，M为Marker DL 2000，1-24为送检的MDS患者血液样本1-24号，如图3所示，引物EZH2-8F/R扩增有效，且条带单一。
图4为EZH2-17F/R的电泳图，M为Marker DL 2000，1-24为送检的MDS患者血液样本1-24号，如图4所示，引物EZH2-17F/R扩增有效，且条带单一。
图5、6、7分别为样本1、2、3的EZH2第7、8、17号外显子野生型测序截图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常 规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
一种检测EZH2基因多态突变位点的引物，该引物的设计是针对EZH2突变热点所设计的特异性扩增引物，包括：
扩增EZH2基因包含第7、8、17号外显子序列的引物，其碱基序列为：
EZH2-7F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTTTGTTTTTGACTGACTGGCA
EZH2-7R：AACAGCTATGACCATGAAACAAAGTGTAGTGGCTCATCC
EZH2-8F：TGTAAAACGACGGCCAGTATTCTTGATAACACCATGCACAA
EZH2-8R：AACAGCTATGACCATGCAGAGCAATCCTCAAGCAACA
EZH2-17F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGTCCAGTATTCACTCTGTGCG
EZH2-17R：AACAGCTATGACCATGCACTGACCTCTACCCTCGTTTC
一种检测EZH2基因多态突变位点的试剂盒，包括
(i)血液DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR反应液；
(iii)测序体系试剂；
其中，组织DNA抽提试剂可购自天根DNA抽提试剂盒等商品化试剂。
检测体系PCR扩增反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNA Polymer ase(1U/μl)；EZH2基因第7、8、17号外显子序列的上、下游引物EZH2-7-F(10μM)、EZH2-7-R(10μM)、EZH2-8-F(10μM)、EZH2-8-R(10μM)、EZH2-17-F(10μM)、EZH2-17-R(10μM)。
测序体系试剂包括：测序纯化液(ExoI:0.6U，CIP:1.2U)、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：检测EZH2基因第7、8、17号外显子序列的上、下游引物分别为CQ-F(3.2μm)、CQ-R(3.2μm)，以及Bigdye Terminator V3.1(购买自美国Applied Biosystems公司)。
实施例2
血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
(1)抽提血液中的组织DNA：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。3)加入200μl缓冲 液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份19μl分装：
X＝19μl反应液×(n份标本+1份空白对照)
n为检测标本数。
(3)加样：加入检测体系PCR反应液中1μl DNA；空白对照加1μl生理盐水或不加任何物质。
(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国Applied Biosystems公司)等。反应条件如下：

PCR扩增体系试剂配制方法如下：


其中，引物序列为：

(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110V，25min，凝胶成像系统观察。
如图2、3、4所示，即为24例MDS患者血液样本以EZH2-7F/R、EZH2-8F/R、EZH2-17F/R引物扩增后所得产物的电泳图谱。本发明扩增的片段长度分别为397bp、525bp、266bp，通过电泳图的分析表明本发明所述EZH2-7F/R、EZH2-8F/R、EZH2-17F/R扩增有效，且条带单一。
(6)Sanger测序：
取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：

将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：

测序反应程序：

沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50μl70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl Hi-Di后进行变性试验。变性程序：

变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。
(7)结果判断：分别将测序结果与EZH2野生型参考序列(Genbank accn：NC_000017.14)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
取24例MDS患者的临床样本(样本编号为1-24)按实施例1和2的试剂和方法提取基因组、配制试剂、扩增和测序。每份样本加入检测体系PCR反应液中1μl。电泳结果如图2、3、4所示，表明本发明所述引物EZH2-7F/R、EZH2-8F/R、EZH2-17F/R对血液样本能有效扩增，且条带单一。
样本1、2、3的检测结果如图5、6、7所示：
图5显示是样本1的EZH27号外显子野生型测序截图，说明样本1的7号外显子未发生突变。
图6显示是样本2的EZH28号外显子野生型测序截图，说明样本2的8号外显子未发生突变。
图7显示是样本3的EZH217号外显子野生型测序截图，说明样本3的17号外显子未发生突变。
从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把外显子序列包括在内了，能够扩展出EZH2基因第7、8、17号外显子，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确的扩展出EZH2基因第7、8、17号外显子，无论是野生型还是突变型。对阳性标本的检测表明本发明所述引物和方法及试剂盒能够检测出EZH2基因突变。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  上海艾迪康医学检验所有限公司
 
<120>  检测EZH2基因的引物和方法
 
<130> 
 
<160>  8    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  40
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
tgtaaaacga cggccagttt ttgtttttga ctgactggca                           40
 
 
<210>  2
<211>  39
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
aacagctatg accatgaaac aaagtgtagt ggctcatcc                            39
 
 
<210>  3
<211>  41
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
tgtaaaacga cggccagtat tcttgataac accatgcaca a                         41
 
 
<210>  4
<211>  37
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
aacagctatg accatgcaga gcaatcctca agcaaca                              37
 
 
<210>  5
<211>  40
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
tgtaaaacga cggccagtgg tccagtattc actctgtgcg                           40
 
 
<210>  6
<211>  38
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  6
aacagctatg accatgcact gacctctacc ctcgtttc                             38
 
 
<210>  7
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  7
tgtaaaacga cggccagt                                                   18
 
 
<210>  8
<211>  16
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  8
aacagctatg accatg                                                     16