一种雷帕霉素的分离纯化方法.pdf

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种雷帕霉素的分离纯化方法。针对现有生产技术中存在的工艺繁琐，生产时间周期长，生产成本高，收率低，产品纯度低等不足，本发明提供一种雷帕霉素的提纯方法，利用吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus ACCC No.40417)，通过微生物发酵培养出含雷帕霉素的发酵液，雷帕霉素发酵液经种子培养、接种前准备、接种、多阶段溶氧控制、分批补料发酵阶段，并采用菌丝体收集、浸提、萃取、活性炭吸附、硅胶柱层析、及冷却析晶技术得到雷帕霉素。本发明工艺操作性强，获得的产品的纯度高，收率高，适合在工业规模上生产高纯度雷帕霉素。

权利要求书
1.  一种雷帕霉素的分离纯化方法，其特征在于，它包括如下步骤：
A.浸提：
收集雷帕霉素发酵液，过滤得菌丝体，将菌丝体浸入菌丝体质量的5-9倍体积的有机溶剂乙醇或丙酮中，搅拌同时进行间歇超声处理,浸提3h后混合液过滤，滤液抽提2次后得到菌丝体浸提液；
B.萃取：
将菌丝体浸提液进行真空减压浓缩，直到蒸出乙醇浓度低于20％为止，向浓缩液中加入(1:0.02kg/kg)无水硫酸锌和(1:0.002，kg/kg)十二烷基苯磺酸钠(SDBS)，使用乙酸乙酯进行萃取，收集萃取相；
C.活性炭吸附：
向萃余相中加入(1:0.001-0.002，L/kg)医用针形活性炭，搅拌10-40min后过滤，收集滤液；
D.粗结晶：
将步骤3)所得的滤液减压浓缩，直至蒸出的蒸汽中不含乙酸乙酯，收集浓缩液，向浓缩液中添加浓缩液1-3倍体积的环己烷，充分搅拌后置于4℃下析晶24h，析晶液抽滤，即可得到雷帕霉素粗品；
E.硅胶柱层析：
用正己烷、丙酮混合液(3-4:1，v/v)溶解雷帕霉素粗品，将溶液加入硅胶层析柱中，分别使用正己烷丙酮混合液梯度洗脱，分段收集，同时使用HPLC在线检测，收集含雷帕霉素单一成分的洗脱液；
F.结晶：
将步骤5)得到的浓缩液溶于环己烷与丙酮混合溶剂中结晶，得到雷帕霉素晶体，干燥得到雷帕霉素半成品；
G.重结晶：
将雷帕霉素半成品溶于乙酸乙酯与乙醚混合溶剂中结晶，于结晶罐中降温搅拌析晶，6h后对结晶液进行抽滤，得到雷帕霉素晶体。

2.  根据权利要求1所述雷帕霉素的分离纯化方法，其特征在于，它包括如下步骤：
A.浸提：
收集雷帕霉素液，通过板框压滤机实现固液分离，得到菌丝体，将菌丝体浸入菌丝体 质量的5-9倍体积的有机溶剂乙醇或丙酮中，开启搅拌同时对料液进行间歇超声处理,浸提3h后混合液再次通过板框压滤机压滤收集滤液，进行抽提2次，得到菌丝体浸提液；并取样检测浓度，通过计算收率在95％以上；
B.萃取：
将菌丝体浸提液进行真空减压浓缩，直到蒸出乙醇浓度低于20％为止，添加(1:0.02kg/kg)无水硫酸锌和(1:0.002，kg/kg)十二烷基苯磺酸钠(SDBS)，使用1-4倍体积乙酸乙酯进行萃取，搅拌10-30min后，静置6-10h，分离萃取相与萃余相，收集萃取相，萃取收率在98％以上；
C.活性炭吸附：
向乙酸乙酯萃取液中添加(1:0.001-0.002，L/kg)医用针形活性炭，搅拌30min后压滤，收集滤液；取样通过HPLC测定含量及成分；
D.粗结晶：
将收集的脱色滤液减压浓缩，待乙酸乙酯蒸干后收集浓缩液，向浓缩液中添加1倍体积环己烷，充分搅拌后置于4℃下析晶24h，而后对析晶液进行抽滤，得到雷帕霉素粗品；
E.硅胶柱层析：
根据粗品结晶质量：柱层析硅胶(150-300目)质量比1:10-30称取硅胶，采用湿法装柱，将硅胶装入层析柱中，硅胶柱后，用丙酮正己烷混合液(4:1，v/v)溶解粗品，加入硅胶层析柱中，使用正己烷丙酮混合液(7:1，6：1，5：1，4：1，3：1，2:1,v/v)梯度洗脱，出料后分段收集，经HPLC检测后，收集主体及异构含量≥98％的洗脱液合并收集；
F.结晶：
将步骤5)得到的主体及异构含量≥98％的洗脱液合并收集，真空浓缩得浓缩液，蒸干后溶于40-50℃环己烷与丙酮(3-5:1，v/v)混合液中，降温析晶，抽滤得雷帕霉素晶体，干燥得到雷帕霉素粗品；
G.重结晶
将粗品溶于乙酸乙酯与乙醚(10-2:1,v/v)混合溶剂中结晶，梯度(5-10℃)降温搅拌析晶，6-10h后对结晶液进行抽滤，得到雷帕霉素纯品，经真空干燥后，于4℃下保存。

3.  根据权利要求2所述雷帕霉素的分离纯化方法，其特征在于，步骤A所述的有机溶剂为90％的乙醇-水溶液。

4.  根据权利要求2所述雷帕霉素的分离纯化方法，其特征在于，步骤B所述萃取使用乙酸乙酯体积为2倍，搅拌时间为15min，静置时间8h。

5.  根据权利要求2所述雷帕霉素的分离纯化方法，其特征在于，步骤E所述粗品与硅胶质量比为1：20，所述硅胶为230-300目。

6.  根据权利要求2所述雷帕霉素的分离纯化方法，其特征在于，步骤F所述环己烷与丙酮体积比为4:1。

7.  根据权利要求2所述雷帕霉素的分离纯化方法，其特征在于，步骤G所述乙酸乙酯与乙醚体积比为4:1，梯度降温温度5℃，结晶时间8h。

说明书一种雷帕霉素的分离纯化方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种雷帕霉素的分离纯化方法。
背景技术
雷帕霉素(Rapamycin)现称为西罗莫司(Sirolimus)，是1975年由Veniza等分离得到的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)所产的大环内脂类抗生素。经过多年的研究雷帕霉素现已被开发成为临床使用的强效免疫抑制剂。同时以雷帕霉素为前体，化学修饰合成所得的一些结构新颖衍生物，被发现在免疫抑制、抗癌、抗帕金森氏症与艾滋病等方面上，具有新的治疗作用，其中其合成物Temsirolimus、Everolimus、AP23573已作为抗肿瘤靶向新药物进行临床研究，雷帕霉素在医药应用领域具有广泛前景。
当前雷帕霉素的生产主要通过发酵法生产，如中国发明专利申请公布书CN101486976A所述一般西罗莫司发酵效价只有200μg/ml左右，发酵副产物较多，导致后序提取时的层析分离比较困难，工作较为复杂，酵培养的发酵液经过滤得菌体后经甲醇萃取浓缩后，再通过一系列纯化工艺如色谱层析、萃取、结晶等获得西罗莫司纯品，产品收率低于20％。所以该说明书公开了一种吸水链霉菌及其应用的技术方案，提供了一种高单位的西罗莫司产生菌，效价为600μg/ml以上，但是产品收率只达到了30～35％。
CN102443012A公布了一种高纯度提取纯化方法a.用丙酮或乙醇抽提发酵液过滤后得到的菌丝体，得到抽提液后，真空浓缩得浓缩抽提液；b.用乙酸乙酯萃取发酵液过滤后得到的上清液，分离乙酸乙酯相得萃取液，真空浓缩得浓缩萃取液；c.将a中的浓缩抽提液和b中的浓缩萃取液合并得浓缩液，并加入到装有大孔树脂的床层进行吸附，用丙酮和水的混合溶液作为洗涤剂洗涤大孔树脂，收集洗脱液并真空浓缩，得浓缩洗脱液；d.用乙酸乙酯萃取c得到的浓缩洗脱液，经无水硫酸钠或无水硫酸镁脱水后真空浓缩得浓缩液，上样硅胶柱进行层析分离，正庚烷和丙酮混合溶液作为洗涤剂洗涤硅胶柱，正庚烷和丙酮混合溶液作为洗脱剂洗脱硅胶柱，收集洗脱液并真空浓缩得浓缩液；e.将步骤d得到的浓缩液溶于石油醚或乙醚中结晶，干燥得到雷帕霉素粗品。f.丙酮溶解雷帕霉素粗品，真空浓缩后用乙醚重结晶，干燥得到雷帕霉素纯 品。
杨国新等在《海峡药学》(2007年，第19卷第17期，25-26页)文献中公开：发酵液经离心后得到菌丝体，菌丝体用两倍量体积的95％酒精分别浸泡两次，离心弃菌丝渣，合并酒精浸泡液，减压浓缩去除酒精。残留液用等体积的乙酸乙酯分别萃取两次，合并乙酯层并用饱和NaCl溶液洗涤1次，经无水Na2SO4干燥1h后，过滤，减压浓缩除去乙酸乙酯得上柱物。上柱物溶于适当体积的洗脱剂(乙酯-石油醚洗脱系统)，200～300目硅胶柱层析，分段收集，HPLC检测，合并含西罗莫司的洗脱液，减压浓缩，浓缩液经乙醚结晶，洗晶，结晶。经上述制备的西罗莫司结晶溶于少量的洗脱剂，硅胶(200～300目)柱层析分离，分部收集，分离过程用高效液相跟踪检测。合并含西罗莫司的洗脱液，减压浓缩，浓缩液经乙醚结晶，洗晶，重结晶得高纯度西罗莫司样品。
美国专利公布说明书US20100029933A1公布了雷帕霉素的纯化技术方案，该方案从发酵液中纯化得到纯品纯度达到98.8％，总杂质含量小于1.2％，单杂低于0.15％，提纯方案为a)用疏水性溶剂萃取发酵液中的雷帕霉素并浓缩b)加入亲水性的溶剂分离杂质；c)将步骤得到的产物吸附到惰性载体上，用碱和酸连续洗涤，然后洗脱；d)收集步骤c得到的洗脱液或直接用步骤b中含雷帕霉素的溶液，上硅胶柱，收集洗脱液；e)将步骤d)得到的产物结晶；f)溶解f步骤中的结晶品，进行疏水作用或反相色谱；并将g重结晶得到的高哦纯度的雷帕霉素但是利用该方法纯化收率不高，在一个具体实例中可以得知11kg的雷帕霉素发酵液最后的纯品只有6g，称取3g纯品进一步纯化结晶得到2.5g。
朱健等在中国医药工业杂志发表的文章《他克莫司产生菌的选育和生产工艺研究》中公开了采用发酵液板框所得菌体丙酮浸泡，抽提液浓缩或加水稀释使丙酮浓度<50％(V/V)，用大孔吸附树脂吸附，低浓度的丙酮解析，再以高浓度丙酮解析。浓缩脱除丙酮，雷帕霉素不溶于水而形成沉淀，沉淀用乙醇溶解后结晶。初次结晶得到的纯度约为90％，乙醇重结晶1～2次后，纯度可提高至95％。
藤泽药业工业公司(徐亲民.他克莫司的工业化研究[J].国外医药抗生素分册,2000,21(4):151-155)报道采用主要工艺为收集菌丝体，丙酮浸泡，浓缩，经过Diaion HP20树脂处理，洗脱液浓缩后乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩后经过酸性硅胶柱层析，再次经普通硅胶层析，最后通过乙腈重结晶得到产品。
从以上几个专利文献资料的提取纯化工艺中，我们可以看到雷帕霉素的粗制纯度提高至 95％，雷帕霉素的精制纯度提高到了99.8％以上，或者是单杂以及总杂的含量也降低到了0.15％和1.2％以下，但是其提取纯化过程处理工艺繁琐，时间周期长，尤其是经历两次硅胶柱层析，成本高，柱损耗也大大降低了收率。
发明内容
本发明针对现有生产技术中存在的工艺繁琐，生产时间周期长，生产成本高，收率低，产品纯度低等不足，提供一种雷帕霉素的提纯方法，其优点是工艺操作性强，获得的产品的纯度高，收率高，适合在工业规模上生产高纯度雷帕霉素。
本发明的技术方案为：利用吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus ACCC No.40417)，通过微生物发酵培养出含雷帕霉素的发酵液，雷帕霉素发酵液经种子培养、接种前准备、接种、多阶段溶氧控制、分批补料发酵阶段，并采用菌丝体收集、浸提、萃取、活性炭吸附、硅胶柱层析、及冷却析晶技术得到雷帕霉素。
优选地，具体包括如下步骤：
A.浸提：收集雷帕霉素发酵液，过滤得菌丝体，将菌丝体浸入菌丝体质量的5-9倍体积的有机溶剂乙醇或丙酮中，搅拌同时进行间歇超声处理,浸提3h后混合液过滤，滤液抽提2次后得到菌丝体浸提液；
B.萃取：将菌丝体浸提液进行真空减压浓缩，直到蒸出乙醇浓度低于20％为止，向浓缩液中加入(1:0.02kg/kg)无水硫酸锌和(1:0.002，kg/kg)十二烷基苯磺酸钠(SDBS)，使用乙酸乙酯进行萃取，收集萃取相；
C.活性炭吸附：向萃余相中加入(1:0.001-0.002，L/kg)医用针形活性炭，搅拌10-40min后过滤，收集滤液；
D.粗结晶：将步骤3)所得的滤液减压浓缩，直至蒸出的蒸汽中不含乙酸乙酯，收集浓缩液，向浓缩液中添加浓缩液1-3倍体积的环己烷，充分搅拌后置于4℃下析晶24h，析晶液抽滤，即可得到雷帕霉素粗品；
E.硅胶柱层析：用正己烷、丙酮混合液(3-4:1，v/v)溶解雷帕霉素粗品，将溶液加入硅胶层析柱中，分别使用正己烷丙酮混合液梯度洗脱，分段收集，同时使用HPLC在线检测，收集含雷帕霉素单一成分的洗脱液；
F.结晶：将步骤5)得到的浓缩液溶于环己烷与丙酮混合溶剂中结晶，得到雷帕霉素晶 体，干燥得到雷帕霉素半成品；
G.重结晶：将雷帕霉素半成品溶于乙酸乙酯与乙醚混合溶剂中结晶，于结晶罐中降温搅
拌析晶，6h后对结晶液进行抽滤，得到雷帕霉素晶体。
进一步优选地，包括如下步骤：
A.浸提：
收集雷帕霉素液，通过板框压滤机实现固液分离，得到菌丝体，将菌丝体浸入菌丝体质量的5-9倍体积的有机溶剂乙醇或丙酮中，开启搅拌同时对料液进行间歇超声处理,浸提3h后混合液再次通过板框压滤机压滤收集滤液，进行抽提2次，得到菌丝体浸提液；并取样检测浓度，通过计算收率在95％以上；
步骤A所述的有机溶剂优选为90％的乙醇-水溶液；
B.萃取：
将菌丝体浸提液进行真空减压浓缩，直到蒸出乙醇浓度低于20％为止，添加(1:0.02kg/kg)无水硫酸锌和(1:0.002，kg/kg)十二烷基苯磺酸钠(SDBS)，使用1-4倍体积乙酸乙酯进行萃取，搅拌10-30min后，静置6-10h，分离萃取相与萃余相，收集萃取相，萃取收率在98％以上；
步骤B所述萃取使用乙酸乙酯体积优选2倍，搅拌时间优选15min，静置8h；
C.活性炭吸附：
向乙酸乙酯萃取液中添加(1:0.001-0.002，L/kg)医用针形活性炭，搅拌30min后压滤，收集滤液；取样通过HPLC测定含量及成分，脱色效果明显，滤液颜色较之前明显变浅，纯度提高3个百分点，收率在98％以上；本工艺通过活性炭脱色预处理代替目前广泛使用的大孔树脂分离方法，大大降低了树脂与洗脱液的成本，缩短了时间周期，提高收率30％以上；
D.粗结晶：
将收集的脱色滤液减压浓缩，待乙酸乙酯蒸干后收集浓缩液，向浓缩液中添加1倍体积环己烷，充分搅拌后置于4℃下析晶24h，而后对析晶液进行抽滤，得到雷帕霉素粗品，通过HPLC检测纯度在98％之上，收率在80％之上；同时通过环己烷的析晶处理得到粗品，利用环己烷对料液的结晶提高了产品纯度，为后续硅胶柱层析分离上样提供了方便；
E.硅胶柱层析：
根据粗品结晶质量：柱层析硅胶(150-300目)质量比1:10-30称取硅胶，采用湿法装柱， 将硅胶装入层析柱中，硅胶柱后，用正己烷丙酮混合液(4:1，v/v)溶解粗品，加入硅胶层析柱中，使用正己烷丙酮混合液(7:1，6：1，5：1，4：1，3：1，2:1,v/v)梯度洗脱，出料后分段收集，经HPLC检测后，收集主体及异构含量≥98％的洗脱液合并收集；
步骤E所述粗品质量与硅胶质量比优选1：20，硅胶优选230-300目；
F.结晶：
将步骤5)得到的主体及异构含量≥98％的洗脱液合并收集，真空浓缩得浓缩液，蒸干后溶于40-50℃环己烷与丙酮(3-5:1，v/v)混合液中，降温析晶，抽滤得雷帕霉素晶体，干燥得到雷帕霉素粗品；
步骤F所述环己烷与丙酮混合液比例优选为4:1；
G.重结晶
将粗品溶于乙酸乙酯与乙醚(10-2:1,v/v)混合溶剂中结晶，梯度(5-10℃)降温搅拌析晶，6-10h后对结晶液进行抽滤，得到雷帕霉素纯品，经真空干燥后，于4℃下保存；
步骤G所述乙酸乙酯与乙醚体积比优选4:1，梯度降温优选5℃，结晶时间优选8h。
本发明与现有技术相比具有如下突出优点：
本发明对含有雷帕霉素的发酵液采用菌丝体抽提、萃取、活性炭吸附、硅胶柱层析及冷却结晶和重结晶技术提取得到雷帕霉素纯品。相对于杨国新等人所公开的文献资料，本发明以活性炭吸附替代广泛使用的大孔树脂吸附，环己烷对活性炭滤液浓缩液析晶的粗品和一次硅胶层析等方法，操作方便、工艺简单，简化了纯化的步骤，缩短了生产周期，降低了成本，而且相比于美国专利公布说明书US20100029933A1所公开的数据取得了较好的效果，本发明提取得到的雷帕霉素纯品不仅纯度达到99.8％以上，单杂小于0.10％，而且收率提高到70％左右，且异构的占比明显减少。提取工艺研究表明，采用该方法简化雷帕霉素提取工艺路线，大大缩短了生产周期，提高收率和产品纯度，操作方便，成本低廉。对于工业化生产具有重要意义。
具体实施方式
下面列举实施例予以进一步说明：
实施例1
a.用8倍体积的90％乙醇抽提发酵液(50L，效价为1.0g/L)过滤后得到的菌丝体，浸提2次得到抽提液，浸提过程中对浸提液间歇超声处理30min，真空浓缩得浓缩抽提液；
b.用1.0倍体积的乙酸乙酯萃取浓缩抽提液，添加1kg无水硫酸锌和50g十二烷基苯磺酸钠(SDBS)，搅拌10min后，静置6h，分离萃取相与萃余相，收集乙酸乙酯相；
c.转移萃取液至活性炭处理罐，添加50g针形活性炭，搅拌10min进行吸附处理，而后通过0.45μm的钛棒过滤器进行压滤得到乙酸乙酯脱色液；
d.将收集的脱色滤液减压浓缩，待乙酸乙酯蒸干后收集浓缩物，向浓缩物中添加1倍体积环己烷，充分搅拌后置于4℃下析晶24h，将析晶液抽滤，得到雷帕霉素粗品44.0g，HPLC检测得知纯度为98.6％，收率88.0％；
e.采用湿法装柱，称1.24kg 230目硅胶装入层析柱中，使用正己烷平衡层析柱2倍柱体积，用200ml(4:1，v/v)正己烷丙酮混合液溶解粗品，加入硅胶层析柱中，用6倍柱体积的正己烷和丙酮混合溶液(体积比为7:1)进行洗涤，用4倍柱体积的正己烷和丙酮混合溶液(体积比为3:1)进行洗脱，收集洗脱液并真空浓缩得浓缩液；经HPLC检测后，收集主体及异构含量≥98％的洗脱液；
f.将步骤e得到的浓缩液蒸干，溶于50℃1L环己烷与丙酮(5:1，v/v)混合液中降温析晶，4℃下析晶，时间为15h，抽滤，得到雷帕霉素粗品；
g.将粗品溶于0.5L乙酸乙酯乙醚混合液(2:1，v/v)重结晶，梯度降温(10℃/h)，搅拌析晶，最终结晶过程控制温度为-25℃，10h后对结晶液进行抽滤，得到雷帕霉素纯品，经真空干燥后，称雷帕霉素纯品35.4g，HPLC检测纯度为99.7％，单杂小于0.1％，其中主体与异构比为98.2:1，收率70.8％。
实施例2
a.用9倍体积的丙酮抽提发酵液(500L，效价为1.02g/L)过滤后得到的菌丝体，浸提2次得到抽提液，浸提过程中对浸提液超声处理15分钟，真空浓缩得浓缩抽提液；
b.用4.0倍体积的乙酸乙酯萃取浓缩抽提液，添加2kg无水硫酸锌和250g十二烷基苯磺酸钠(SDBS)，搅拌30min后，静置10h，分离萃取相与萃余相，收集萃取相，分离乙酸乙酯相得萃取液，；
c.收集萃取液，添加添加1000g针形活性炭，搅拌40min进行吸附处理，通过0.45μm的钛棒过滤器进行压滤得到乙酸乙酯脱色液；
d.将收集的脱色滤液减压浓缩，待乙酸乙酯蒸干后收集浓缩液，向浓缩液中添加3倍体积环己烷，充分搅拌后置于4℃下析晶24h，而后对析晶液进行抽滤，得到雷帕霉素粗品干燥； 得到雷帕霉素粗品439.62g，HPLC检测得知纯度为98.8％，收率86.2％
e.采用湿法装柱，称4.4kg 300目硅胶装入层析柱中，使用正己烷平衡层析柱2倍柱体积，用3L正己烷丙酮混合液(3:1)溶解粗品，加入硅胶层析柱中，用4倍柱体积的正己烷和丙酮混合溶液(体积比为7:1，6：1，5：1，4：1，3：1，2：1)进行梯度洗涤，用4倍柱体积的正己烷和丙酮混合溶液(体积比为3:1)进行洗脱，收集洗脱液并真空浓缩得浓缩液；经HPLC检测后，收集主体及异构含量≥98％的洗脱液，减压浓缩至无液体蒸出；
f.将步骤e得到的浓缩液溶于40℃4L环己烷与丙酮(3:1，v/v)混合液中降温析晶，4℃下析晶，时间为10h，抽滤，干燥得到雷帕霉素粗品；
g.用8L乙酸乙酯乙醚混合液(10:1，v/v)溶解雷帕霉素粗品重结晶，梯度降温(8℃/h)，最终结晶过程控制温度为-25℃，时间为6h，干燥得到雷帕霉素纯品348.33g，HPLC检测得知纯度为99.5％，单杂小于0.1％，主异构比98.9:1，收率68.3％。
实施例3
a.用5倍体积的90％乙醇-水溶液抽提发酵液(2000L，效价为0.90g/L)过滤后得到的菌丝体，浸提2次得到抽提液，浸提过程中对浸提液超声处理20分钟，真空浓缩得浓缩抽提液；b.用2.0倍体积的乙酸乙酯萃取浓缩抽提液，添加10kg无水硫酸锌和900g十二烷基苯磺酸钠(SDBS)，搅拌15min后，静置8h，分离萃取相与萃余相，收集萃取相，分离乙酸乙酯相得萃取液，；
c.收集萃取液，添加3.5kg医用针形活性炭，搅拌30min进行吸附处理，而后通过0.45μm的钛棒过滤器进行压滤得到乙酸乙酯脱色液；
d.收集的脱色滤液减压浓缩，待乙酸乙酯蒸干后收集浓缩液，向浓缩液中添加2倍体积环己烷，充分搅拌后置于4℃下析晶24h，而后对析晶液进行抽滤，得到雷帕霉素粗品1627.2g，HPLC检测得知纯度为98.6％，收率90.4％。
e.采用湿法装柱，称31kg 300目硅胶装入层析柱中，使用正己烷平衡层析柱1倍柱体积，用14L丙酮正己烷混合液(4:1，v/v)溶解粗品，加入硅胶层析柱中，用4倍柱体积的正己烷和丙酮混合溶液(体积比为5:1)进行洗涤，用3倍柱体积的正己烷和丙酮混合溶液(体积比为4:1)进行洗脱，用2倍柱体积的正己烷和丙酮混合溶液(体积比为3:1)进行洗脱，收集洗脱液并真空浓缩得浓缩液；经HPLC检测后，收集主体及异构含量≥98％的洗脱液，减压浓缩至无液体蒸出；
f.将步骤e得到的浓缩液溶于40℃15L的环己烷丙酮混合液(4:1v/v)中降温析晶，结晶过程控制温度为0℃、时间为4h，抽滤的粗品，干燥得到雷帕霉素粗品；
g.用20L乙酸乙酯乙醚混合液(4:1，v/v)溶解雷帕霉素粗品，梯度降温(5℃/h)，最终结晶过程控制温度为-20℃，时间为8h，抽滤，干燥得到雷帕霉素纯品1299.60g，HPLC检测得知纯度为99.6％，单杂小于0.1％，主异构比98.9:0.5，收率72.2％。
实施例4
a.用13倍体积的95％乙醇抽提发酵液(500L，效价为1.02g/L)过滤后得到的菌丝体，浸提2次得到抽提液，浸提过程中对浸提液超声处理15分钟，真空浓缩得浓缩抽提液；
b.用6.0倍体积的乙酸乙酯萃取浓缩抽提液，添加2kg无水硫酸锌和250g十二烷基苯磺酸钠(SDBS)，搅拌10min后，静置12h，分离萃取相与萃余相，收集萃取相，分离乙酸乙酯相得萃取液，；
c.收集萃取液，添加添加1000g针形活性炭，搅拌48min进行吸附处理，通过0.45μm的钛棒过滤器进行压滤得到乙酸乙酯脱色液；
d.将收集的脱色滤液减压浓缩，待乙酸乙酯蒸干后收集浓缩液，向浓缩液中添加5倍体积环己烷，充分搅拌后置于4℃下析晶20h，而后对析晶液进行抽滤，得到雷帕霉素粗品干燥；得到雷帕霉素粗品424.3g，HPLC检测得知纯度为98.2％，收率83.2％
e.采用湿法装柱，称15kg 360目硅胶装入层析柱中，使用正己烷平衡层析柱2倍柱体积，用5L丙酮正己烷混合液(3:1)溶解粗品，加入硅胶层析柱中，用4倍柱体积的正己烷和丙酮混合溶液(体积比为4:1)进行洗涤，用4倍柱体积的正己烷和丙酮混合溶液(体积比为3:1)进行洗脱，收集洗脱液并真空浓缩得浓缩液；经HPLC检测后，收集主体及异构含量≥98％的洗脱液，减压浓缩至无液体蒸出；
f.将步骤e得到的浓缩液溶于溶于50℃4L环己烷与丙酮(7:1，v/v)混合液中，4℃下析晶，时间为10h，抽滤，干燥得到雷帕霉素粗品；
g.用8L乙酸乙酯乙醚混合液(10:1，v/v)溶解雷帕霉素粗品重结晶，梯度降温(13℃/h)，最终结晶过程控制温度为-25℃，时间为12h，干燥得到雷帕霉素纯品302.43g，HPLC检测得知纯度为99.5％，单杂小于0.1％，主异构比97.5:1，收率59.3％。