一种赤藓糖醇的生产方法.pdf

本发明提供了一种赤藓糖醇的生产方法，所述方法包括赤藓糖醇发酵菌种接种到发酵罐中培养，在发酵培养的过程中，向发酵罐内流动加入碳源和氮源，与此同时，在发酵培养60～64小时后至发酵培养130～135小时的时间段内向发酵液中流动加入无机盐。本发明提供的方法可以在保证葡萄糖转化率的前提下，提高发酵终点的赤藓糖醇含量，提高单罐赤藓糖醇产量，降低生产成本，从而提高经济效益。

权利要求书
1.  一种赤藓糖醇的生产方法，包括以下步骤：（1）菌种活化；（2）配制发酵培养基；（3）种子液培养；（4）发酵培养，其特征在于，所述步骤（4）发酵培养过程中，发酵罐内流动加入碳源和氮源，同时在发酵培养至60～64小时开始流动加入无机盐，然后待发酵培养至130～135小时结束无机盐的流动加入；其中所述流动加入碳源的量使得发酵液中还原性糖含量控制在100～350g/L，所述流动加入氮源的量使得发酵液中氮含量控制在1～3g/L；流动加入无机盐的浓度控制在2～5g/L；所述菌种为解脂假丝酵母；所述步骤（4）发酵培养170～190小时后结束发酵，进行放罐。

2.  根据权利要求1所述赤藓糖醇的生产方法，其特征在于，所述步骤（4）中发酵菌种的接种量在10～17%，即发酵种子液体积为基准培养基体积的10～17%。

3.  根据权利要求2所述赤藓糖醇的生产方法，其特征在于，所述步骤（4）中发酵菌种的接种量在12～16%，即发酵种子液体积为基准培养基体积的12～16%。

4.  根据权利要求1所述赤藓糖醇的生产方法，其特征在于，所述步骤（4）中流动加入无机盐的浓度控制在2～3.5g/L。

5.  根据权利要求1所述赤藓糖醇的生产方法，其特征在于，所述步骤（4）的培养温度为28～32℃，压力为0.05～0.1MPa，通气量为0.4～0.8立方米空气/立方米培养基/分钟。

6.  根据权利要求1所述赤藓糖醇的生产方法，其特征在于，所述步骤（4）中无机盐为硫酸镁、硫酸锰和磷酸二氢钾中至少一种。

7.  根据权利要求1所述赤藓糖醇的生产方法，其特征在于，所述步骤（4）中碳源为固体葡萄糖；所述的氮源为柠檬酸铵。

8.  根据权利要求7所述赤藓糖醇的生产方法，其特征在于，所述步骤（4）中作为氮源的柠檬酸铵的铵根离子的浓度需要控制在1.2～3.6g/L。

9.  根据权利要求1所述赤藓糖醇的生产方法，其特征在于，所述步骤（4）中接种后且在流动加入培养基成分之前发酵罐中培养基的体积为发酵罐总体积的30～60%；控制培养基总体积小于发酵罐总体积的70～80%。

说明书一种赤藓糖醇的生产方法
技术领域
本发明属于赤藓糖醇生产的技术领域，具体的涉及一种赤藓糖醇的生产方法。
背景技术
赤藓糖醇是由葡萄糖经发酵而得到的一种白色晶体，是一种纯天然的食品甜味剂，具有热量低、口感佳、吸湿性低、对糖尿病人安全且不会引起肠胃不适等一系列优越特点。随着研究的逐步深入，赤藓糖醇的独特性质被揭开，其应用领域也更加广阔。
目前，赤藓糖醇的生产方法主要有三种，生物抽提法、化学合成法以及微生物发酵法。生物抽提法是指通过一定的化学及物理手段从海藻、苔藓等植物中提出赤藓糖醇。化学合成法一般是指通过化学还原原料处理高碘酸氧化过的淀粉或纤维素类物质以获得赤藓糖醇。微生物发酵法是指在适宜的培养环境下，利用微生物代谢发酵生产赤藓糖醇。上述三种方法中，生物抽提法成本较高，且获得率低，化学合成法中的污染问题突出，且获得的产品质量不稳定，副产物种类较多，提纯分离困难。因此，微生物发酵法生产优势明显，是最为理想的赤藓糖醇生产方法，但是现有技术中的微生物发酵法赤藓糖醇的产率较低。
发明内容
本发明的目的在于针对赤藓糖醇产率低的问题而提供一种赤藓糖醇的生产方法，该方法包括赤藓糖醇发酵菌种接种到发酵罐中培养，在发酵培养的过程中，向发酵罐内流动加入碳源和氮源，与此同时，在发酵培养60～64小时后至发酵培养130～135小时的时间段内向发酵液中流动加入无机盐。该生产方法大大提高了赤藓糖醇的单罐产量，延长发酵时间延长了24～30个小时，大大提高了产率，还有降低能耗，从而提高经济效益。
本发明的技术方案为：一种赤藓糖醇的生产方法，包括以下步骤：（1）菌种活化；（2）配制发酵培养基；（3）种子液培养；（4）发酵培养；所述步骤（4）发酵培养过程中，发酵罐内流动加入碳源和氮源，同时在发酵培养至60～64小时开始流动加入无机盐，然后待发酵培养至130～135小时结束无机盐的流动加入；其中所述流动加入碳源的量使得发酵液中还原性糖含量控制在100～350g/L，所述流动加入氮源的量使得发酵液中氮含量控制在1～3g/L；流动加入无机盐的浓度控制在2～5g/L；所述菌种为解脂假丝酵母；所述步骤（4）发酵培养170～190小时后结束发酵，进行放罐。
所述步骤（4）中发酵菌种的接种量在10～17%，即发酵种子液体积为基准培养基体积的10～17%。
所述步骤（4）中发酵菌种的接种量在12～16%，即发酵种子液体积为基准培养基体积的12～16%。
所述步骤（4）中流动加入无机盐的浓度控制在2～3.5g/L。
所述步骤（4）中培养温度为28～32℃，压力为0.05～0.1MPa，通气量为0.4～0.8立
方米空气/立方米培养基/分钟。
所述步骤（4）中无机盐为硫酸镁、硫酸锰和磷酸二氢钾中至少一种。
所述步骤（4）中碳源为固体葡萄糖；所述的氮源为柠檬酸铵。
所述步骤（4）中作为氮源的柠檬酸铵的铵根离子的浓度需要控制在1.2～3.6g/L。
所述步骤（4）中接种后且在流动加入培养基成分之前发酵罐中培养基的体积为发酵罐总体积的30～60%；控制培养基总体积小于发酵罐总体积的70～80%。
本发明的有益效果为：本发明所述赤藓糖醇的生产方法，以解脂假丝酵母为发酵菌株，采用分批补料的方式，在发酵过程中向发酵罐内流动加入碳源、氮源、无机盐混合物。生产赤藓糖醇的产量高，产品质量稳定，单罐利用率提高，具有良好的经济效益。可以在保证葡萄糖转化率的前提下，提高发酵终点的赤藓糖醇含量，提高单罐赤藓糖醇产量，降低生产成本，从而提高经济效益。本发明所述方法在保证转化率（%）为50%以上和残糖（g/100ml）为1.0以下的基础上，所获得的终点赤藓糖醇含量（g/100ml）为17.5～18.5，单罐产量（kg）为35000～37000。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细的说明如下。
实施例1
所述赤藓糖醇的生产方法，包括以下步骤：
（1）菌种活化：使用经过灭菌处理的YPD琼脂平板作为活化培养基，接入冷藏保存的赤藓糖醇发酵菌株，在28℃条件下，活化培养2d，待菌体长满平板备用。然后从培养结束的活化平板上挑取1cm×1cm的菌丝块接入装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，在28℃，220r/min条件下培养36h至对数期，即为活化增殖液。其中YPD固体培养基成分如下：酵母粉10g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂15 g/L ，pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌25min。增殖培养基的具体成分如下：葡萄糖200g/L，酵母粉10g/L，尿素1.5g/L，CuSO4·5H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，pH自然，蒸馏水定容，115℃高压蒸汽灭菌20min。
（2）配制发酵培养基，培养基成分按重量百分比计，具体如下：葡萄糖20%-30%，酵母粉0.5%-1.0%，CuSO4·5H2O 0.0005%-0.001%，MnSO4·H2O 0.0005%-0.001%，纯水定容，pH自然，110℃-120℃、0.1-0.2MPa蒸汽灭菌15-20min，待用。
（3）在种子罐中装入（2）中的发酵培养基，其体积为发酵罐总体积的30%。将（1）中所得的活化增殖液接入种子罐内的培养基中进行培养，通风培养60h，转接到二级种子罐，接种量为5%，培养过程中每隔120分钟取样镜检并测定OD值，当镜检菌体状态正常且OD值达到0.8时停止培养，得到成熟种子液。种子液的培养可以采用二级种子罐培养，即先将赤藓糖醇发酵菌种的活化增殖液接种到一个种子罐中培养一段时间后再转入另一个种子罐，继续进行培养，培养到所需的菌液浓度，获得成熟种子液。采用二级种子罐培养获得的成熟种子液菌体浓度高，活性大，可缩短大型发酵罐的单次发酵周期，降低能耗。
（4）在发酵罐中装入（2）中的发酵培养基，其体积为发酵罐总体积的30%。将（3）中所得的成熟种子液接入发酵罐内的培养基中进行发酵培养，以接种后的发酵培养基为基准，接种量为15%（体积比）。接种后连续流加葡萄糖和柠檬酸铵，流加葡萄糖和柠檬酸铵的量使发酵液中还原性糖的浓度控制在100-350g/L，流加氮源的量使发酵液中铵根离子的浓度控制在1.2-3.6 g/L。罐压控制为0.1MPa，发酵温度控制为30℃，通气量为0.7立方米空气/立方米培养基/分钟，进行发酵培养。分别在发酵培养60小时后至发酵培养135小时内的时间段内向发酵液中连续流加硫酸镁、硫酸锰和磷酸二氢钾混合物，流加的硫酸镁的量使发酵液中硫酸镁的浓度控制在0.5-3g/L，流加的硫酸锰的量使发酵液中硫酸锰的浓度控制在0.5-2g/L，流加的磷酸二氢钾的量使发酵液中磷酸二氢钾的浓度控制在0.5-1.5g/L。
发酵培养180小时后结束发酵，进行放罐，测定放罐料液中的赤藓糖醇浓度（即为终点赤藓糖醇含量）。
本实施例终点赤藓糖醇含量（g/100ml）为18.01，单罐产量（kg）为36511，转化率（%）为53.9%。
实施例2
菌种活化的培养基配方、菌种活化方法、种子培养基配方、种子液培养方法以及发酵罐培养基配方与实施例1相同。
在发酵罐中发酵培养基体积为发酵罐总体积的40%，接种量为15%（体积比）。接种后连续流加葡萄糖和柠檬酸铵，流加葡萄糖和柠檬酸铵的量使发酵液中还原性糖的浓度控制在100-350g/L，流加氮源的量使发酵液中铵根离子的浓度控制在1.2-3.6 g/L。将罐压控制为0.08MPa，发酵温度控制为30℃，通气量为0.6立方米空气/立方米培养基/分钟，进行发酵培养。分别在发酵培养60小时后到发酵培养135小时内的时间段内向发酵液中连续流加硫酸镁、硫酸锰和磷酸二氢钾混合物，流加的硫酸镁的量使发酵液中硫酸镁的浓度控制在0.5-3g/L，流加的硫酸锰的量使发酵液中硫酸锰的浓度控制在0.5-2g/L，流加的磷酸二氢钾的量使发酵液中磷酸二氢钾的浓度控制在0.5-1.5g/L。
发酵培养180小时后结束发酵，进行放罐，测定放罐的料液中赤藓糖醇浓度（即为终点赤藓糖醇含量）。
本实施例终点赤藓糖醇含量（g/100ml）为17.73，单罐产量（kg）为35203，转化率（%）为52.6%。
实施例3
该实施例3作为对比例，按照实施例2的方法生产赤藓糖醇，不同的是，在发酵过程中不流加葡萄糖、柠檬酸铵以及无机盐混合物。种子液接入发酵罐后，罐压控制为0.08MPa，发酵温度控制为30℃，通气量为0.6立方米空气/立方米培养基/分钟，进行发酵培养。发酵180小时后放罐，对放罐的料液中赤藓糖醇浓度进行测定。
本对比例终点赤藓糖醇含量（g/100ml）为14.90，单罐产量（kg）为25620，转化率（%）为53.6%。
综上可知，采用本发明方法发酵生产赤藓糖醇，可以明显地提高终点赤藓糖醇含量和单罐利用率。