说明书基于纳豆芽孢杆菌发酵制备维生素MK-7的制备方法
技术领域
本发明涉及的是一种基于纳豆芽孢杆菌发酵制备维生素MK-7 的制备方法。
背景技术
纳豆芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种，是一种益生菌,能产生 多种营养物质，如维生素、氨基酸、促生长因子等。纳豆芽孢杆菌作 为一种很有研究前景的菌种，在生产营养物质及作用机理方面引起许 多学者的关注和研究。
纳豆芽孢杆菌在生产维生素MK-7方面有很大潜力，维生素MK-7 在生物体内有重要的作用。治疗和预防骨质疏松症，维生素MK-7生 成骨蛋白质，增加骨密度，防止骨折。维生素MK-7可预防肝硬化进 展为肝癌。治疗维生素MK-7缺乏性出血症，促进凝血酶原的形成， 加速凝血，维持正常的凝血时间。
纳豆芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种，是一种益生菌,能产生 多种营养物质，如维生素、氨基酸、促生长因子等。纳豆芽孢杆菌作 为一种很有研究前景的菌种，在生产营养物质及作用机理方面引起许 多学者的关注和研究。
纳豆芽孢杆菌在生产MK-7(Menaquinone-7)方面有很大潜力，MK-7 是维生素MK-7的一种，根据C23上异戊二烯侧链长度的不同，维生素 MK-7(Menaquinone，MK)以MK-n表示，其中n指的是侧链上异戊二烯 单元的个数。MK-7能预防并治疗骨质疏松症，它能促进骨蛋白质的 生成，并与钙生成骨质，从而增加骨密度防止骨折。
目前纳豆芽孢杆菌发酵产维生素MK-7均采用化学成分培养基， 尚未发现采用本发明采用的利用工业副产品进行发酵生产维生素 MK-7的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于纳豆芽 孢杆菌发酵制备维生素MK-7的制备方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种基于纳豆芽孢杆菌发酵 制备维生素MK-7的制备方法，包括如下步骤：
(1)、菌种活化，将纳豆芽孢杆菌在平板培养基中，在温度为121℃ 条件下，灭菌20分钟后，再在温度为37℃条件下，活化培养36-48 小时，；
(2)、种子培养，将经菌种活化的纳豆芽孢杆菌接种到种子培养液中, 在PH为7.2～7.4,在温度为121℃条件下,灭菌20分钟,再在温度为 35-40℃条件下，培养20-30小时,得到液体种子；
(3)、发酵培养基预处理，将发酵培养基蒸煮5-10分钟后，再在常 温下静置10-15小时，在温度为121℃条件下，灭菌20分钟；
该发酵培养基的配方由以下组分组成：70～90g/L菌菇副产品、 20～40g/L的大豆粉或10～20g/L的豆腐渣粉，40～60g/L甘油和5～ 7g/LK2HPO4，该调发酵培养基的PH为6.5-7.5；
(4)、发酵培养，在经过预处理的发酵培养基中，按照7％～12％的接 种量，接种步骤(2)得到的液体种子，并在35-40℃，以转速 180-220r/min摇瓶,培养6-8天；
(5)、喷雾干燥制备维生素MK-7
(51)、喷雾干燥，在无菌条件下，往接种后的发酵液中加入保护剂， 在压缩机压力为0.2～0.4MPa条件下，进行喷雾干燥，喷雾干燥进口 温度为150℃，出口温度为60～70℃，得到固体产品；
该保护剂的配方由以下组分组成：30～40g/L脱脂奶粉，10～ 20g/L麦芽糖，5～10g/L蔗糖，15～25g/L甘露醇和及10～20g/LL- 谷氨酸钠；
(52)、将步骤(51)中得到的固体产品中加入正丙醇和正己烷混合 物，以转速180～250r/min摇床震荡30～60min后，静置12～15小 时；
(53)、收集上清，将经步骤(52)处理的混合液中加入二氯甲烷， 再以180～250r/min摇床震荡10～20min，置于-18～-30℃冰箱冷冻 12-24小时；
(54)、吸取有机相，将经步骤(53)处理的混合物，在65℃下， 旋蒸除去有机溶剂，得到淡黄色固体为维生素MK-7。
作为上述方案的进一步优化，菌种活化采用的平板培养基，其配 方由以下组分组成：蛋白胨4～6g/L，牛肉膏4～6g/L，氯化钠4～ 6g/L，琼脂粉20g/L。
作为上述方案的进一步优化，在制备种子过程中，种子培养液的 配方由以下组分组成：葡萄糖8～12g/L，蛋白胨8～12g/L，氯化钠 4～6g/L。
作为上述方案的进一步优化，该将菌菇副产品为平菇、香菇、草 菇、金针菇中的一种或几种经提取多糖后剩余的工业产物；该大豆粉 或豆腐渣粉在55-70℃下烘干，经烘干后的大豆粉或豆腐渣粉的含水 量＜10％。
作为上述方案的进一步优化，该发酵培养基的配方由以下组分组 成：70～90g/L菌菇副产品、20～40g/L的大豆粉或10～20g/L的豆 腐渣粉、5g/L-10g/L麸皮、.2g/L-0.3g/LMgSO4、0.1g/L-0.2g/LZnCl2、 40～60g/L甘油和5～7g/LK2HPO4，该调发酵培养基的PH为6.5-7.5； 本发明相比现有技术具有以下优点：本发明的一种基于纳豆芽孢杆菌 发酵制备维生素MK-7的制备方法，制备工艺简单且易于控制，后加 工成本低，生产环境友好，并且发酵原料是提取菌菇多糖后的副产品， 原料易得成本低，而且可以实现副产品的循环利用。喷雾干燥得到的 维生素MK-7粗品无毒性可以直接添加到食品中作为维生素MK-7的增 补剂。经提纯后，可以制成维生素MK-7类药品。使用本发明的方法 制备的维生素MK-7回收率达到70％以上。
附图说明
图1是本发明的基于纳豆芽孢杆菌发酵制备维生素MK-7的制备 方法的工艺流程图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方 案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但 本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
1.菌种活化：
本发明采用本实验室分离的一株具有产维生素MK-7能力的一株 纳豆芽孢杆菌(BN-2-6)作为发酵菌种，将-80℃保存的纳豆芽孢杆 菌将纳豆芽孢杆菌在平板培养基中，在温度为121℃条件下，灭菌20 分钟后，再在温度为37℃条件下，活化培养36小时。其中平板培养 基的组成成分为：蛋白胨4g/L，牛肉膏4g/L，氯化钠4g/L，琼脂粉 20g/L。然后挑取发育健壮的纳豆芽孢杆菌单菌。
2.种子培养：
将经菌种活化的纳豆芽孢杆菌接种到种子培养液中,在PH为7.2, 在温度为121℃条件下,灭菌20分钟,再在温度为35℃条件下，培养 20小时,得到液体种子。其中，种子培养液的成分为：葡萄糖8g/L， 蛋白胨8g/L，氯化钠4g/L。
3.发酵培养基预处理：
将菌菇副产品(其中菌菇副产品包括平菇和香菇，混合比例为 1:1)、大豆及豆腐渣在65℃烘箱中进行烘干，含水量为5％，然后将 菌菇副产品、大豆及豆腐渣磨碎，过60目筛网，配置发酵培养基。 该发酵培养基成分包括：70g/L菌菇副产品，20g/L大豆粉，40g/L 甘油，5g/LK2HPO4。将发酵培养基常压蒸煮5min，放置过夜，调PH 到7.0，然后121℃灭菌20分钟，待培养基冷发酵培养基预处理，将 发酵培养基蒸煮5分钟后，再在常温下静置10小时，在温度为121 ℃条件下，灭菌20分钟；再将发酵培养基自然冷却；
4.发酵培养：
在经过预处理的发酵培养基中，按照7％的接种量，接种步骤2得 到的液体种子，并在35℃，以转速200r/min摇瓶,培养7天；
5.喷雾干燥制备成品：
(51)、喷雾干燥，在无菌条件下，往接种后的发酵液中加入保护剂， 在压缩机压力为0.2～0.4MPa条件下，进行喷雾干燥，喷雾干燥进口 温度为150℃，出口温度为60℃，得到固体产品，维生素MK-7含量 为170.32mg/kg。
该保护剂的配方由以下组分组成：40g/L脱脂奶粉，10g/L麦芽 糖，5g/L蔗糖，15g/L甘露醇和20g/LL-谷氨酸钠。
(52)、将步骤(51)中得到的固体产品中加入正丙醇和正己烷混合 物，以转速200r/min摇床震荡40min后，静置13小时；
(53)、收集上清，将经步骤(52)处理的混合液中加入二氯甲烷， 再以200r/min摇床震荡20min，置于-18～-30℃冰箱冷冻12-24小 时；
(54)、吸取有机相，将经步骤(53)处理的混合物，在65℃下，旋 蒸除去有机溶剂，得到淡黄色固体为维生素MK-7。实用本实施例的 方法维生素MK-7回收率为75％。
实施例2
1.菌种活化：
本发明采用本实验室分离的一株具有产维生素MK-7能力的一株 纳豆芽孢杆菌(BN-2-6)作为发酵菌种，将-80℃保存的纳豆芽孢杆 菌将纳豆芽孢杆菌在平板培养基中，在温度为121℃条件下，灭菌20 分钟后，再在温度为37℃条件下，活化培养48小时。其中平板培养 基的组成成分为：蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，氯化钠5g/L，琼脂粉 20g/L。然后挑取发育健壮的纳豆芽孢杆菌单菌。
2.种子培养：
将经菌种活化的纳豆芽孢杆菌接种到种子培养液中,在PH为7.2, 在温度为121℃条件下,灭菌20分钟,再在温度为37℃条件下，培养 24小时,得到液体种子。其中，种子培养液的成分为：葡萄糖10g/L， 蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。
3.发酵培养基预处理：
将菌菇副产品(其中菌菇副产品包括平菇、香菇、草菇、金针菇， 含量均为25％)、大豆及豆腐渣在65℃烘箱中进行烘干，含水量为5％， 然后将菌菇副产品、大豆及豆腐渣磨碎，过60目筛网，配置发酵培 养基。该发酵培养基成分包括：80g/L菌菇副产品、20g/L大豆粉及 10g/L豆腐渣、50g/L甘油、6g/LK2HPO4、8g/L麸皮、0.25g/LMgSO4、 0.15g/LZnCl2。将发酵培养基常压蒸煮10min，放置过夜，调PH到 7.0，然后121℃灭菌20分钟，待培养基冷发酵培养基预处理，将发 酵培养基蒸煮5-10分钟后，再在常温下静置10-15小时，在温度为 121℃条件下，灭菌20分钟；再将发酵培养基自然冷却；
4.发酵培养：
在经过预处理的发酵培养基中，按照10％的接种量，接种步骤2得 到的液体种子，并在35℃，以转速200r/min摇瓶,培养8天；
5.喷雾干燥制备成品：
(51)、喷雾干燥，在无菌条件下，往接种后的发酵液中加入保护剂， 在压缩机压力为0.2～0.4MPa条件下，进行喷雾干燥，喷雾干燥进口 温度为150℃，出口温度为60℃，得到固体产品，维生素MK-7含量 为202.32mg/kg。
该保护剂的配方由以下组分组成：40g/L脱脂奶粉，20g/L麦芽 糖，5g/L蔗糖，25g/L甘露醇和20g/LL-谷氨酸钠。
(52)、将步骤(51)中得到的固体产品中加入正丙醇和正己烷混合 物，以转速250r/min摇床震荡60min后，静置15小时；
(53)、收集上清，将经步骤(52)处理的混合液中加入二氯甲烷， 再以250r/min摇床震荡20min，置于-30℃冰箱冷冻24小时；
(54)、吸取有机相，将经步骤(53)处理的混合物，在65℃下，旋 蒸除去有机溶剂，得到淡黄色固体为维生素MK-7。实用本实施例的 方法维生素MK-7回收率为80％。
实施例3
1.菌种活化：
本发明采用本实验室分离的一株具有产维生素MK-7能力的一株 纳豆芽孢杆菌(BN-2-6)作为发酵菌种，将-80℃保存的纳豆芽孢杆 菌将纳豆芽孢杆菌在平板培养基中，在温度为121℃条件下，灭菌20 分钟后，再在温度为37℃条件下，活化培养42小时。其中平板培养 基的组成成分为：蛋白胨6g/L，牛肉膏6g/L，氯化钠6g/L，琼脂粉 20g/L。然后挑取发育健壮的纳豆芽孢杆菌单菌。
2.种子培养：
将经菌种活化的纳豆芽孢杆菌接种到种子培养液中,在PH为7.4, 在温度为121℃条件下,灭菌20分钟,再在温度为40℃条件下，培养 30小时,得到液体种子。其中，种子培养液的成分为：葡萄糖12g/L， 蛋白胨12g/L，氯化钠6g/L。
3.发酵培养基预处理：
将菌菇副产品(其中菌菇副产品包括草菇、金针菇，混合比例1： 1)、大豆及豆腐渣在70℃烘箱中进行烘干，含水量为10％，然后将菌 菇副产品、大豆及豆腐渣磨碎，过32目筛网，配置发酵培养基。该 发酵培养基成分包括：90g/L菌菇副产品，20g/L豆腐渣，60g/L甘 油，7g/LK2HPO4。将发酵培养基常压蒸煮10min，放置过夜，调PH到 7.0，然后121℃灭菌20分钟，待培养基冷发酵培养基预处理，将发 酵培养基蒸煮5-10分钟后，再在常温下静置10-15小时，在温度为 121℃条件下，灭菌20分钟；再将发酵培养基自然冷却；
4.发酵培养：
在经过预处理的发酵培养基中，按照12％的接种量，接种步骤2得 到的液体种子，并在40℃，以转速200r/min摇瓶,培养6天；
5.喷雾干燥制备成品：
(51)、喷雾干燥，在无菌条件下，往接种后的发酵液中加入保护剂， 在压缩机压力为0.2MPa条件下，进行喷雾干燥，喷雾干燥进口温度 为150℃，出口温度为60℃，得到固体产品，维生素MK-7含量为 150.11mg/kg。
该保护剂的配方由以下组分组成：30g/L脱脂奶粉，10g/L麦芽 糖，5g/L蔗糖，25g/L甘露醇和10g/LL-谷氨酸钠。
(52)、将步骤(51)中得到的固体产品中加入正丙醇和正己烷混合 物，以转速180r/min摇床震荡30min后，静置12小时；
(53)、收集上清，将经步骤(52)处理的混合液中加入二氯甲烷， 再以250r/min摇床震荡20min，置于-18℃冰箱冷冻24小时；
(54)、吸取有机相，将经步骤(53)处理的混合物，在65℃下，旋 蒸除去有机溶剂，得到淡黄色固体为维生素MK-7。实用本实施例的 方法维生素MK-7回收率为70％。
本发明的方法制备维生素MK-7,所采用的培养基成分是将菌菇提 取多糖后得到的工业副产品。菌菇包括平菇、香菇、草菇、金针菇等， 如平菇属于担子菌门散菌目侧耳科侧耳属，是种常见的灰色食用菇， 平菇含丰富的营养物质，每百克干品中含蛋白质20—23克，还含有 多种矿物质及多糖等。因此，菌菇作为培养基可以为纳豆芽孢杆菌提 供碳源、氮源。生产过程中产生了大量废弃的菌菇渣，处理不当会成 为二次污染源，造成经济损失或环境恶化。菌菇渣营养丰富，其营养 成分因食用菌种类和栽培主料等不同而有较大差异，但平均情况大致 如下：粗蛋白质平均含量约为8％，粗脂肪平均为0.8％，粗纤维平均 约为17％，无氮浸出物平均约为40％，同时还含有丰富的钙、锌、铜、 磷、铁、镁等矿物质中微量元素。这些菌菇渣可以为纳豆芽孢杆菌合 成MK-7提供充足的碳源，氮源及其他微量元素。
本发明的方法制备维生素MK-7,采用喷雾干燥制得成品。喷雾干 燥主要是通过机械作用，将原料液分散成很细的像雾一样的微粒，与 热空气接触，在瞬间将大部分水分除去，使物料中的固体物质干燥成 粉末。原料液可以是溶液、乳浊液或悬浮液,也可以是熔融液或膏状 物。干燥产品可以根据需要,制成粉状、颗粒状、空心球状或团粒状。 喷雾干燥具传热快、水分蒸发迅速、干燥时间短的特点，且制品质量 好，溶解性能高，适用于热敏性药物，特别是可以用于一些特殊物料 如含糖量高、有活性的物质。
本发明的一种基于纳豆芽孢杆菌发酵制备维生素MK-7的制备方 法，制备工艺简单且易于控制，后加工成本低，生产环境友好，并且 发酵原料是提取菌菇多糖后的副产品，原料易得成本低，而且可以实 现副产品的循环利用。喷雾干燥得到的维生素MK-7粗品无毒性可以直 接添加到食品中作为维生素MK-7的增补剂。经提纯后，可以制成维生 素MK-7类药品。使用本发明的方法制备的维生素MK-7回收率达到70％ 以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在 本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应 包含在本发明的保护范围之内。