青霉酸提高噬菌体产量的用途和方法.pdf

本发明公开了一种青霉酸提高噬菌体产量的用途和方法，通过实验发现，向培养基中加入青霉酸，提高了细菌细胞群体中活细胞的比例，增加了感染中心的数量，从而显著提高了噬菌体的滴度水平，对在工业中噬菌体制剂的制备有着重要意义。本发明在培养基中加入小分子化合物青霉酸，使得铜绿假单胞菌活细胞增多，感染中心数显著增加，形成的噬菌斑数量明显增多，即小分子化合物青霉酸可以显著提高铜绿假单胞菌噬菌体的产量，为噬菌体应用打下基础。

权利要求书
1.  青霉酸提高噬菌体产量的用途。

2.  根据权利要求1所述的青霉酸提高噬菌体产量的用途，其特征在于：所 述噬菌体为铜绿假单胞菌噬菌体。

3.  青霉酸在制备工业中噬菌体制剂中的用途。

4.  根据权利要求1所述的青霉酸在制备工业中噬菌体制剂中的用途，其特 征在于：所述噬菌体为铜绿假单胞菌噬菌体。

5.  一种青霉酸提高铜绿假单胞菌噬菌体产量的方法，其特征在于：在铜绿 假单胞菌培养基中加入青霉酸。

6.  根据权利要求5所述的青霉酸提高铜绿假单胞菌噬菌体产量的方法，其 特征在于：所述青霉酸加入的终浓度为100μM。

7.  根据权利要求5所述的青霉酸提高铜绿假单胞菌噬菌体产量的方法，其 特征在于：所述青霉酸提高噬菌体感染过程中感染中心的数量。

8.  青霉酸在制备治疗由铜绿假单胞菌引起的相关疾病的制剂中的应用。

9.  根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述疾病包括肺炎、烧伤感 染。

10.  一种铜绿假单胞菌抑菌剂，其特征在于：包括青霉酸。

说明书青霉酸提高噬菌体产量的用途和方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小分子化合物青霉酸能够显著提高 噬菌体产量，以及采用青霉酸提高铜绿假单胞菌噬菌体产量的方法。
背景技术
自然界中，噬菌体广泛存在于各种环境中，其数量大约是细菌数量的10倍， 给细菌的生存带来巨大选择压力。然而，宿主菌面对着巨大的被捕食压力，更是 进化出多种机制抵御噬菌体感染。铜绿假单胞菌是一种可以引起慢性感染的条件 致病菌，是造成医院内感染最普遍的条件致病菌之一，尤其是烧伤病人、肺炎患 者等免疫力低下的人极易感染这种病原菌。抗生素的大量使用使铜绿假单胞菌不 断出现耐药菌，单纯利用抗生素治疗已经不能满足需求，亟需新型杀菌剂，噬菌 体成为最好的候选杀菌因子。
噬菌体的生产是通过感染宿主菌进行的，获得高浓度噬菌体是噬菌体应用的 前体。一般情况下，提高微生物产品的生产水平，途径之一是增加微生物的生物 量。然而，平衡期高密度宿主菌细胞存在条件下，噬菌体产量反而下降。
发明内容
本发明目的在于提供一种提高铜绿假单胞菌噬菌体产量的方法，为噬菌体制 剂在工业中的应用奠定基础。本发明通过加入小分子化合物青霉酸，显著提高铜 绿假单胞菌噬菌体的产量，对在工业中噬菌体制剂的制备有着重要意义。
本发明实现目的的技术方案如下：
青霉酸提高噬菌体产量的用途。
而且，所述噬菌体为铜绿假单胞菌噬菌体。
青霉酸在制备工业中噬菌体制剂中的用途。
而且，所述噬菌体为铜绿假单胞菌噬菌体。
一种青霉酸提高铜绿假单胞菌噬菌体产量的方法，在铜绿假单胞菌培养基中 加入青霉酸。
而且，所述青霉酸加入的终浓度为100μM。
而且，所述青霉酸提高噬菌体感染过程中感染中心的数量。
青霉酸在制备治疗由铜绿假单胞菌引起的相关疾病的制剂中的应用。
所述疾病包括肺炎、烧伤感染。
一种铜绿假单胞菌抑菌剂，包括青霉酸。
本发明的优点和积极效果是：
本发明在培养基中加入小分子化合物青霉酸，使得铜绿假单胞菌活细胞增 多，感染中心数显著增加，形成的噬菌斑数量明显增多，即小分子化合物青霉酸 可以显著提高铜绿假单胞菌噬菌体的产量，为噬菌体应用打下基础。
本发明涉及的化合物为青霉酸(CAS number 90-65-3)，英文名称为penicillic  acid，分子式为C8H10O4，分子量为170.16，通过实验发现，向培养基中加入青 霉酸，提高了细菌细胞群体中活细胞的比例，增加了感染中心的数量，从而显著 提高了噬菌体的滴度水平，对在工业中噬菌体制剂的制备有着重要意义。
附图说明：
图1为噬菌体K5在感染处于不同生长周期的宿主菌铜绿假单胞菌PAK-AR2 后，形成噬菌斑能力的变化图；
图2为宿主菌在平衡期形成的噬菌体K5感染中心数与生长到对数期相比 图；
图3为宿主菌休眠细胞培养比例图；
图4为在青霉酸作用下噬菌体感染中心数随着宿主菌生长周期图；
图5为在青霉酸作用下噬菌体感染变化图；
图6为青霉酸显著提高了噬菌体形成噬菌斑的能力图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不 是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
青霉酸提高噬菌体产量的用途和方法，本发明为了证实青霉酸对噬菌体的作 用，具体验证即操作步骤如下：
1、所用菌株为铜绿假单胞菌PAK-AR2；
2、所用噬菌体为噬菌体K5；
3、青霉酸的制备：利用色谱纯无水乙醇溶解固体青霉酸，配制成10mg/mL， -20℃避光保存。准备用于所需实验，使用终浓度为100μM；
4、不同生长周期宿主菌形成噬菌斑能力测定：以30％接种量转接过夜培养 物铜绿假单胞菌，分别加到有化合物青霉酸和不加青霉酸的LB培养基中，35℃， 160rpm振荡培养。从0h开始，每隔2h取样，作为指示菌与噬菌体混合。将 上述不同时间点的混合物与半固体混合后，倒双层平板，37℃，静置培养4h-6h， 计数噬菌斑数量。
5、不同生长周期宿主菌形成噬菌体感染中心能力测定：以30％接种量转接 过夜培养物铜绿假单胞菌，加到有化合物青霉酸的LB培养基中，35℃，160rpm 振荡培养。从0点开始，每隔2h取样，作为噬菌体K5宿主菌，从2h开始不 同生长周期宿主菌通过稀释保持与2h大致相同的吸光度值，加入50μL经过 稀释大约为105PFU/ml噬菌体K5(保证MOI<0.1)，混匀。上述混合物静置吸 附10min，13000rpm离心1min，弃上清。用新鲜LB洗上述得到的沉淀物一次， 13000rpm离心1min，弃上清，将沉淀重悬于10ml LB中，10min时取样，与 新鲜指示菌混合，制双层平板，37℃静置培养，4-6h后计数出现的噬菌斑数 量，计算宿主菌不同生长周期形成的噬菌体感染中心数。
6、活细胞数的测定：以30％接种量转接过夜培养物铜绿假单胞菌于加有化 合物青霉酸的LB培养基中，转接前先将过夜培养物离心，去除上清中副产物的 影响，35℃，160rpm振荡培养。从0h开始每隔2h取样，经过稀释，取适当 稀释度下的菌液100μL，涂布于LB固体培养基上，37℃过夜培养，计数平板 上出现的活菌数。
7、流式细胞仪对不同生长周期宿主细胞亚群的测定：本发明选用试剂盒 LIVE/BacLightTM Bacterial Viability Kits对宿主不同生长周期的细胞进行 染色。以30％接种量转接过夜培养物铜绿假单胞菌，转接前先将过夜培养物离心， 去除上清中副产物的影响，35℃，160rpm振荡培养。分别在菌株生长到2h、6 h和12h取样，5000rpm离心5min，弃上清，利用0.85％生理盐水洗菌体2-3 次后，用0.85％生理盐水重悬。将上述得到的不同生长周期的重悬菌液进行稀释 至106cell/mL，以1:1的比例分别与SYTO9和PI混合，避光染色60min。将上 述的染色液5000rpm离心5min，弃上清，利用0.85％生理盐水洗菌体3-4次， 尽量去除游离的染色剂，然后用4％多聚甲醛固定染色细胞，过夜。将上述固定 过夜的细胞，再次利用0.85％生理盐水洗菌体，并重悬。设定流式细胞仪(BD 公司)上样条件，将上述得到的样品经过流式细胞仪检测。
8、不同生长周期宿主菌对噬菌体释放量即裂解能力的影响：以铜绿假单胞 菌为宿主菌，分别取1mL不同生长周期铜绿假单胞菌与50μL经过稀释大约为 105PFU/mL噬菌体K5混合(保证MOI<0.1)，静置吸附10min，13000rpm离 心1min，弃上清，去除没有吸附的自由噬菌体颗粒数，利用新鲜LB重悬宿主 菌，洗一次，去除剩余的噬菌体颗粒数，将宿主菌与吸附噬菌体混合物重悬于 10ml LB中。根据噬菌体K5的一步生长曲线，分别在噬菌体侵染10min和60min 取样与敏感指示菌混合制双层平板。37℃培养，4-6h后计数出现的噬菌斑数量。 实验重复三次。噬菌体释放量＝60min噬菌体颗粒数/10min噬菌体颗粒数。
9、小分子化合物青霉酸对噬菌体滴度的影响测定：实验分为两组，分别转 接铜绿假单胞菌过夜培养物，一组加入青霉酸终浓度为100μM，一组作为对照 组。从0h开始每隔2h分别取4mL不同生长周期宿主菌于无菌试管中，以大 约1:1的比例加入噬菌体K5，37℃，220rpm振荡培养4h，以培养2h的铜绿 假单胞菌为指示菌，利用双层平板法测定噬菌体滴度。
结果分析：
图1显示了噬菌体K5在感染处于不同生长周期的宿主菌铜绿假单胞菌 PAK-AR2后，形成噬菌斑能力的变化。在不同生长周期中均以相同数量的噬菌 体感染相同数量的宿主菌，理论上产生的噬菌斑数量应该相当，但是，结果显示 处于不同时期的宿主菌形成的噬菌斑数量差别较大。噬菌斑数量在0h到2h之 间上升，随后，随着宿主菌铜绿假单胞菌PAK-AR2生长周期的延长，噬菌斑的 数量逐渐下降。宿主菌生长到2h对数生长期出现的噬菌斑数量是宿主菌生长到 12h平衡期出现噬菌斑数量的73.2倍。
图2显示了宿主菌在平衡期形成的噬菌体K5感染中心数与生长到对数期相 比下降了93.3倍。随着宿主菌的生长细胞数逐渐增多，噬菌体K5的吸附率几乎 不发生变化，说明噬菌体能感染宿主细胞。
图3显示了宿主菌休眠细胞在宿主菌生长到2h、6h和12h时所占的比例 分别为27.9％、84％和95.1％，休眠细胞比例随着宿主生长周期的延长逐渐升高。
图4显示了在青霉酸作用下，噬菌体感染中心数随着宿主菌生长周期的延长 下降比例减小，宿主菌生长到4h时，加入青霉酸后感染中心数提高6.2倍，生 长到12h时平衡期感染中心数提高4.3倍。
图5显示了在青霉酸作用下，噬菌体感染中心增加，活细胞数也相应增加， 在平衡期活细胞数提高了11.1倍。
图6显示了青霉酸显著提高了噬菌体形成噬菌斑的能力，当以生长到12h 和14h平衡期的宿主菌作为指示菌时，加入青霉酸噬菌体形成的噬菌斑数量分 别比不加青霉酸提高了29.8倍和33.6倍。
菌株PAK-AR2来源于下列文献:Wang J,Mushegian A,Lory S,Jin S(1996) Large-scale isolation of candidate virulence genes of Pseudomonas aeruginosa by in  vivo selection.Proc Natl Acad Sci U S A 93(19):10434-9。噬菌体K5来源于下列文 献:Li L,Yang H,Lin S,Jia S(2010)Classification of 17newly isolated virulent  bacteriophages of Pseudomonas aeruginosa.Can J Microbiol 56(11):925-33 doi:10.1139/w10-075。