可用于检测与大肠癌相关的CMTM3基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用.pdf

本发明公开了可用于检测与大肠癌相关的CMTM3基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，特点是该试剂盒包括一对CMTM3基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，其中上游引物具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，甲基化特异性测序引物如SEQ ID NO.3所示，优点是该诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对大肠癌的检测，检测效率高，针对性强，同时，以CMTM3基因启动子区甲基化为靶点的药物有望成为大肠癌辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。

权利要求书
1.  一种可用于检测与大肠癌相关的CMTM3基因启动子区甲基化程度的试剂盒，其特征在于包括CMTM3基因启动子区的甲基化特异性扩增上游引物、下游引物及其甲基化特异性测序引物，其中所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
5’-Biotin -AGATAGTTTTTTTGGATAGGGGTAGA-3’；
所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
5’-CCACCTTCTTCTTCACCCTAAT-3’；
所述的甲基化特异性测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：
5’-CTTCTTCTTCACCCTAATT-3’。

2.  一种可用于检测与大肠癌相关的CMTM3基因启动子区甲基化程度的试剂盒的应用，其特征在于：该试剂盒可用于大肠癌辅助检测、诊断或药物治疗中。

说明书可用于检测与大肠癌相关的CMTM3基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种辅助诊断大肠癌的检测试剂盒，尤其是涉及一种可用于检测与大肠癌相关的CMTM3基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用。
背景技术
大肠癌(Colorectal Cancer，CRC)又称结直肠癌，是消化系统中常见的恶性肿瘤。目前研究表明大肠癌是大肠黏膜上皮细胞在遗传和环境等多种复杂的因素共同作用下，发生遗传和表观遗传的改变而获得无限增殖，躲避凋亡程序等能力，从而在局部形成肿块。近年来，随着人们生活水平的提高，饮食习惯与结构的改变，加之人口老龄化趋势的影响，我国大肠癌的发病率和死亡率增长迅速，而且发病年龄明显提前。世界卫生组织(WHO)发布的《全球癌症报告2014》显示中国癌症新增病例和死亡人数的绝对数值位居世界首位。其中以胃癌、食道癌、大肠癌为代表的消化道癌症威胁最为显著。尽管目前手术方式和辅助治疗手段不断改进，大肠癌的患者的术后生存情况有了较大的改善，但是CRC患者的五年总体生存率仍旧不高，其中最重要的一个因素就是，许多患者在疾病发生的早期没有得到及时的诊断和治疗。因此，有必要探索其他分子指标独立或者联合CEA 等检测，对大肠癌患者做到早发现，早诊断，早治疗，提高大肠癌患者总体生存率。
趋化素样因子超家族成员3(CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing family member 3，CMTM3) 是趋化素样因子超家族（Chemokine-Like Factor Family，CKLFSF）中的一员。趋化素样因子超家族成员3是由位于16号染色体的趋化素样因子超家族成员3基因(CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing family member 3, CMTM3)(chr16:66，637，935-66，647，795)编码而成的。国内外已有大量研究报道了趋化素样因子超家族成员3(CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing family member 3，CMTM3)能通过诱导细胞凋亡抑制肿瘤的生长，并且也阐明趋化素样因子超家族成员3(CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing family member 3, CMTM3)启动子区高甲基化的表观遗传修饰与消化系统肿瘤发病的关系。但是大部分研究均是对甲基化定性检测方法，灵敏性特异性均较低。目前，国内外还没有公开任何关于用于定量检测大肠癌中趋化素样因子超家族成员3基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测方便、针对性强、检测准确率高的可用于检测与大肠癌相关的CMTM3基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，其中基因CMTM3甲基化水平与大肠癌的患病率呈正相关，可通过对样品DNA甲基化水平测定辅助诊断大肠癌。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种可用于检测与大肠癌相关的CMTM3基因启动子区甲基化程度的试剂盒，包括CMTM3基因启动子区的甲基化特异性扩增上游引物、下游引物及其甲基化特异性测序引物，其中所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
5’-Biotin -AGATAGTTTTTTTGGATAGGGGTAGA-3’；
所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
5’-CCACCTTCTTCTTCACCCTAAT-3’；
所述的甲基化特异性测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：
5’-CTTCTTCTTCACCCTAATT-3’。
一种可用于检测与大肠癌相关的CMTM3基因启动子区甲基化程度的试剂盒的应用，该试剂盒可用于大肠癌辅助检测、诊断或药物治疗中。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了可用于检测与大肠癌相关的CMTM3基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，所述的检测试剂盒包含趋化素样因子超家族成员3基因启动子区的甲基化特异性上游引物、甲基化特异性下游引物及其甲基化特异性测序引物。趋化素样因子超家族成员3基因启动子区域的高甲基化，影响转录因子与DNA间的相互作用，或改变染色质结构从而导致趋化素样因子超家族成员3基因的低表达，从而影响大肠癌的发生和发展。因此，趋化素样因子超家族成员3基因启动子区甲基化水平与大肠癌的患病率呈正相关，通过检测趋化素样因子超家族成员3基因启动子区甲基化程度辅助诊断大肠癌，简单、方便，检测效率高，针对性强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于大肠癌的早期发现和及时治疗。
综上所述，以基因CMTM3启动子区域甲基化水平为基础的诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对大肠癌的检测，同时，以CMTM3基因启动子区域DNA甲基化为靶点的药物有望成为大肠癌辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。
附图说明
图1为被检测序列所在区域（具体位置为chr16:66,638,384-66,638,441），以及所检测的7个CpG点之间的关联性分析结果（例如CpG1与CpG2的相关系数为0.842，CpG2与CpG3的相关系数为0.933）；
图2为DNA甲基化水平检测结果示意图（如图示CpG1到CpG7的甲基化程度分别为49%，46%，51%，46%，42%，49%，42%）；图中阴影部分显示的是对应CpG位点的信号强度，结合该位点附近碱基种类可分析得到其甲基化水平（即阴影框对应的上方数字）。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例
1、研究对象的收集
本研究选取宁波市某三甲医院手术切除的大肠癌患者42例手术标本作为研究对象。所有病例诊断，依据患者的临床资料、影像学和结肠镜检查等，并得到术后病理诊断确认。手术切除大肠癌组织和癌旁组织（距离癌组织至少5cm以上的正常组织）立即保存于-80度液氮，用于日后组织标本全基因组DNA提取。所有研究对象都签署知情同意书。
2、基因组DNA的提取
采用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, 德国)DNA提取试剂盒提取组织全基因组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计(美国，Thermo Fisher Scientific)检测所得DNA的浓度，以供CMTM3基因启动子区DNA甲基化水平的检测。
3、DNA甲基化水平测定
本实验采用焦磷酸测序技术对CMTM3基因启动子区的7个CpG位点(如图1)进行了DNA甲基化水平分析。此技术的基本原理：用重亚硫酸盐处理DNA样品后，再应用聚合酶链反应(PCR)扩增，可使发生甲基化的胞嘧啶(C)碱基保持不变，而使未发生甲基化的C转变成了尿嘧啶(U)，然后通过测序引物进行PCR测序，从而得到哪个位点发生了甲基化。本次研究采用PyroMark Assay Design软件进行引物设计，用于实验的PCR扩增引物和测序引物如下：
甲基化特异性上游引物的核苷酸序列如下：
5’-Biotin -AGATAGTTTTTTTGGATAGGGGTAGA-3’；
甲基化特异性下游引物的核苷酸序列如下：
5’-CCACCTTCTTCTTCACCCTAAT-3’；
甲基化特异性测序引物的核苷酸序列如下：
5’-CTTCTTCTTCACCCTAATT-3’。
DNA甲基化水平测定的具体步骤：
第一步：采用EZ DNA 甲基化试剂盒-Gold(EZ DNA Methylation-GoldTM Kit； ZYMO RESEARCH)对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化；
第二步：取第一步中转化过的DNA样本20ng加入到Zymo TaqTM PreMix酶(Zymo TaqTM PreMix，ZYMO RESEARCH)，并加入上述趋化素样因子超家族成员3基因启动子区甲基化特异性扩增上游引物和下游引物，进行PCR扩增，扩增条件：首先95℃ 10min的变性；接着95℃ 30s，Tm 40s，72℃1min，共45个循环的退火反应；然后延伸反应72℃ 7min (注：Tm在实验中根据跑PCR梯度温度确定)；
第三步：焦磷酸测序的前期准备：在PSQ24板中预先加入40μl含有0.3μM上述甲基化特异性测序引物的退火缓冲液(PyroMark Annealing Buffer； Qiagen)；将需要使用的混匀的琼脂糖珠总量(每样本3μl)转移到一个微量离心管中；在琼脂糖珠中加入结合缓冲液(PyroMark Binding Buffer；Qiagen)，使得平均每个样品约有50μl的体积，将混合物混匀；将以上混合物加入PCR产物(50μl反应体积)中，每样本50μl；将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入50ml的高纯水、70％乙醇、洗涤缓冲液(PyroMark Wash Buffer； Qiagen)和50ml的变性缓冲液(PyroMark Denaturation Solution；Qiagen)；打开真空预备工作站的泵，将真空准备工具在高纯水中清洗30秒；然后将真空准备工具(PyroMark Vacuum Prep Filter Probes； Qiagen)移到PCR板中，抓取琼脂糖珠(在磁珠与PCR产物结合后三分钟内完成此操作)；拿起PCR板，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具放入70％乙醇中5秒；然后移到变性缓冲液中5秒；再移到洗涤缓冲液中清洗5－10秒；关掉泵；将真空准备工具放入含有测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠(测序引物也可最后加入)；使用高纯水清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80℃3分钟，再冷却到室温，即可进行焦磷酸测序反应；
第四步：焦磷酸测序：在PyroMark Q24焦磷酸测序仪上，采用Pyromark Gold Q24试剂盒(Pyromark Gold Q24 Reagents； Qiagen)对第三步中的PSQ24板中的样本进行测序，然后应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析(甲基化水平检测结果示例见图2)。图2中所示百分数为对应CpG位点的甲基化程度，如图2所示CpG1到CpG7的甲基化程度分别为49%，46%，51%，46%，42%，49%，42%。
4、数据分析
本次实验采用SPSS 16.0对数据进行整理分析，我们发现：被检测的7个CpG位点间存在显著关联(相关系数r > 0.82，p < 0.0001，有统计学意义，见图1)(注：p < 0.05时表示有统计学意义，下同)，所以我们把CpG1-CpG7求平均值后参与到后续的分析中，发现病例组和对照组之间的DNA甲基化水平存在显著差异(p = 0.0000517，见表 1)。
表 1 病例组与对照组间的比较(n=42) 甲基化位点病例组(Mean±SD)对照组 (Mean±SD)P 值CpG1(%)23.62±19.5211.33±10.296.14×10-4CpG2(%)22.95±17.478.60±9.081.38×10-5CpG3(%)25.83±19.5711.88±10.821.44×10-4CpG4(%)22.50±16.009.60±8.612.07×10-5CpG5(%)21.98±16.8910.17±9.792.14×10-4CpG6(%)22.26±18.587.67±8.302.04×10-5CpG7(%)17.12±14.847.24±7.372.75×10-4平均CMTM3甲基化 (%)22.32±16.889.50±8.985.17×10-5
注：n表示样本个数，p值小于0.05，具有统计学意义；
与其他传统的大肠癌检测技术相比，此试剂盒技术具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点。本发明采用上述试剂盒对CMTM3基因启动子区甲基化水平进行检测，能够快速可靠地为大肠癌的辅助诊断、检测或筛查药物提供借鉴。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。