一种皱盖假芝单峰多糖F212及其制备方法和应用.pdf

本发明公开了一种用于增强免疫功效的皱盖假芝单峰多糖F212及其制备方法，其质量百分比的单糖组成为：核糖4.3％，鼠李糖0.7％，阿拉伯糖5.3％，木糖4.5％，甘露糖30.5％，葡萄糖37.3％，半乳糖17.4％；该单峰多糖是从皱盖假芝子实体中经热水浸提、酒精沉淀分离后，依次采用葡聚糖凝胶柱、DEAE sepharose fast flow纯化，并经过小鼠脾淋巴细胞和/或小鼠单核巨噬细胞白血病细胞进行活性筛选后得到。食用菌多糖的生物活性和功能已受到国内外的广泛关注，本发明申请的研究表明，皱盖假芝单峰多糖F212具有明显的免疫调节活性，可以增强免疫功效，具有广阔的应用前景和良好的经济价值。

权利要求书
1.  一种皱盖假芝单峰多糖F212，其特征在于，所述皱盖假芝单峰多糖F212的质量百分比的 单糖组成为：核糖4.3％，鼠李糖0.7％，阿拉伯糖5.3％，木糖4.5％，甘露糖30.5％，葡萄糖 37.3％，半乳糖17.4％。

2.  如权利要求1所述的一种皱盖假芝单峰多糖F212，其特征在于，所述皱盖假芝单峰多糖 F212的分子量为4.5852e3g/mol。

3.  一种皱盖假芝单峰多糖F212的制备方法，其特征在于，所述多糖F212是从皱盖假芝子实 体中经热水浸提、酒精沉淀分离后，依次采用葡聚糖凝胶柱、DEAE sepharose fast flow纯化， 并经过小鼠脾淋巴细胞和/或RAW264.7细胞进行活性筛选后得到。

4.  如权利要求3所述的一种皱盖假芝单峰多糖F212的制备方法，其特征在于，包括：
(1)将皱盖假芝子实体经干燥、粉碎、水浸提，得到皱盖假芝水提液，向水提液中加入酒精， 调节至酒精质量百分浓度为80％，常温静置后离心，将沉淀分离收集沉淀物，得到皱盖假芝 粗多糖F1；
(2)溶解F1组分，加入酒精至酒精浓度为质量百分浓度80％，常温静置，得到沉淀物为粗 多糖F2；
(3)采用葡聚糖凝胶柱对F2纯化，洗脱液为水；
(4)再采用DEAE sepharose fast flow进行纯化，采用氯化钠溶液作为洗脱液进行梯度洗脱， 收集得到4个组分；
(5)采用淋巴细胞和/或巨噬细胞对4个组分进行活性筛选，得到活性最好的组分F21；
(6)采用Sephaacyl S-200chromatography对组分F21进行纯化，用水进行洗脱，收集得到4 个组分；
(7)采用淋巴细胞和/或巨噬细胞对4个组分进行活性筛选，得到活性最好的组分F212。

5.  如权利要求4所述的一种皱盖假芝单峰多糖F212的制备方法，其特征在于，所述作为步 骤(4)的洗脱液的氯化钠溶液的浓度分别为0.1、0.5、1、2Mol/l。

6.  如权利要求4所述的一种皱盖假芝单峰多糖F212的制备方法，其特征在于，所述采用淋 巴细胞进行活性筛选包括：(1)制备淋巴细胞液；(2)向淋巴细胞液中加入样品组分；(3) 培养后测定淋巴细胞的增殖情况。

7.  如权利要求4所述的一种皱盖假芝单峰多糖F212的制备方法，其特征在于，所述采用巨 噬细胞进行活性筛选包括：：(1)制备巨噬细胞悬液；(2)孵育后向巨噬细胞悬液中加入样品 组分；(3)培养后测定巨噬细胞的增殖情况。

8.  一种皱盖假芝单峰多糖F212的应用，其特征在于，所述多糖F212用于增强免疫。

9.  如权利要求8所述的一种皱盖假芝单峰多糖F212的应用，其特征在于，所述多糖F212 用于增强淋巴细胞和/或巨噬细胞。

10.  一种免疫增强剂，其特征在于，包括有效量的如权利要求1或2中所述的皱盖假芝单峰 多糖F212和药学上可接受的载体。

说明书一种皱盖假芝单峰多糖F212及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种单峰多糖，具体涉及一种皱盖假芝单峰多糖F212及其制备方法和应用。
背景技术
20世纪80年代以来，困扰人们健康生活，甚至威胁生命的慢性病，如肥胖症、高血压 病、糖尿病、高胰岛素血症等发病率逐年都在增长之中，而且发展势头迅猛。据卫生部门统 计，过去10年，中国每年增加1000万慢性疾病患者，中国目前有2.6亿人患有糖尿病、肺 病、肿瘤、心血管病等慢性疾病。慢性疾病患病率快速攀升,发病率和死亡率居高不下,已成 为威胁我国人民健康的主要问题。此类状况在国外波及的人群也相当广泛，引起了人们的急 切关注，被称为代谢综合征的病症。该代谢综合征包括一组疾病，它们都与机体物质代谢存 在着密切的关系，它们的共同特点之一就是：其相应的免疫功能或偏低或低下，抵御细菌、 病毒侵袭的能力降低，只要稍遇气候变化，或与感冒病人接触等，就很容易罹患呼吸道感染、 感冒等病症。国内也有研究表明中老年人患慢性病及肿瘤与脾缩小和T细胞免疫功能低下成 正相关。
现代分子细胞生物学研究发现，调节免疫反应平衡是改善亚健康、防止慢性病，恢复健 康的科学途径。健康的免疫系统能有助于机体抵御多种病毒、细菌，使机体有效对抗日常生 活的不同感染来源。
全球免疫性疾病药物市场可谓最具潜力的用药市场之一，未来5年年均复合增长率将达 到10.7％，2017年总额将达到614亿美元，规模仅次于抗肿瘤和心脑血管药物市场。
发明内容
针对以上不足，本发明的目的之一在于提供一种用于增强免疫功效的皱盖假芝单峰多糖 F212。
一种皱盖假芝单峰多糖F212，按照质量百分比的单糖组成为：核糖4.3％，鼠李糖0.7％， 阿拉伯糖5.3％，木糖4.5％，甘露糖30.5％，葡萄糖37.3％，半乳糖17.4％。
进一步的，上述皱盖假芝单峰多糖F212的分子量为4.5852e3g/mol。
本发明的另一目的在于提供一种皱盖假芝单峰多糖F212的制备方法，该多糖F212是从 皱盖假芝子实体中经热水浸提、酒精沉淀分离后，依次采用葡聚糖凝胶柱、DEAE sepharose fast  flow纯化，并经过小鼠脾淋巴细胞和/或RAW264.7细胞进行活性筛选后得到。
进一步优选的，一种皱盖假芝单峰多糖F212的制备方法，包括：
(1)将皱盖假芝子实体经干燥、粉碎、水浸提，优选用热水进行浸提，得到皱盖假芝水 提液，向水提液中加入酒精，优选为质量百分浓度为95％-100％的酒精，进一步优选为质量 百分浓度为95％的酒精，调节至酒精质量百分浓度为80％，常温静置(优选静置过夜)后离 心，将沉淀分离收集沉淀物，得到皱盖假芝粗多糖F1；
(2)溶解F1组分，加入酒精优选加入质量百分浓度为95％的酒精至酒精浓度为质量百 分浓度80％，常温静置，优选静置过夜，得到沉淀物为粗多糖F2；
(3)采用葡聚糖凝胶柱对F2纯化，洗脱液为水，优选为纯水；
(4)再采用DEAE sepharose fast flow进行纯化，采用氯化钠溶液作为洗脱液进行梯度洗 脱，流速优选为20-40ml/min，氯化钠溶液的浓度优选为0.1、0.5、1、2Mol/l，收集得到4个 组分；
(5)采用淋巴细胞和/或巨噬细胞对4个组分进行活性筛选，得到活性最好的组分F21；
(6)采用Sephaacyl S-200 chromatography对组分F21进行纯化，用水优选纯水进行洗脱， 优选根据紫外吸收强度(例如100、500、50、9)收集，收集得到4个组分；
(7)采用淋巴细胞和/或巨噬细胞对4个组分进行活性筛选，得到活性最好的组分F212。
优选的，上述制备方法中的采用淋巴细胞进行活性筛选的过程包括：(1)制备淋巴细胞 液；(2)向淋巴细胞液中加入样品组分；(3)培养后测定淋巴细胞的增殖情况。
优选的，上述制备方法中的采用巨噬细胞进行活性筛选的过程包括：(1)制备巨噬细胞 悬液；(2)孵育后向巨噬细胞悬液中加入样品组分；(3)培养后测定巨噬细胞的增殖情况。
优选的，上述淋巴细胞可以为小鼠脾淋巴细胞。
优选的，上述巨噬细胞可以为巨噬细胞RAW264.7细胞。
本发明的另一目的在于提供一种皱盖假芝单峰多糖F212的应用，用于增强免疫，具体地， 所述多糖F212用于增强淋巴细胞和/或巨噬细胞，其中，淋巴细胞可以优选为小鼠脾淋巴细 胞，巨噬细胞可以优选为巨噬细胞RAW264.7细胞。
本发明的另一目的在于提供一种免疫增强剂，包括有效量的上述皱盖假芝单峰多糖F212 和药学上可接受的载体。
本发明提供了一种皱盖假芝单峰多糖F212及其制备方法和应用，食药用菌因其丰富的营 养和良好的提高机体免疫的功效在东方国家得到普遍使用，用来预防多种疾病，食用菌多糖 的生物活性和功能已受到国内外的广泛关注，本发明申请的研究表明，皱盖假芝单峰多糖 F212具有明显的免疫调节活性，可以增强免疫功效，具有广阔的应用前景和良好的经济价值。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1：一种皱盖假芝单峰多糖F212的制备方法：
(1)将皱盖假芝子实体经干燥、粉碎后，采用热水进行浸提，得到皱盖假芝水提液，向 水提液中加入质量百分浓度为95％的酒精至酒精质量百分浓度为80％，常温静置过夜后离心， 将沉淀分离收集沉淀物，得到皱盖假芝粗多糖F1；
(2)用水溶解F1组分，加入质量百分浓度为95％的酒精至酒精浓度为质量百分浓度 80％，常温静置过夜，得到沉淀物为粗多糖F2；
(3)采用葡聚糖凝胶柱对F2纯化，洗脱液为纯水；
(4)继续采用DEAE sepharose fast flow对步骤(3)产物进行纯化，依次分别采用0.1、 0.5、1、2Mol/l氯化钠溶液作为洗脱液进行梯度洗脱，流速为20ml/min，分别收集得到4个 组分；
(5)采用小鼠脾淋巴细胞和/或巨噬细胞RAW264.7细胞对4个组分进行活性筛选，最 后得到活性最好的组分F21；
(6)采用Sephaacyl S-200 chromatography对组分F21进行纯化，用纯水进行洗脱选根据 紫外吸收强度收集，收集得到4个组分，紫外吸收强度分别为：100,500,50,9；
(7)采用小鼠脾淋巴细胞和/或巨噬细胞RAW264.7细胞对4个组分进行活性筛选，得 到活性最好的组分F212。
其中，上述制备方法中采用小鼠脾淋巴细胞进行活性筛选的具体过程为：
(1)制备淋巴细胞液：健康Balb/c小鼠采用颈椎脱臼法处死后，全部浸泡在75％质量 百分浓度的酒精中约3分钟消毒；在超净工作台中，剪开皮肤暴露腹膜，剪开腹膜，用眼科 剪刀和镊子无菌取脾并置于无血清的不完全RPMI-1640培养液中，冲洗2次，用5ml一 次性注射器吸取约5ml不完全RPMI-1640培养液，轻轻插入脾内吹出细胞，如此重复操作 数次至脾外膜透明，余下脾脏用注射器研磨并过100目筛。充分收集全部脾细胞悬液，移入 离心管中，1000*g离心5分钟弃上清，加入Tris-NH4Cl约3ml裂解掺杂的红细胞，用移 液枪轻轻吹匀，1000*g离心5分钟弃上清，重复此操作2次；用移液枪吸取不完全 RPMI-1640培养液将细胞沉淀重悬，并轻轻吹匀，1000*g离心5分钟弃上清。用含血清的 完全RPMI-1640培养液将细胞沉淀重悬，细胞计数，并调整细胞密度为105个/mL，制得小 鼠脾淋巴细胞悬液。
(2)向淋巴细胞液中加入样品组分：将得到的小鼠脾淋巴细胞悬液加入96孔细胞培养 板中，除空白对照组外，每孔100μl，每孔分别加入待筛选的样品组分。
(3)培养后测定淋巴细胞的增殖情况：将96孔细胞培养板置于37℃、5％(质量百分 比)CO2培养箱中连续培养44小时；取出培养板，每孔加入20μl配置好的MTT(3-(4， 5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐))液，继续培养4小时；1800*g离心10分钟弃 上清，每孔加入150μl DMSO(二甲基亚砜)终止反应，振荡10分钟至形成的紫色结晶完 全溶解；用酶标仪于570nm处测定吸光度A值，以测定的吸光度A值的高低来反映小鼠 脾淋巴细胞增殖的情况强弱，从而判定组分的活性高低。
其中，上述制备方法中采用小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7细胞进行活性筛选 的具体过程为：
(1)制备巨噬细胞悬液：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入50μL，铺板 使细胞密度至3000/孔，其中，边缘孔用无菌PBS填充。
(2)孵育后向巨噬细胞悬液中加入样品组分：5％(质量百分浓度)CO2，37℃孵育，至 细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，每孔分别加入待筛选的样品组分，每孔50μL，每组分 设三个重复。
(3)培养：5％(质量百分浓度)CO2，37℃孵育44h，倒置显微镜下观察。
(4)测定巨噬细胞的增殖情况：每孔加入20μL MTT溶液(5mg·mL-1，即0.5％MTT)， 继续培养4h，1800*g离心10分钟弃上清，每孔加入150μl DMSO(二甲基亚砜)终止反应， 振荡10分钟至形成的紫色结晶完全溶解；用酶标仪于570nm处测定吸光度A值，以测定 的吸光度A值的高低来反映小鼠脾淋巴细胞增殖的情况强弱，从而判定组分的活性高低。
实施例2：实施例1的一种皱盖假芝单峰多糖F212的验证。
采用凝胶渗透色谱和气质联用分析分别对将实施例1得到的单峰多糖F212检测分子量和 单糖组成，经检测F212的分子量为4.5852e3g/mol，F212的单糖组成为(质量百分比)核糖 4.3％，鼠李糖0.7％，阿拉伯糖5.3％，木糖4.5％，甘露糖30.5％，葡萄糖37.3％，半乳糖17.4％。
实施例3：实施例1得到的单峰多糖F212对淋巴细胞的促增殖实验
将实施例1得到的皱盖假芝单峰多糖F212，采用纯水配制成四个不同浓度的单峰多糖溶 液样品，每个浓度三个重复，向四个不同浓度的多糖溶液样品中加入淋巴细胞，细胞浓度为 105/mL，作用48小时后，MTT法检测各样品溶液中淋巴细胞的增殖程度，计算增长率，如 表1所示。
表1：不同多糖溶液样品中的淋巴细胞增长率


实施例4：实施例1得到的单峰多糖F212对RAW264.7细胞的促增殖实验
将实施例1得到的皱盖假芝单峰多糖F212，采用纯水配制成四个不同浓度的单峰多糖溶 液样品，每个浓度三个重复，向四个不同浓度的多糖溶液样品中加入RAW264.7细胞，每孔 3000个，作用48小时后，MTT法检测各样品溶液中RAW264.7细胞的增殖程度，计算增长 率，如表2所示。
表2：不同多糖溶液样品中的RAW264.7细胞增长率

总结：脾脏是机体重要的免疫器官之一，脾脏中含有大量的淋巴细胞。调节免疫实验中 经常从鼠脾脏中获取大量的淋巴细胞，用于体外免疫实验。
RAW264.7是由Abelson鼠白血病病毒诱导BALB/c小鼠产生肿瘤后收集小鼠腹水单核样 巨噬细胞得到的细胞株(ATCC Number:TIB-71)。该细胞具有很强的黏附和吞噬抗原的能力， 是微生物学、免疫学研究中的常用细胞株。
从表1和表2的结果可知，皱盖假芝单峰多糖F212能显著促进脾淋巴细胞和RAW264.7 细胞的生长增殖，具有增强免疫的功效。
以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何 熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加 以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。