一种石榴花多糖的提取方法及其应用.pdf

本发明公开了一种石榴花多糖的提取方法，以廉价的石榴花为原料，按照石榴花粉碎——乙醇除杂——微波协同萃取——除蛋白——浓缩——乙醇分级沉淀——葡聚糖凝胶纯化的工艺路线进行提取，得到不同极性的石榴花多糖产品。该方法操作简单，将石榴花变废为宝，成本低，有利于石榴资源的充分利用，提高了石榴加工产品的附加值，适宜于工业化生产。所得的石榴花多糖具有很好的抗氧化活性和免疫调节作用，具有良好的利用开发前景。

权利要求书
1.  一种石榴花多糖的提取方法，其特征是包括以下步骤：
（1）将石榴花洗净、干燥后粉碎；
（2）向石榴花粉末中加入乙醇溶液提取，过滤取滤渣；
（3）向滤渣中加水，微波提取，合并提取液；
（4）将提取液加入Sevag试剂除蛋白，得脱蛋白的提取液；
（5）将脱蛋白的提取液用透析膜透析除杂，得透析液；
（6）将透析液真空浓缩至原来体积的1/8～1/4，得浓缩液，向浓缩液中加入无水乙醇至乙醇体积浓度达70%，静置后分离，所得沉淀挥干溶剂得多糖A粗品，上清液继续加入无水乙醇至乙醇体积浓度为80%，静置后分离，沉淀挥干溶剂得多糖B粗品，上清液再加入无水乙醇至乙醇体积浓度为95%，静置后分离，沉淀挥干溶剂得多糖C粗品；
（7）将多糖A、B、C的粗品分别过葡聚糖凝胶层析柱进行纯化，以水为流动相进行洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥得石榴花多糖A、B、C纯品。

2.  根据权利要求1所述的提取方法，其特征是：步骤（2）中，乙醇溶液的体积浓度为75-95%，优选为95%；乙醇溶液的用量为石榴花粉末质量的3-6倍，优选为5倍。

3.  根据权利要求1所述的提取方法，其特征是：步骤⑴中，石榴花干燥后用高速粉碎机粉碎至60目；步骤（2）中，用乙醇溶液回流提取2-4h。

4.  根据权利要求1所述的提取方法，其特征是：步骤（3）中，微波提取3次，每次水的用量为滤渣质量的20-30倍，优选28倍。

5.  根据权利要求1所述的提取方法，其特征是：步骤（3）中，微波功率为800-1000 W，微波提取温度为90-100℃，提取时间为10 分钟。

6.  根据权利要求1所述的提取方法，其特征是：步骤（5）中，透析膜分子量为2000-5000Da，优选为3500Da；透析时间为2天。

7.  根据权利要求1所述的提取方法，其特征是：步骤（4）中， Sevag试剂的用量为提取液体积的3-5倍；Sevag试剂为体积比为5:1的氯仿和正丁醇的混合液；步骤（6）中，分离多糖A、B、C粗品时，静置时间均为8-12小时。

8.  根据权利要求1所述的提取方法，其特征是：步骤（7）中，葡聚糖凝胶为SephadexG-100；洗脱时水的流速为0.05-2 ml/min，优选0.3 ml/min。

9.  根据权利要求1所述的提取方法，其特征是：石榴花多糖A，石榴花多糖B及石榴花多糖C中均含有甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖。

10.  一种抗氧化活性剂或机体免疫调节剂，其特征是：活性成分包括按照权利要求1-9中任一项所述的石榴花多糖的提取方法得到的石榴花多糖A、石榴花多糖B和石榴花多糖C中的至少一种。

说明书一种石榴花多糖的提取方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种从石榴花中快速提取具有抗氧化和免疫调节活性的石榴花多糖的方法,属于石榴花多糖提取技术领域。
背景技术
石榴是一种具有较高营养价值和保健功能的药食两用资源，有 “全身是宝” 的美称。目前我国已成为是世界上第一大石榴种植国，但我国石榴加工产业仍停留在较为粗放的阶段，深加工技术水平与产品转化效率均较低。石榴5-7月开花，花期长，开花量大，一般分为3批花，刚现蕾时要疏掉不能结实的钟状花，大部分二花及三花不能正常结果而自然脱落，因此石榴花的资源丰富，极具开发价值。在对石榴各器官降糖作用的研究中发现，石榴花具有显著的降糖活性，这与它所含的成分密切相关。根据目前的研究报道，石榴花中的活性成分以酚类、三萜类和黄酮类为主，从石榴花中分离和鉴定出最多的活性成分就是多酚类物质、五倍子酸、石榴皮素、白桦脂酸、熊果酸、山碴酸等，目前关于石榴花中多糖的报道还比较少，还未见关于石榴花多糖的提取分离等方面的报道。
多糖广泛存在于动物、植物、微生物中，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、免疫调节等多种生物学活性。大量研究工作证实:作为植物化学物质领域内的研究热点，植物多糖具有许多令人感兴趣的生物学作用，包括防治癌症、抗氧化(清除自由基)、抗应激、降血糖、抗动脉硬化等作用。此外由于多糖所具有的多种优良理化特性和生物学活性，因而可以作为增稠剂、稳定剂、功能因子、代脂肪、成膜剂等被广泛应用于食品加工。而生产多糖所采用的各种高新技术对于多糖的分子结构和生物活性又有显著影响，进而影响到多糖在食品加工中的应用特性。因此，有必要深入开展加工技术对于石榴花多糖结构和生物活性的影响，开发出高活性石榴花多糖的生产技术，从而指导石榴花多糖的生产和在食品、医药等领域中的应用。
通过检索文献及相关专利，目前有关于石榴皮、石榴籽和番石榴中多糖的提取工艺，但还没有关于石榴花中多糖提取的报道。因此对石榴花中活性多糖提取工艺进行研究，以提高石榴加工产品的附加值、变废为宝，增加资源产地农民收入，具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种石榴花多糖的提取方法，该方法以石榴花为原料，提取得到的石榴花多糖具有较高的抗氧化活性和免疫调节功效，变废为宝，提高了石榴加工产品的附加值，有很好的应用前景。
本发明的另一目的是提供一种以该方法得到的石榴花多糖为活性成分的抗氧化活性剂或机体免疫调节剂。
本发明以廉价的石榴花为原料，将其中的多糖有效成分提取出来，以提高其利用价值，提取按照石榴花粉碎——乙醇除杂——微波协同萃取——除蛋白——浓缩——乙醇分级沉淀——葡聚糖凝胶纯化的工艺路线进行，得到不同极性的石榴花多糖产品。具体技术方案如下：
一种石榴花多糖的提取方法，其特征是包括以下步骤：
（1）将石榴花洗净、干燥后粉碎；
（2）向石榴花粉末中加入乙醇溶液提取，过滤取滤渣；
（3）向滤渣中加水，微波提取，合并提取液；
（4）将提取液加入Sevag试剂除蛋白，得脱蛋白的提取液；
（5）将脱蛋白的提取液用透析膜透析除杂，得透析液；
（6）将透析液真空浓缩至原来体积的1/8～1/4，得浓缩液，向浓缩液中加入无水乙醇至乙醇体积浓度达70%，静置后分离，沉淀挥干溶剂得多糖A粗品，上清液继续加入无水乙醇至乙醇体积浓度为80%，静置后分离，沉淀挥干溶剂得多糖B粗品，上清液再加入无水乙醇至乙醇体积浓度为95%，静置后分离，沉淀挥干溶剂得多糖C粗品；
（7）将多糖A、B、C的粗品分别过葡聚糖凝胶层析柱进行纯化，以水为流动相进行洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥得石榴花多糖A、B、C纯品。
上述步骤⑴中，石榴花干燥后用高速粉碎机粉碎至60目。
上述步骤（2）中，乙醇溶液的体积浓度为75-95%，优选为95%。
上述步骤（2）中，乙醇溶液的用量为石榴花粉末质量的3-6倍，优选为5倍。
上述步骤（2）中，用乙醇溶液回流提取2-4h。
上述步骤（3）中，微波提取3次，每次水的用量为滤渣质量的20-30倍，优选28倍。
上述步骤（3）中，微波功率为800-1000 W，微波提取温度为90-100℃，提取时间为10 分钟。
上述步骤（4）中， Sevag试剂的用量为提取液体积的3-5倍。Sevag试剂为氯仿：正丁醇=5:1（体积比）。
上述步骤（5）中，透析膜的分子量为2000-5000Da，优选为3500Da。
上述步骤（5）中，透析时间为2天。
上述步骤（6）中，分离多糖A、B、C粗品时，静置时间均为8-12小时。
上述步骤（7）中，葡聚糖凝胶为SephadexG-100。
上述步骤（7）中，洗脱时水的流速为0.05-2 mL/min，优选0.3 ml/min。
上述提取方法得到的石榴花多糖A，石榴花多糖B及石榴花多糖C纯品中，均含有甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖。
本发明所得石榴花多糖A，石榴花多糖B及石榴花多糖C经验证具有很好的抗氧化活性和免疫调节作用，可以将它们作为抗氧化活性剂或机体免疫调节剂的活性成分进行进一步的应用。
本发明以石榴花为原料，通过一系列的处理从其中提取出了三种不同极性的石榴花多糖。该方法操作简单，将石榴花变废为宝，成本低，有利于石榴资源的充分利用，提高了石榴加工产品的附加值，适宜于工业化生产。
本发明提取所得的石榴花多糖A，B，C经实验验证具有很好的抗氧化活性和免疫调节作用，其抗氧化能力优于黄芪多糖和枸杞多糖，可以显著提高巨噬细胞的吞噬能力，明显增强机体的非特异性免疫和细胞免系统，可以作为天然的抗氧化活性剂及机体免疫调节剂，具有良好的利用开发前景。
附图说明
图1为实施例1所得石榴花多糖的HPLC色谱图。其中，（a）：9种单糖的标准品色谱图；（b）：石榴花多糖A单糖色谱图；（c）：石榴花多糖B单糖色谱图；（d）：石榴花多糖C单糖色谱图。
图2为石榴花多糖的总还原能力测定曲线。
图3为石榴花多糖对羟基自由基的清除能力图。
图4为石榴花多糖对DPPH自由基的清除能力图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行进一步的说明，下述说明仅是示例性的，并不对其内容进行限定。如无特别说明，下述乙醇的浓度均为体积浓度。
实施例1
石榴花多糖提取方法如下：
1、取1000 g石榴花用自来水洗净后自然风干，粉碎至60目，往石榴花粉末中加入5倍质量的95% 乙醇回流提取3小时，过滤后得滤渣；
2、往滤渣中加入其质量28倍的蒸馏水，于100℃、微波功率为1000 W的条件下提取10 分钟，过滤，重复提取2次，合并提取液；
3、向提取液中加入其体积5倍量的Sevag试剂（氯仿：正丁醇体积比=5:1），剧烈振荡50分钟，然后静置10分钟，离心，脱出提取液中的蛋白；重复此除蛋白步骤3-5次得到脱蛋白的提取液；
4、将脱蛋白的提取液用3500Da的透析膜透析2天，除去分子量小于3500Da的小分子杂质，取分子量大于3500Da的透析液；
5、将透析液进行真空浓缩，浓缩至原来体积的1/8，得浓缩液；往浓缩液中边搅拌边加入无水乙醇，使乙醇体积浓度达到70 %，静置10-12小时，收集沉淀，沉淀挥发去除溶剂（水和乙醇）得多糖A粗品；向分离沉淀的上清液中继续加入无水乙醇，至乙醇体积浓度达到 80 %，静置10-12时，收集沉淀，沉淀挥发去除溶剂（水和乙醇）得多糖B粗品；向分离沉淀的上清液中继续加入无水乙醇，至乙醇体积浓度达到95 %，静置10-12小时，收集沉淀，沉淀挥发去除溶剂（水和乙醇）得多糖C粗品；
6、将多糖A、B、C粗品分别利用SephadexG-100层析柱纯化，以水作为流动相, 洗脱流速为0.3 mL/min, 分别收集洗脱液,干燥得精制后的石榴花多糖A, B, C。其中石榴花多糖A重量为20.25 g，石榴花多糖B重量为25.6 g，石榴花多糖C重量为 41.25 g。总得率为8.7%（总得率的计算方式为：总得率%=总多糖重量/供试样品重量）。
对所得石榴花多糖A、B、C组成进行分析，如下：
1、仪器与试剂：
Agilent 1100 LC/MSD Trap (Agilent公司，美国)，配备真空脱气机(G1322A)，配备四元梯度泵(G1311A)，自动进样器(G1329A)，恒温箱(G1316A)，二极管阵列检测器(DAD，G1315A)，离子阱质谱(G2445D)，电喷雾电离源(ESI， G1948A)，衍生物的分离采用Hypersil ODS 2色谱柱(200×4.6mm 5 μm, 伊利特公司，大连，中国)，流动相通过0.2 μm的尼龙膜过滤器过滤。
、HPLC分离条件：
色谱柱Hypersil ODS2 (4.6 mm ×200 mm，5 mm)；A流动相为30% 乙腈(含15 mmol/L CH3COONH4，pH 4.5)；B流动相为60%乙腈；梯度洗脱程序：0~50 min，100%A~55%A，流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm。
、结果
经分析得，石榴花多糖A、石榴花多糖B及石榴花多糖C中均含有甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖，色谱图见图1。这些单糖的含量如下表1所示。

实施例2
石榴花多糖提取方法如下：
1、取1300g石榴花用自来水洗净后自然风干，粉碎至60目；
2、往石榴花粉末中加入其质量6倍的75% 乙醇回流提取2小时，过滤后得滤渣；
3、往滤渣中加入其质量30倍的蒸馏水，于90℃、微波功率800 W的条件下提取10 分钟，过滤，重复提取2次，合并提取液；
4、在提取液中加入其体积3倍的Sevag试剂（氯仿：正丁醇体积比=5:1），剧烈振荡20分钟，然后静置10分钟，离心，脱出提取液中的蛋白；重复该除蛋白步骤3-5次得到脱蛋白的提取液；
5、将脱蛋白的提取液用2000Da的透析膜透析2天，除去分子量小于2000Da的小分子杂质，取分子量大于2000Da的透析液；
6、将透析液进行真空浓缩，浓缩至原来体积的1/4，得浓缩液；往浓缩液中边搅拌边加入无水乙醇，使乙醇体积浓度达到70 %，静置8-10小时，收集沉淀，沉淀挥发去除溶剂得多糖A粗品；向分离沉淀的上清液中继续加入无水乙醇，至乙醇体积浓度为80 %，静置8-10小时，收集沉淀，沉淀挥发去除溶剂得多糖B粗品；向分离沉淀的上清液中继续加入无水乙醇，至乙醇体积浓度达到95 %，静置8-10小时，收集沉淀，沉淀挥发去除溶剂得多糖C粗品;
7、将得到的多糖A、B、C粗品分别利用SephadexG-100层析柱纯化，以水作为流动相, 洗脱流速为0.05mL/min，分别收集洗脱液, 冷冻干燥得精制后的石榴花多糖A, B, C。其中石榴花多糖A重量为16.54 g，石榴花多糖B重量为18.17 g，石榴花多糖C重量为 32.02 g。总得率为5.1%。
按照实施例1的方法对所得石榴花多糖A、B、C组成进行分析，结果如下表2所示：

实施例3
石榴花多糖提取方法如下：
1、取1300g石榴花用自来水洗净后自然风干，粉碎至60目；
2、往石榴花粉末中加入其质量3倍的85% 乙醇回流提取4小时，过滤后得滤渣；
3、往滤渣中加入其质量20倍的蒸馏水，于100℃、微波功率900 W的条件下提取10 分钟，过滤，重复提取2次，合并提取液；
4、在提取液中加入其体积3倍的Sevag试剂（氯仿：正丁醇体积比=5:1），剧烈振荡20分钟，然后静置10分钟，离心，脱出提取液中的蛋白；重复该除蛋白步骤3-5次得到脱蛋白的提取液；
5、将脱蛋白的提取液用5000Da的透析膜透析2天，除去分子量小于5000Da的小分子杂质，取分子量大于5000Da的透析液；
6、将透析液进行真空浓缩，浓缩至原来体积的1/6，得浓缩液；往浓缩液中边搅拌边加入无水乙醇，使乙醇体积浓度达到70 %，静置8-12小时，收集沉淀，沉淀挥发去除溶剂得多糖A粗品；向分离沉淀的上清液中继续加入无水乙醇，至乙醇体积浓度为80 %，静置8-12小时，收集沉淀，沉淀挥发去除溶剂得多糖B粗品；向分离沉淀的上清液中继续加入无水乙醇，至乙醇体积浓度达到95 %，静置8-12小时，收集沉淀，沉淀挥发去除溶剂得多糖C粗品;
7、将得到的多糖A、B、C粗品分别利用SephadexG-100层析柱纯化，以水作为流动相, 洗脱流速为2 mL/min，分别收集洗脱液, 冷冻干燥得精制后的石榴花多糖A, B, C。其中石榴花多糖A重量为17.31 g，石榴花多糖B重量为19.31 g，石榴花多糖C重量为 29.80 g。总得率为5.1%。
按照实施例1的方法对所得石榴花多糖A、B、C组成进行分析，结果如下表3所示：

实施例4
石榴花多糖提取方法如下：
1、取1300g石榴花用自来水洗净后自然风干，粉碎至60目；
2、往石榴花粉末中加入其质量3倍的75% 乙醇回流提取4小时，过滤后得滤渣；
3、往滤渣中加入其质量20倍的蒸馏水，于90℃、微波功率800 W的条件下提取10 分钟，过滤，重复提取2次，合并提取液；
4、在提取液中加入其体积3倍的Sevag试剂（氯仿：正丁醇体积比=5:1），剧烈振荡20分钟，然后静置10分钟，离心，脱出提取液中的蛋白；重复该除蛋白步骤3-5次得到脱蛋白的提取液；
5、将脱蛋白的提取液用4000Da的透析膜透析2天，除去分子量小于4000Da的小分子杂质，取分子量大于4000Da的透析液；
6、将透析液进行真空浓缩，浓缩至原来体积的1/4，得浓缩液；往浓缩液中边搅拌边加入无水乙醇，使乙醇体积浓度达到70 %，静置8-12小时，收集沉淀，沉淀挥发去除溶剂得多糖A粗品；向分离沉淀的上清液中继续加入无水乙醇，至乙醇体积浓度为80 %，静置8-12小时，收集沉淀，沉淀挥发去除溶剂得多糖B粗品；向分离沉淀的上清液中继续加入无水乙醇，至乙醇体积浓度达到95 %，静置8-12小时，收集沉淀，沉淀挥发去除溶剂得多糖C粗品;
7、将得到的多糖A、B、C粗品分别利用SephadexG-100层析柱纯化，以水作为流动相, 洗脱流速为1mL/min，分别收集洗脱液, 冷冻干燥得精制后的石榴花多糖A, B, C。其中石榴花多糖A重量为16.23 g，石榴花多糖B重量为19.23 g，石榴花多糖C重量为 38.04 g。总多糖得率为5.7 %。
按照实施例1的方法对所得石榴花多糖A、B、C组成进行分析，结果如下表4所示：

对比例
石榴花多糖提取方法如下：
1、取1300g石榴花用自来水洗净后自然风干，粉碎至60目；
2、往石榴花粉末中加入其质量5倍的70% 乙醇回流提取4小时，过滤后得滤渣；
3、往滤渣中加入其质量28倍的蒸馏水，于80℃、微波功率1000 W的条件下提取10 分钟，过滤，重复提取2次，合并提取液；
4、在提取液中加入其体积5倍的Sevag试剂（氯仿：正丁醇体积比=5:1），剧烈振荡50分钟，然后静置10分钟，离心，脱出提取液中的蛋白；重复该除蛋白步骤3-5次得到脱蛋白的提取液；
5、将脱蛋白的提取液用5500Da的透析膜透析2天，除去分子量小于5500Da的小分子杂质，取分子量大于5500Da的透析液；
6、将透析液进行真空浓缩，浓缩至原来体积的1/8，得浓缩液；往浓缩液中边搅拌边加入无水乙醇，使乙醇体积浓度达到65 %，静置8-12小时，收集沉淀，沉淀挥发去除溶剂得粗品1；向分离沉淀的上清液中继续加入无水乙醇，至乙醇体积浓度为75 %，静置8-12小时，收集沉淀，沉淀挥发去除溶剂得粗品2；向分离沉淀的上清液中继续加入无水乙醇，至乙醇体积浓度达到90%，静置8-12小时，收集沉淀，沉淀挥发去除溶剂得粗品3;
7、将得到的粗品1、2、3分别利用SephadexG-100层析柱纯化，以水作为流动相, 洗脱流速为3mL/min，分别收集洗脱液, 冷冻干燥得精制后的纯品1、2、3，将这3种纯品混合，得最终产品，共64.3g，总多糖得率为4.9%。

为了验证提取的石榴花多糖的功效，以实施例1提取所得的多糖为例进行以下实验。
石榴花多糖的抗氧化活性实验
1.1还原能力实验
实验方法：将不同浓度的多糖溶液（5-60 μg/mL）加入到10 mL具塞离心管中，并依次加入0.5 mL磷酸盐缓冲液（pH值6.6，0.2 mol/L）和0.5 mL 1%（m/v）的铁氰化钾[K3Fe(CN)6]溶液。将混合物在50 ℃水浴中温育20 min。待孵育完后，滴加1 mL10%三氯乙酸终止反应, 之后，将内容物在1000转/分钟离心10 min。 取3 mL上清液，加入氯化铁溶液（0.5 mol/L，0.1%），摇晃，在700 nm处测定吸光度，每种浓度的样品平行测定三次。同时，以维生素C作为对照在同等条件下进行实验。
一般情况下，样品的还原能力与抗氧化能力呈正相关。依据还原能力的测定方法，在波长700 nm处测定的吸光值越大，则样品的还原能力越强。结果见图2，从图中可以看出，石榴花多糖的还原能力随其浓度的增加而增大，提示石榴花多糖的抗氧化能力随浓度的增加而增强。通过分级沉淀得到的三种多糖中，多糖A与多糖B的抗氧化活性要强于多糖C。
清除羟基自由基实验
实验步骤如下：将1 mL的多糖溶液或维生素C溶液与水杨酸（10.0 mmol/L，1mL），硫酸亚铁（10 mmol/L，1mL）和过氧化氢（0.003%，1mL）在37 ℃下孵育30 min，4000 r/min 下离心 15 min，取上清液，以纯化水调零点，在510 nm波长处测定吸光度（Ａ）。结果经以下公式计算：羟自由基清除活性%=[A-（A1-A0）]/100%。其中，A1为样品的吸光度; A为对照溶液吸光度（含水杨酸，硫酸亚铁和过氧化氢）; A0是空白溶液的吸光度（含有水杨酸，硫酸亚铁，多糖溶液和蒸馏水）。
枸杞多糖（LBP）与黄芪多糖（LBP）为著名的植物多糖，具有很强的抗氧化能力，本实验设立枸杞多糖与黄芪多糖作为参照组，来验证石榴花多糖的抗氧化能力。图3为当多糖浓度为200μg/mL 时，石榴花多糖（A，B和C）、枸杞多糖（LBP）、黄芪多糖（AP）及维生素C的清除羟基自由基的能力。通过实验数据可以发现石榴花多糖展现出出色的抗氧化能力，其抗氧化能力要强于LBP及AP的抗氧化能力。石榴花多糖含供氢体，具有提供氢质子的能力，可使具有高度氧化性的自由基还原，从而能终止自由基连锁反应，起到清除或抑制自由基的目的。
清除DPPH·实验
实验步骤如下：准确称量12 mg DPPH，溶解在乙醇中配成62.5μg/mL的溶液，取2 mL 200μg/mL的多糖溶液或维生素C溶液，加入到含2 mL DPPH溶液的10 mL密闭试管中。将混合物在黑暗处静置10 min后，用紫外可见分光光度计在517 nm处测量吸光度，每个样品平行三次。%DPPH清除率= l-[(A-B)/A0] ×100%，A0：2 mL乙醇替代样品后的吸收值；A：样品的吸收；B：空白样品的吸收。
二苯代苦味酰基 (DPPH·)是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若受试物能将其清除，则表示受试物具有降低羟自由基、烷自由基或过氧化氢自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应的作用，如图4 所示，石榴花多糖表现出良好的抗氧化活性，其中70%乙醇沉淀的石榴花多糖对DPPH·的清除率最强，清除率可达到55%；结果还表明石榴花多糖的清除DPPH·的能力要强于枸杞多糖（LBP）及黄芪多糖（AP）。
通过以上抗氧化实验可以证明石榴花多糖具有很强的抗氧化能力，且抗氧化能力与浓度成正相关。在清除·OH及DPPH·实验中，结果还表明石榴花多糖的抗氧化能力要强于枸杞多糖及黄芪多糖。
石榴花多糖免疫调节作用研究
2.1石榴花多糖对小鼠免疫器官的影响
取重量为20 g左右的昆明小白鼠50只，雌雄各半，随机分为A-E 5组，每组10只，各组分别为石榴花多糖A组（用量40 mg/kg×d）、石榴花多糖B组（用量40 mg/kg×d）、石榴花多糖C组（用量40 mg/kg×d）、枸杞多糖组（用量40 mg/kg×d）和空白对照组（生理盐水，用量40mg/kg×d），每组按照用量对小鼠灌胃，连续14 d。在末次给药后1 h处死小鼠，称量小鼠体重、胸腺和脾脏的质量，以胸腺、脾脏的质量与总质量之比作为胸腺、脾脏的指数。实验结果表明石榴花多糖A、石榴花多糖B、石榴花多糖C、枸杞多糖明显比对照组（E 组）进食量及运动量显著增加。实验小鼠脾脏和胸腺指数结果可见表6，从表中可以看出石榴花多糖A，B，C均能促进正常小鼠胸腺和脾脏重量的增加，与枸杞多糖组比较无显著性差异，与空白对照组比较有显著性差异。这表明石榴花多糖A、石榴花多糖B、石榴花多糖C、枸杞多糖均能促进小鼠的进食量及运动量。

石榴皮多糖对巨噬细胞吞噬功能影响
取重量为20 g左右的昆明小白鼠50只，雌雄各半，随机分为A-E 5组，每组10只，各组分别为石榴花多糖A组（用量40 mg/kg×d）、石榴花多糖B组（用量40 mg/kg×d）、石榴花多糖C组（用量40 mg/kg×d）、枸杞多糖组（用量40 mg/kg×d）和空白对照组（生理盐水，用量40mg/kg×d），每组按照用量对小鼠灌胃，第7天灌胃给药1 h后给每只小鼠腹腔注射1 mL鸡红细胞生理盐水悬液，6 h之后采用颈部脱臼法处死小鼠，沿腹中线剪开小鼠腹部皮肤，用生理盐水冲洗小鼠腹部，并轻柔按摩1 min，吸取腹腔液做涂片，37 ℃温箱放置30 min，用瑞士染色法进行染色，显微镜下观察计数。实验结果见表 7，从表中可以看出本发明石榴花多糖A、B、C均可以显著提高吞噬指数与吞噬百分率，与枸杞多糖组之间无显著差异，与对照组之间存在显著差异。

天然植物多糖可以有效增强机体的非特异性免疫和细胞免疫，其作为一种良好的免疫调节剂可以促进抗体的生成，活化细胞因子，整体调节机体免疫系统。巨噬细胞在免疫应答中辅佐细胞，是机体免疫系统的重要组成部分，在非特异性免疫和特异性免疫中都起着至关重要的作用。通过以上实验证明石榴花多糖A，B，C均可以显著提高巨噬细胞的吞噬能力，并且可以明显增强机体的非特异性免疫和细胞免系统。