说明书紫芝内酰胺A及其药物组合物与其在制药和食品中的应用
技术领域：
本发明属于药物技术和食品领域，具体地涉及紫芝内酰胺A及 其药物组合物，以及其在制备治疗肾脏纤维化或慢性肾病的药物或保 健食品中的应用。
背景技术：
关于慢性肾病的危害、病理机制及药物研究的方法和原理，本专 利的发明人在已公开的中国专利(公布号：CN 102153630A)中有了 明确的描述。由于药物、饮食等诸多因素影响，慢性肾病的发病率已 超过10％，慢性肾病的发病率高，知晓率低已是现实，慢性肾病进展 至肾衰竭时就只能依赖肾移植和血液透析。但由于治疗药物的缺乏， 慢性肾病目前尚无好的干预方法。
研究表明TGF-β/Smad3磷酸化是慢性肾病的重要病理之一， Smad3磷酸化也是其它脏器纤维化的主要原因之一。因此，观察化合 物对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞Smad3磷酸化的抑制作用，已成 为目前研究慢性肾病包括肾纤维化药物的常用方法。但目前关于这方 面的小分子药物还比较缺乏。
灵芝自古作为名贵药材在亚洲国家使用，紫芝(Ganoderma sinensis)载于《中华人民共和国药典》I部，药理作用广泛。本发明 人认为其可能含有抗慢性肾病活性物质，而现有技术中未见有本发明 涉及的化合物及其抗慢性肾病的相关报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供具有抗慢性肾病或肾脏纤维化价值的化 合物紫芝内酰胺A(+)-或(-)-Sinensilactam A[(+)-1或(-)-1]及其制备 方法，以该化合物为有效成分的药物组合物，以及该发明的化合物在 制备抗慢性肾病和/或抗肾脏纤维化的药物中的应用。
本发明的上述目的是由下述的技术方案得以实现的：
具有下述结构式的紫芝内酰胺A[(+)-1或(-)-1](其中 (±)-sinensilactam A的晶体结构，其晶体数据存于Cambridge Crystallographic Data Centre保存号为：CCDC 1047039)，
制备所述的紫芝内酰胺A的方法，取紫芝(Ganoderma sinensis)， 粉碎，用70％乙醇回流提取(3×130L×2h)，合并提取液并减 压回收溶剂得粗提取物，将粗提取物混悬于适量水中，然后用等体积 乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减压浓缩得乙酸乙酯萃取物，其经 MCI gel CHP 20P柱层析(MeOH：H2O，20:80，30:70，40:60，50:50， 60:40，70:30，80:20，90:10，100:0)，每种溶剂梯度为1.5倍柱体积， 按照每份300mL收集得8个合并组份；组份3)经RP-18柱层析 (MeOH：H2O,20％-60％)，TLC检测合并斑点相同组分得6个组份 (组份3.1-3.6)；组份3.3经Sephadex LH-20(MeOH)分离得到3 个组份(组份3.3.1-3.3.3)；其中组份3.3.2经制备薄层纯化(CHCl3： MeOH，10：1)得到消旋的化合物1，其经手性HPLC(CHIRALPAK IC，EtOH/n-hexane，35：65)拆分得(+)-1和(-)-1。
治疗慢性肾病或肾脏纤维化的药物组合物，含有治疗有效量的上 述化合物和药学上可接受的载体。
上述化合物在制备治疗慢性肾病或肾脏纤维化药物中的应用。
上述化合物在制备保健食品中的应用。
本发明化合物可以单独直接应用或组合应用，也可以与其它药物 包括植物提取物组成复方的形式使用，可以使用不同的药用辅料，制 成多种固体制剂和液体制剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用 量的形式使用。本发明的药物可经口服和注射两种形式给药。使用量 可根据给药途径、患者的年龄、体重、所治疗疾病的类型和严重程度 等变化进行一次或多次使用。
附图说明：
图1表示化合物抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞Smad3磷 酸化水平：图A和B分别为化合物(-)-1和(+)-1的作用，药物分组从 左至右分别为：对照组(不加TGF-β1和受试药物)，1(20μM)组 TGF-β1组，TGF-β1+1(5μM)组，TGF-β1+1(10μM)组，TGF-β1+1(20 μM)组。
具体实施方式：
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性 内容，但并不以此来限定本发明。根据本发明的实质对本发明进行的 简单改进都属于本发明的范围。
实施例1：
化合物1的分离纯化：
取紫芝(Ganoderma sinensis)40kg，粉碎，用70％乙醇回流提 取(3×130L×2h)，合并提取液并减压回收溶剂得粗提取物， 将粗提取物混悬于适量水中，然后用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并 萃取液，减压浓缩得乙酸乙酯萃取物(0.72kg)，其经MCI gel CHP 20P 柱层析(MeOH：H2O，20:80，30:70，40:60，50:50，60:40，70:30， 80:20，90:10，100:0)，每种溶剂梯度为1.5倍柱体积，按照每份300 mL收集得8个合并组份；组份3(18g)经RP-18柱层析(MeOH： H2O,20％-60％)，TLC检测合并斑点相同组分得6个组份(组份 3.1-3.6)。组份3.3(1.5g)经Sephadex LH-20(MeOH)分离得到3 个组份(组份3.3.1-3.3.3)。其中组份3.3.2(210mg)经制备薄层纯 化(CHCl3：MeOH，10：1)得到消旋的化合物1，其经手性HPLC (CHIRALPAK IC，EtOH/n-hexane，35：65)拆分得(+)-1(3.5mg) 和(-)-1(4.1mg)。
化合物1的结构确证：
化合物1的结构式如下所示：
其中(±)-sinensilactam A的晶体结构，
化合物1的结构鉴定数据：
Sinensilactam A(1):colorless crystal；[α]D20.3–16.6(c 0.53,MeOH)； UV(MeOH)λmax(logε)366(3.48),258(3.76),226(4.05)nm；ESIMS m/z 402[M–H]–,HRESIMS m/z 426.1159[M+Na]+(calcd for C20H21NO8Na,426.1165).1H and 13C NMR data,see Table 1.[α]D20.3+35.7(c 0.11,MeOH)；CD(MeOH)Δε219–7.13,Δε258–2.84,Δε366+0.88； (+)-1；[α]D18.6–33.2(c 0.10,MeOH)；CD(MeOH)Δε222+12.5,Δε259+4.81,Δε371–1.91；(–)-1.
Crystal data of(±)-1:C20H21NO8,M＝403.38,triclinic,α＝100.008(10)°,β＝96.475(10)°, γ＝98.204(11)°,T＝100(2)K,space group P-1,Z＝2, μ(CuKα)＝0.950 mm-1,8362 reflections measured,2853 independent reflections(Rint＝0.1006).The final R1 values were 0.1457(I>2σ(I)). The final wR(F2)values were 0.4284(I>2σ(I)).The final R1values were 0.2148(all data).The final wR(F2)values were 0.4652(all data).The goodness of fit on F2 was 1.781.The deposition number CCDC 1047039 can be obtained free of charge from The Cambridge Crystallographic Data Centre via www.ccdc.cam.ac.uk/data request/cif.
实施例2：
实施例1中化合物中的任一种，按常规法加注射用溶媒，精滤， 灌封灭菌后可制成注射液。
实施例3：
实施例1中化合物中的任一种，将其溶于无菌注射用水中，用无 菌漏斗过滤，分装，低温冷冻干燥后无菌熔封即得粉针剂。
实施例4：
实施例1中化合物中的任一种，按常规法配以各种药用辅料可制 成片剂。
使用实施例1中化合物中的任一种作为药物活性成分，使用几种 赋形剂作为制备组合药物片剂的辅料成分，按照一定比例配比制成每 片含有药物成分1-100mg的片剂样品。
实施例5：
实施例1中化合物中的任一种按常规法配以各种药用辅料可制 成胶囊剂：
含有实施例1中化合物中的任一种作为有效成分的药物组合胶囊 制剂的制备，使用实施例1中化合物中的任一种作为药物活性成分、 使用几种赋形剂作为制备组合药物胶囊剂的辅料成分，按照一定比例 配比制成每粒胶囊中含有化合物成分1-100mg的胶囊制剂。
实施例6：
取实施例1的方法制得的化合物1份，10份植脂末，混匀，按照 常规方法制成固体饮料。
实施例7：
本发明化合物及其与药用辅料组成的药物组合物的抗慢性肾病 或肾脏纤维化的药理作用。
化合物1抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞Smad3磷酸化：
人肾小管上皮细胞(HKC-8；John Hopkins University,Baltimore, MD)用含10％胎牛血清(Gibco BRL,Grand Island,NY)及青霉素和链 霉素的DMEM/F-12培养基培养，化合物用DMSO溶解，人重组 TGF-β1按照指定方法用含0.1％的胎牛血清的去离子水溶解。待细 胞汇合至80％-90％时，采用无血清DMEM培养基培养过夜。细胞 用不同浓度的化合物提前孵育1小时，然后用TGF-β1(5ng/mL)刺 激1小时，收集细胞按照常规指定方法进行Western blot分析(Zhou, L.L.；Li,Y.J.；Zhou,D.；Tan,R.J.；Liu,Y.H.Loss of Klotho contributes to kidney injury by de-repression of Wnt/β-catenin signaling.J.Am.Soc. Nephol.2013,24:771-785)。采用的抗体为：rabbit anti-phospho-Smad3(Ser423/425)(9520；Cell signaling,Boston,MA), rabbit anti-phospho-Smad2(Ser465/467)(5399；Cell signaling,Boston, MA),rabbit anti-Smad2(8685；Cell signaling,Boston,MA),rabbit anti-Smad3(9513；Cell signaling,Boston,MA),及rabbit anti-β-actin (P30002；Abmart,Shanghai,China).Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies购自Boster(Boster,Wuhan,China)。
从图1可以看出，化合物(-)-1和(+)-1在20μM浓度时均 能显著抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞Smad3磷酸化。由于 Smad3磷酸化是包括肾脏纤维化在内的多种脏器纤维化和多种慢性 肾病的重要病理，因此本发明涉及的化合物在慢性肾病包括肾纤维 化和其他脏器纤维化干预中具有重要价值。