一种桑黄菌多糖分离纯化的方法.pdf

本发明公开了一种桑黄菌多糖分离纯化的方法，其特征主要包括以下步骤：草酸铵提乙醇沉淀法制备桑黄菌多糖成分，用阴离子交换层析和凝胶过滤层析分离纯化多糖，产品再经浓缩、透析、真空冷冻干燥等一系列处理后，得到桑黄菌多糖纯品，既不影响天然多糖的化学结构又能保持其原有生物活性，且本发明的方法设备及环境要求低、方法简单、成本低、灵活实用，利于推广、开发和应用。

权利要求书
1.  一种桑黄菌多糖分离纯化的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一，脱脂：将桑黄菌丝体粉碎，用有机溶剂以常规方式脱脂得脱脂后的桑黄菌丝体；
步骤二，酸提：将所述脱脂后的桑黄菌丝体加入质量浓度为1%的草酸铵溶液，充分搅拌均匀；再在95℃下回流提取8小时后再离心，浓缩，最后浓缩提取液中加入4倍体积的质量浓度为95%的乙醇，4℃冰箱静置过夜，离心收集沉淀后得酸提桑黄菌粗多糖；所述脱脂后的桑黄菌丝体与草酸铵溶液的比例为1:10 g/mL；
步骤三，除蛋白：将所述酸提桑黄菌粗多糖溶于蒸馏水，Sevag试剂法去除其中蛋白，得到去除蛋白的多糖水溶液；
步骤四，透析：将所述去除蛋白的多糖水溶液浓缩，离心，弃掉不溶物，得上清液，用透析袋将上清液在流水中透析48 h，再在蒸馏水中透析48 h，除去寡糖、无机盐、色素等小分子杂质，收集得到桑黄菌多糖的提取液；
步骤五，柱层析纯化：将所述桑黄菌多糖的提取液进行浓缩，经DEAE-Sephadex A-25 Fast Flow离子交换和Sephacryl S-400 HR凝胶过滤柱层析，收集液用苯酚-硫酸法检测，合并多糖峰的收集液，浓缩，透析，离心，真空冷冻干燥，得层析纯桑黄菌多糖。

2.  根据权利要求1所述的一种桑黄菌多糖分离纯化的方法，其特征在于所述步骤一中：有机溶剂为石油醚，沸程30~60℃；所述的常规方式为索氏抽提器中35℃回流6 h，自然晾干。

3.  根据权利要求1所述的一种桑黄菌多糖分离纯化的方法，其特征在于所述步骤二中：草酸铵溶液的质量分数为1%；离心速度为5000 rpm，离心时间为20 min。

4.  根据权利要求1所述的一种桑黄菌多糖分离纯化的方法，其特征在于所述步骤三中：Sevag试剂为氯仿和正丁醇按照5:1体积比混合所得。

5.  根据权利要求1所述的一种桑黄菌多糖分离纯化的方法，其特征在于所述步骤五中：DEAE-Sephadex A-25 Fast Flow的层析柱大小为2.6 cm×60 cm，上样量为10 mL，洗脱液是0~0.5 mol/L的NaCl，流速为2.0 mL/min。

6.  根据权利要求1所述的一种桑黄菌多糖分离纯化的方法，其特征在于所述步骤五中：Sephacryl S-400HR凝胶过滤层析柱大小为1.5 cm×100 cm，上样量为5.0 mL，洗脱液是去离子水，流速为2.0 mL/min。

7.  根据权利要求1所述的一种桑黄菌多糖分离纯化的方法，其特征在于所述步骤五中：透析为蒸馏水透析48 h，去离子水透析24 h；离心速度为8000 rpm，离心时间为30 min。

说明书一种桑黄菌多糖分离纯化的方法
技术领域
本发明涉及一种应用生物工程技术从桑黄菌丝体中分离纯化桑黄菌多糖的方法。
背景技术
桑黄菌（Phellinus linteus）属担子菌亚门、多孔菌科、木层孔菌属（Phellinus），是一种珍贵的药用真菌，有“森林黄金”之美称。研究发现，桑黄具有显著的抗肿瘤作用，对S180、胃癌的抑制作用较灵芝、巴西蘑菇等药用真菌还强，是目前国际公认的生物治癌领域中有效率排第一的药用真菌，具有开发天然抗肿瘤生物制品的潜力，其中多糖是主要活性成分。尽管如此，国内外研究桑黄多糖的抗肿瘤作用还主要以水提物或水提多糖为研究对象，对于其他提取介质如酸液、碱液制备的多糖，目前国内外研究还较少，限制了桑黄菌活性多糖的深度开发及应用。
经检索，目前关于酸提桑黄菌多糖的分离纯化方法还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种桑黄菌多糖分离纯化的方法，不影响天然多糖的化学结构，保留其生物活性，使能作为针剂、胶囊等的药用原料，也可作为保健品、功能食品的配料。
为了解决以上技术问题，本发明从液体发酵培养的桑黄菌丝体中通过草酸铵溶液提取有生物活性的粗多糖、除蛋白、透析、柱层析纯化和冷冻干燥，具体技术方案如下：
一种桑黄菌多糖分离纯化的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一，脱脂：将桑黄菌丝体粉碎，用有机溶剂以常规方式脱脂得脱脂后的桑黄菌丝体；
步骤二，酸提：将所述脱脂后的桑黄菌丝体加入质量浓度为1%的草酸铵溶液，充分搅拌均匀；再在95℃下回流提取8小时后再离心，浓缩，最后浓缩提取液中加入4倍体积的质量浓度为95%的乙醇，4℃冰箱静置过夜，离心收集沉淀后得酸提桑黄菌粗多糖；所述脱脂后的桑黄菌丝体与草酸铵溶液的比例为1:10 g/mL；
步骤三，除蛋白：将所述酸提桑黄菌粗多糖溶于蒸馏水，Sevag试剂法去除其中蛋白，得到去除蛋白的多糖水溶液；
步骤四，透析：将所述去除蛋白的多糖水溶液浓缩，离心，弃掉不溶物，得上清液，用透析袋将上清液在流水中透析48 h，再在蒸馏水中透析48 h，除去寡糖、无机盐、色素等小分子杂质，收集得到桑黄菌多糖的提取液；
步骤五，柱层析纯化：将所述桑黄菌多糖的提取液进行浓缩，经DEAE-Sephadex A-25 Fast Flow离子交换和Sephacryl S-400 HR凝胶过滤柱层析，收集液用苯酚-硫酸法检测，合并多糖峰的收集液，浓缩，透析，离心，真空冷冻干燥，得层析纯桑黄菌多糖。
所述步骤一中：有机溶剂为石油醚，沸程30~60℃；所述的常规方式为索氏抽提器中35℃回流6 h，自然晾干。
所述步骤二中：草酸铵溶液的质量分数为1%；离心速度为5000 rpm，离心时间为20 min。
所述步骤三中：Sevag试剂为氯仿和正丁醇按照5:1体积比混合所得。
所述步骤五中：DEAE-Sephadex A-25 Fast Flow的层析柱大小为2.6 cm×60 cm，上样量为10 mL，洗脱液是0~0.5 mol/L的NaCl，流速为2.0 mL/min。
所述步骤五中：Sephacryl S-400HR凝胶过滤层析柱大小为1.5 cm×100 cm，上样量为5.0 mL，洗脱液是去离子水，流速为2.0 mL/min。
所述步骤五中：透析为蒸馏水透析48 h，去离子水透析24 h；离心速度为8000 rpm，离心时间为30 min。
本发明具有有益效果。本发明通过建立桑黄菌多糖的分离纯化工艺，获取均一分子量的多糖，成分为葡萄糖和甘露糖，具有免疫调节、抗氧化和抗肿瘤活性。对进一步研究其化学结构和阐明其药理活性机制、构效关系等均有着重要意义，而且为桑黄天然抗肿瘤生物制品或功能食品的研发提供有价值的理论依据。
附图说明
图1为本发明的多糖经DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析分离出2个组分。
图2为本发明的第1个峰的Sephacryl S-400HR凝胶过滤图谱。
图3为本发明的第1个峰经凝胶过滤层析纯化后的GPC图谱。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，对本发明的技术方案作进一步详细说明。
实施例1
1、脱脂：桑黄菌丝体粉碎，脱脂棉布包裹，置于500 mL索氏抽提器中，加入200~300 mL石油醚（沸程：30~60℃），35℃回流6 h，重复脱脂1次，自然晾干。
2、酸提：步骤1所得的脱脂后的桑黄菌丝体100 g按1:10（g/mL）的料液比加入质量分数为1%草酸铵溶液1000 mL，置于2000 mL圆底烧瓶中，充分搅拌均匀，95℃回流提取8 h。混合物用300 mL塑料离心管，5000 rpm、20 min离心，上清液合并45℃旋转蒸发器减压蒸发，浓缩至原体积的1.5倍，加入4倍体积的95%乙醇，4℃冰箱静置过夜，离心收集沉淀，得酸提桑黄菌粗多糖。重复提取1次。
3、除蛋白：步骤2所得的酸提桑黄菌粗多糖溶于蒸馏水中，氯仿和正丁醇按照5:1体积比混合制备Sevag试剂，将Sevag试剂按多糖水溶液1：5体积加入，混合物于水浴振荡锅中，室温下振摇搅拌1 h，5000 rpm、20 min离心，除去蛋白。如此重复除蛋白8~10次。
4、透析：步骤3所得的除蛋白的多糖水溶液浓缩，离心，弃不溶物，得上清液，用透析袋将上清液在流水中透析48 h，再在蒸馏水中透析48 h，除去寡糖、无机盐、色素等小分子杂质，收集桑黄菌多糖的提取液。
5、柱层析纯化：将经步骤4透析后的液体浓缩，经DEAE-Sephadex A-25 Fast Flow离子交换和Sephacryl S-400HR凝胶过滤柱层析。
1）离子交换色谱柱（DEAE-Sephadex A-25 Fast Flow）分离分级：去离子水平衡DEAE-Sephadex A-25 Fast Flow（2.6 cm×60 cm），上样量10 mL，以0-0.5 mol/L的NaCl梯度洗脱，流速2.0 mL/min，苯酚-硫酸法跟踪检测多糖出峰，绘制洗脱曲线。分离出2个组分，结果如图1所示。收集后浓缩、透析和冷冻干燥，两个组分的多糖回收率分别为63.61%和30.36%，总回收率93.97%，第1组分为所需。
2）凝胶过滤色谱柱（Sephacryl S-400 HR）纯化：将第1组分多糖溶于去离子水，上Sephacryl S-400HR凝胶过滤层析柱（1.5 cm×100 cm），上样量5.0 mL，以去离子水洗脱，流速2.0 mL/min，苯酚-硫酸法跟踪检测多糖出峰，绘制洗脱曲线，结果如图2所示。收集单一峰，4℃保存。
6、冷冻干燥：将收集的多糖组分浓缩后，蒸馏水透析48 h，去离子水透析24 h，45℃旋转蒸发器减压蒸发至适当体积，8000 rpm、30 min离心，真空冷冻干燥，得白色絮状的桑黄菌多糖纯品，多糖回收率达89.6%，苯酚-硫酸法测得中性糖含量为99.0%，经凝胶渗透色谱（GPC）检测纯度达90%以上，结果如图3所示。并测得重均分子量为10.6 kDa。