一种间充质干细胞成脂诱导分化培养基及其制备方法.pdf

本发明提供一种间充质干细胞成脂诱导分化培养基，属于干细胞技术领域，包括DMEM/F12培养基，还包括如下组分及其浓度：FBS 5~50%体积百分比、谷氨酰胺0.5~5%体积百分比、抗生素0.5~5%体积百分比、吲哚美辛50~500μM、胰岛素50~500nM、地塞米松5~50nM、 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5~5μM和盐酸法舒地尔0.05~0.5μM。本发明提供的间充质干细胞成脂诱导分化培养基具有诱导效率高等优点。

权利要求书
1.  一种间充质干细胞成脂诱导分化培养基，其特征在于：包括DMEM/F12培养基，还包括如下组分及其浓度：FBS 5~50%体积百分比、谷氨酰胺0.5~5%体积百分比、抗生素0.5~5%体积百分比、吲哚美辛50~500 μM、胰岛素50~500 nM、地塞米松5~50 nM、 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 0.5~5 μM和盐酸法舒地尔0.05~0.5μM。

2.  根据权利要求1所述的间充质干细胞成脂诱导分化培养基，其特征在于：包括DMEM/F12培养基，还包括如下组分及其浓度：FBS 5~20%体积百分比、谷氨酰胺0.5~2%体积百分比、抗生素0.5~2%体积百分比、吲哚美辛100~300 μM、胰岛素50~200 nM、地塞米松5~20 nM、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 0.5~3 μM和盐酸法舒地尔0.1~0.3μM。

3.  根据权利要求2所述的间充质干细胞成脂诱导分化培养基，其特征在于：包括DMEM/F12培养基，还包括如下组分及其浓度：FBS 10%体积百分比、谷氨酰胺1%体积百分比、抗生素1%体积百分比、吲哚美辛200 μM、胰岛素100 nM、地塞米松10 nM、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 1 μM和盐酸法舒地尔0.1 μM。

4.  根据权利要求1至3中任一项所述的间充质干细胞成脂诱导分化培养基，其特征在于：所述间充质干细胞选自骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或羊膜间充质干细胞。

5.  根据权利要求1至3中任一项所述的间充质干细胞成脂诱导分化培养基，其特征在于：所述抗生素包括青霉素和链霉素。

6.  根据权利要求1所述的间充质干细胞成脂诱导分化培养基的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：向DMEM/F12培养基中，按所述浓度加入FBS、谷氨酰胺、抗生素、吲哚美辛母液、胰岛素母液、地塞米松母液、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤母液和盐酸法舒地尔母液，搅拌均匀，过膜除菌即得。

7.   根据权利要求1至5中任一项所述的间充质干细胞成脂诱导分化培养基在间充质干细胞成脂诱导分化中的用途。

8.  一种间充质干细胞成脂诱导分化方法，其特征在于：包括如下步骤：a）培养间充质干细胞；b）待细胞汇合度符合要求时，弃去所述步骤a）中的培养基，加入权利要求1至5中任一项所述的间充质干细胞成脂诱导分化培养基培养2~4周。

9.  根据权利要求8所述的间充质干细胞成脂诱导分化方法，其特征在于：所述间充质干细胞选自骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或羊膜间充质干细胞。

说明书一种间充质干细胞成脂诱导分化培养基及其制备方法
技术领域
本发明属于干细胞技术领域，涉及一种间充质干细胞成脂诱导分化培养基及其制备方法。
背景技术
间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是具有明显可塑性和多向分化潜能的一种成体干细胞，在不同生长因子的调节下，可分化成来源于3个胚层的不同组织细胞类型，如脂肪细胞、成骨细胞、肝样细胞、心肌样细胞、神经胶质细胞、神经元细胞和胰岛样细胞等。除此，人间充质干细胞不表达主要组织相容性II类抗原，微量表达主要组织相容性I类抗原，免疫原性低，移植排斥作用小，而且具有免疫调节功效，移植后的人羊膜间充质干细胞分泌的营养因子，具有促血管生成、促细胞生长、抗炎症和抗纤维化等作用，在干细胞治疗、组织工程治疗和再生医学研究应用中具有重要意义。
为了验证体外培养的间充质干细胞的成脂分化潜能，必须将间充质干细胞用成脂诱导培养基进行诱导分化。目前的成脂诱导培养基组分一般为DMEM/F12，10%FBS，1%谷氨酰胺，1%青霉素/链霉素溶液，200μM 吲哚美辛，1 μM地塞米松，100nM 胰岛素，250 μM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（isobutylmethylxanthine，IBMX）。但现有的成脂诱导分化培养基存在诱导效率不够理想、成脂诱导分化的专一性不强的问题。
发明内容
为解决现有技术中存在的诱导效率不够理想的问题，发明人通过大量试验筛选，预料不到的发现：通过添加一定浓度的盐酸法舒地尔，得到一种新的间充质干细胞成脂诱导分化培养基，该培养基的诱导效率大大提高，提高了成脂诱导分化的专一性，通过该培养基的诱导可以获得大量成脂细胞。
本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步体现和说明。
本发明提供一种间充质干细胞成脂诱导分化培养基，包括DMEM/F12培养基，还包括如下组分及其浓度：FBS 5~50%体积百分比、谷氨酰胺0.5~5%体积百分比、抗生素0.5~5%体积百分比、吲哚美辛50~500 μM、胰岛素50~500 nM、地塞米松5~50 nM、 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 0.5~5 μM和盐酸法舒地尔0.05~0.5μM。
采用上述技术方案的间充质干细胞成脂诱导分化培养基，可以实现各种间充质干细胞向成脂细胞的诱导分化，提高了成脂诱导分化的专一性，产生更多的成脂细胞，成脂相关基因FABP4的表达水平更高，成脂诱导分化效率大大提高。
优选地，本发明提供的间充质干细胞成脂诱导分化培养基，包括DMEM/F12培养基，还包括如下组分及其浓度：FBS 5~20%体积百分比、谷氨酰胺0.5~2%体积百分比、抗生素0.5~2%体积百分比、吲哚美辛100~300 μM、胰岛素50~200 nM、地塞米松5~20 nM、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 0.5~3 μM和盐酸法舒地尔0.1~0.3μM。
优选地，本发明提供的间充质干细胞成脂诱导分化培养基，包括DMEM/F12培养基，还包括如下组分及其浓度：FBS 10%体积百分比、谷氨酰胺1%体积百分比、抗生素1%体积百分比、吲哚美辛200 μM、胰岛素100 nM、地塞米松10 nM、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 1 μM和盐酸法舒地尔0.1 μM。
优选地，所述间充质干细胞选自骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或羊膜间充质干细胞。
优选地，所述抗生素包括青霉素和链霉素。
本发明提供的间充质干细胞成脂诱导分化培养基还可根据实际需要添加其他成分，如1%体积百分比的非必须氨基酸，但添加后并未提高成脂诱导分化效率。
相应地，本发明还提供了间充质干细胞成脂诱导分化培养基的制备方法，包括如下步骤：向DMEM/F12培养基中，按所述浓度加入FBS、谷氨酰胺、抗生素、吲哚美辛母液、胰岛素母液、地塞米松母液、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤母液和盐酸法舒地尔母液，搅拌均匀，过膜除菌即得。
相应地，本发明还提供间充质干细胞成脂诱导分化培养基在间充质干细胞成脂诱导分化中的用途。
此外，本发明还提供一种间充质干细胞成脂诱导分化方法，包括如下步骤：a）培养间充质干细胞；b）待细胞汇合度符合要求时，弃去所述步骤a）中的培养基，加入权利要求1至5中任一项所述的间充质干细胞成脂诱导分化培养基培养2~4周。细胞汇合度符合要求通常是指细胞长至70~90%汇合度。
优选地，所述间充质干细胞选自骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或羊膜间充质干细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的间充质干细胞成脂诱导分化培养基，可以实现包括骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞和羊膜间充质干细胞在内的各种间充质干细胞向成脂细胞的诱导分化，产生更多的成脂细胞，提高了成脂诱导分化的专一性，避免了向成骨细胞等其他组织细胞的分化，成脂相关基因FABP4的表达水平高，成脂诱导分化效率大大提高。此外，本发明提供的制备方法简单，制得的间充质干细胞成脂诱导分化培养基可以实现稳定、高效的成脂诱导分化。
附图说明
图1  不同配方的间充质干细胞成脂诱导分化培养基对成脂诱导分化相关基因FABP4的表达影响。
图2  含不同浓度盐酸法舒地尔的间充质干细胞成脂诱导分化培养基对成脂诱导分化相关基因FABP4的表达影响。
图3  P3代骨髓间充质干细胞在诱导培养基中的成脂诱导分化染色结果图。
图4  P3代骨髓间充质干细胞在诱导培养基中的成脂诱导分化相关基因FABP4的表达结果图。
图5  P3代脐带间充质干细胞在诱导培养基中的成脂诱导分化染色结果图。
图6  P3代脐带间充质干细胞在诱导培养基中的成脂诱导分化相关基因FABP4的表达结果图。
图7  P3代羊膜间充质干细胞在诱导培养基中的成脂诱导分化染色结果图。
图8  P3代羊膜间充质干细胞在诱导培养基中的成脂诱导分化相关基因FABP4的表达结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明中的各组分均为常规市售产品。诱导培养基1：本发明实施例二提供的间充质干细胞成脂诱导分化培养基。诱导培养基2：Life Tecnology公司的成脂诱导分化培养基，货号A10070-01。诱导培养基3：与诱导培养基1相比，不包括盐酸法舒地尔。诱导培养基4：与诱导培养基1相比，盐酸法舒地尔的浓度变为0.4μM。诱导培养基5：与诱导培养基1相比，盐酸法舒地尔的浓度变为0.5μM。
实施例一  间充质干细胞成脂诱导分化培养基的配方筛选
发明人对间充质干细胞成脂诱导分化培养基进行了试验筛选。取P3代骨髓间充质干细胞，以5000个/cm2的密度接种于六孔板中，并用含10%（v/v）FBS的DMEM/F12培养基进行培养，待细胞汇合度达80%时，弃去培养基，分别加入诱导培养基1和诱导培养基3，每3天换液一次。诱导培养3周后，用qPCR鉴定成脂细胞相关基因FABP4的表达水平，结果如图1所示。
从图1可知：向现有技术中的间充质干细胞成脂诱导分化培养基中添加一定浓度的盐酸法舒地尔，可以大幅提高成脂相关基因FABP4的表达水平（与诱导培养基3相比， P<0.01），且未检出成骨相关基因OPN的表达。
进一步地，发明人还对盐酸法舒地尔的添加浓度进行了考察。取P3代骨髓间充质干细胞，以5000个/cm2的密度接种于六孔板中，并用含10%（v/v）FBS的DMEM/F12培养基进行培养，待细胞汇合度达80%时，弃去培养基，分别加入诱导培养基1、诱导培养基4和诱导培养基5，每3天换液一次。诱导培养3周后，用qPCR鉴定成脂细胞相关基因FABP4的表达水平，结果如图2所示。从图2可知，当盐酸法舒地尔的浓度高于0.3μM时，随着盐酸法舒地尔浓度的增加，FABP4表达水平显著下降（P<0.01）。
实施例二 间充质干细胞成脂诱导分化培养基
间充质干细胞成脂诱导分化培养基，包括DMEM/F12培养基，还包括如下组分及其浓度：FBS 10%体积百分比、谷氨酰胺1%体积百分比、青霉素-链霉素1%体积百分比、吲哚美辛200 μM、胰岛素100 nM、地塞米松10 nM、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 1 μM和盐酸法舒地尔0.1 μM。
制备方法：向DMEM/F12培养基中，按所述浓度加入FBS、谷氨酰胺、抗生素、吲哚美辛母液、胰岛素母液、地塞米松母液、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤母液和盐酸法舒地尔母液，搅拌均匀，过膜除菌即得。
吲哚美辛母液的制备：取100mg，用50%甲醇溶解，配成20mM的母液，储存于-20度。胰岛素母液的制备：取100mg，用0.01mol/L盐酸溶解，配成100μM的母液，储存于-20度。地塞米松母液的制备：取1g，用95%乙醇溶解，配成10μM的母液，-20度保存。3-异丁基-1-甲基黄嘌呤母液的制备：取50mg，用95%乙醇溶解，配成1mM的母液，储存于-20度。盐酸法舒地尔母液的制备：取100mg，用50%甲醇溶解，配成0.1mM的母液，储存于-20度。
实施例三 间充质干细胞成脂诱导分化培养基
间充质干细胞成脂诱导分化培养基，包括DMEM/F12培养基，还包括如下组分及其浓度：FBS 15%体积百分比、谷氨酰胺1%体积百分比、抗生素1%体积百分比、吲哚美辛150 μM、胰岛素50 nM、地塞米松10 nM、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 2μM和盐酸法舒地尔0.2μM。
制备方法：与实施例二中的制备方法类似。
实施例四 间充质干细胞成脂诱导分化培养基
间充质干细胞成脂诱导分化培养基，包括DMEM/F12培养基，还包括如下组分及其浓度：FBS 10%体积百分比、谷氨酰胺2%体积百分比、青霉素-链霉素1%体积百分比、吲哚美辛200 μM、胰岛素100 nM、地塞米松15 nM、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 1μM和盐酸法舒地尔0.1 μM。
制备方法：与实施例二中的制备方法类似。
实施例五  骨髓间充质干细胞的成脂诱导分化
取P3代骨髓间充质干细胞，以5000个/cm2的密度接种于六孔板中，并用含10%（v/v）FBS的DMEM/F12培养基进行培养，待细胞汇合度达80%时，弃去培养基，分别加入诱导培养基1和诱导培养基2，每3天换液一次。诱导培养3周后，用油红O进行成脂鉴定，结果如图3所示；同时，用qPCR鉴定成脂细胞相关基因FABP4的表达水平，结果如图4所示。
从图3和图4可知：本发明提供的培养基所诱导分化的细胞，成脂细胞更多，脂滴更多更饱满，成脂相关基因FABP4的表达水平更高（与诱导培养基2相比，P<0.01），说明其成脂诱导分化效果更好。
实施例五  脐带间充质干细胞的成脂诱导分化
取P3代脐带间充质干细胞，以5000个/cm2的密度接种于六孔板中，并用含10%（v/v）FBS的DMEM/F12培养基进行培养，待细胞汇合度达80%时，弃去培养基，分别加入诱导培养基1和诱导培养基2，每3天换液一次。诱导培养3周后，用油红O进行成脂鉴定，结果如图5所示；同时，用qPCR鉴定成脂细胞相关基因FABP4的表达水平，结果如图6所示。
从图5和图6可知：本发明提供的培养基所诱导分化的细胞，成脂细胞更多，脂滴更多更饱满，成脂相关基因FABP4的表达水平更高（与诱导培养基2相比，P<0.01），说明其成脂诱导分化效果更好。
实施例六  羊膜间充质干细胞的成脂诱导分化
取P3代羊膜间充质干细胞，以5000个/cm2的密度接种于六孔板中，并用含10%（v/v）FBS的DMEM/F12培养基进行培养，待细胞汇合度达80%时，弃去培养基，分别加入诱导培养基1和诱导培养基2，每3天换液一次。诱导培养3周后，用油红O进行成脂鉴定，结果如图7所示；同时，用qPCR鉴定成脂细胞相关基因FABP4的表达水平，结果如图8所示。
从图7和图8可知：本发明提供的培养基所诱导分化的细胞，成脂细胞更多，脂滴更多更饱满，成脂相关基因FABP4的表达水平更高（与诱导培养基2相比，P<0.01），说明其成脂诱导分化效果更好。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。