说明书丁二醇的制造方法
技术领域
本发明涉及一种丁二醇的制造方法。
背景技术
近些年，从化石资源枯竭或全球变暖对策等观点来看，以可再生资源为原料的化合物制造工艺受到了关注。特别是，以生物质作为原料的、利用生物化学工艺来制造各种聚合物原料化合物或化学品原料化合物的、所谓的生物炼制被广泛研究。
作为被期待进行生物质的原料转化的化合物，可举出丁二醇(指1,3-丁二醇及1,4-丁二醇)。例如，1,4-丁二醇被用作有机化学品的合成原料、聚酯及工程塑料的单体单位等，1,3-丁二醇被用作有机溶剂或化妆品基质等。对这些丁二醇的需求较大，并且对于以生物质等可再生资源为原料的、利用生物化学工艺的丁二醇的制造方法的要求变大。
作为利用生物化学工艺的丁二醇的制造方法，例如可举出专利文献1～3及非专利文献1记载的方法。
专利文献1：(日本)专利第4380704号公报
专利文献2：国际公布2008/115840号公报
专利文献3：国际公布2010/127319号公报
非专利文献1：Harry Yim et al.,Metabolic engineering of Escherichia coli for direct production of 1,4-butanediol,Nature Chemical Biology,7,445-452(2011).
发明内容
<本发明所要解决的技术问题>
然而，专利文献1～3及非专利文献1记载的方法的工艺复杂。
针对上述问题，要提供一种新的丁二醇的制造方法，其能够经济地获得丁二醇。
<用于解决技术问题的方案>
本发明包括以下内容。
[1]一种丁二醇的制造方法，其包括：培养包含基因的微生物的步骤，所述基因编码对由乙酰CoA和丙二酰CoA不可逆地生成乙酰乙酰CoA的反应进行催化的乙酰乙酰CoA合酶、对由乙酰乙酰CoA生成3-羟基丁酰CoA的反应进行催化的乙酰乙酰CoA还原酶、以及对用于由3-羟基丁酰CoA生成丁二醇的反应进行催化的酶。
[2]根据[1]所述的丁二醇的制造方法，其中，对用于由3-羟基丁酰CoA生成丁二醇的反应进行催化的酶是对由3-羟基丁酰CoA生成巴豆酰CoA的反应进行催化的烯酰CoA水合酶、对由巴豆酰CoA生成4-羟基丁酰CoA的反应进行催化的4-羟基丁酰CoA脱水酶、以及对由4-羟基丁酰CoA生成4-羟基丁醛的反应进行催化的醛脱氢酶或对生成1，4-丁二醇的反应进行催化的醇脱氢酶。
[3]根据[1]所述的丁二醇的制造方法，其中，对用于由3-羟基丁酰CoA生成丁二醇的反应进行催化的酶是对由3-羟基丁酰CoA生成3-羟基丁醛的反应进行催化的醛脱氢酶或对生成1，3-丁二醇的反应进行催化的醇脱氢酶。
[4]根据[1]至[3]中任一项所述的丁二醇的制造方法，其中，编码对由乙酰CoA和丙二酰CoA不可逆地生成乙酰乙酰CoA的反应进行催化的乙酰乙酰CoA合酶的基因是下述(a)～(c)中任一项所述的基因：(a)具有序列号1的碱基序列的基因；(b)具有在序列号1的碱基序列中缺失、取代或插入一个或多个碱基的碱基序列的基因，其中该基因具有相对于序列号1的碱基序列的90％以上的同一性的碱基序列；(c)在严格条件下将具有序列号1记载的碱基序列的基因与具有互补的碱基序列的基因杂交的基因。
[5]根据[1]、[2]或[4]所述的丁二醇的制造方法，其中，所述微生物包含下述(d)～(f)中任一项所述的编码4-羟基丁酰CoA脱水酶的基因：(d)具有序列号8的碱基序列的基因；(e)具有在序列号8的碱基序列中缺失、取代或插入一个或多个碱基的碱基序列的基因，其中该基因具有相对于序列号8的碱基序列的90％以上的同一性的碱基序列；(f)在严格条件下将具有序列号8记载的碱基序列的基因与具有互补的碱基序列的基因杂交的基因。
[6]根据[1]至[5]中任一项所述的丁二醇的制造方法，其中，所述微生物还包含编码乙酰CoA羧化酶的基因，该乙酰CoA羧化酶对以乙酰CoA作为基质来生成丙二酰CoA的反应进行催化。
[7]根据[1]至[6]中任一项所述的丁二醇的制造方法，其中，该培养步骤包括在需 氧条件下培养所述微生物的步骤。
[8]根据[1]至[7]中任一项所述的丁二醇的制造方法，其中，所述微生物是大肠杆菌、酵母、棒状杆菌、或梭菌。
<发明的效果>
能够提供一种丁二醇的制造方法，其能够经济地获得丁二醇。
附图说明
图1是用于对本实施方式的丁二醇的制造方法的例子进行说明的概要图。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。需要说明的是，在本说明书中，“CoA”意味着辅酶A。另外，只要没有特别记载，则“％”表示质量％。
图1中表示出用于对本实施方式的丁二醇的制造方法的例子进行说明的概要图。
在本实施方式中，通过利用转化等使编码对由乙酰CoA和丙二酰CoA不可逆地生成乙酰乙酰CoA的反应进行催化的乙酰乙酰CoA合酶、对由乙酰乙酰CoA生成3-羟基丁酰CoA的反应进行催化的乙酰乙酰CoA还原酶、以及对用于由3-羟基丁酰CoA生成丁二醇的反应进行催化的酶的基因在微生物体内表达，并向该微生物体内供给乙酰CoA，从而能够获得丁二醇。需要说明的是，这里的“供给”除了包括从外部提供物质，还包括变成在微生物体内能够合成该物质的状态。另外，在后者的情况中，可以利用微生物本来具有的遗传体系，也可以新导入遗传体系从而能够进行合成(以下相同)。
这里，用于由3-羟基丁酰CoA生成丁二醇的反应例如可以是如图1的S105所示一个步骤地由3-羟基丁酰CoA到丁二醇转换，也可以如图1的S107、S109及S111所示多个步骤地转换。
当由3-羟基丁酰CoA到丁二醇的反应为一个步骤时，例如通过利用转化等使编码对由乙酰CoA和丙二酰CoA不可逆地生成乙酰乙酰CoA的反应进行催化的乙酰乙酰CoA合酶、对由乙酰乙酰CoA生成3-羟基丁酰CoA的反应进行催化的乙酰乙酰CoA还原酶、以及对由3-羟基丁酰CoA生成3-羟基丁醛的反应进行催化的醛脱氢酶或对生成1，3-丁二醇的反应进行催化的醇脱氢酶的基因在微生物体内表达，并向该微生物体内供给乙酰CoA及丙二酰CoA，从而能够获得丁二醇。在使用用于生成3-羟基丁醛的 醛脱氢酶时，可以利用宿主微生物具有的醇脱氢酶的作用将所生成的3-羟基丁醛导向丁二醇，并可以使将3-羟基丁醛导向丁二醇的醇脱氢酶在微生物体内一并表达。
如果向下述的微生物体内供给乙酰CoA和丙二酰CoA，则利用该基因的作用，由乙酰CoA和丙二酰CoA不可逆地生成乙酰乙酰CoA(S101)，由所生成的乙酰乙酰CoA生成3-羟基丁酰CoA(S103)，由所生成的3-羟基丁酰CoA生成1，3-丁二醇(S105)。
当由3-羟基丁酰CoA到丁二醇的反应为多个步骤时，例如通过利用转化等使编码对由乙酰CoA和丙二酰CoA不可逆地生成乙酰乙酰CoA的反应进行催化的乙酰乙酰CoA合酶、对由乙酰乙酰CoA生成3-羟基丁酰CoA的反应进行催化的乙酰乙酰CoA还原酶、对由3-羟基丁酰CoA生成巴豆酰CoA的反应进行催化的烯酰CoA水合酶、对由巴豆酰CoA生成4-羟基丁酰CoA的反应进行催化的4-羟基丁酰CoA脱水酶、以及对由4-羟基丁酰CoA生成4-羟基丁醛的反应进行催化的醛脱氢酶或对生成1，4-丁二醇的反应进行催化的醇脱氢酶的基因在微生物体内表达，并向该微生物体内供给乙酰CoA及丙二酰CoA，从而能够获得丁二醇。在使用用于生成4-羟基丁醛的醛脱氢酶时，可以利用宿主微生物具有的醇脱氢酶的作用将所生成的4-羟基丁醛导向丁二醇，并可以使将4-羟基丁醛导向丁二醇的醇脱氢酶在微生物体内一并表达。
如图1所示，如果向下述的微生物体内供给乙酰CoA和丙二酰CoA，则利用该基因的作用，由乙酰CoA和丙二酰CoA不可逆地生成乙酰乙酰CoA(S101)，由所生成的乙酰乙酰CoA生成3-羟基丁酰CoA(S103)，由所生成的3-羟基丁酰CoA生成巴豆酰CoA(S107)，由所生成的巴豆酰CoA生成4-羟基丁酰CoA(S109)，由所生成的4-羟基丁酰CoA生成1，4-丁二醇(S111)。
接着，对催化各个反应的酶、及编码该酶的基因详细进行说明。
(编码乙酰乙酰CoA合酶的基因)
本实施方式中得到的丁二醇是利用包含了编码对由乙酰CoA和丙二酰CoA不可逆地生成乙酰乙酰CoA的反应进行催化的乙酰乙酰CoA合酶的基因的微生物，从乙酰乙酰CoA中导出。
可用于本实施方式的乙酰乙酰CoA合酶只要是对以乙酰CoA和丙二酰CoA为基质来不可逆地生成乙酰乙酰CoA的反应进行催化的酶，就可以任意选择。作为具体例子，例如可举出Unprecedented acetoacetyl-coenzyme A synthesizing enzyme of the thiolase superfamily involved in the mevalonate pathway.,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A. 107,11265-11270(2010)中记载的乙酰CoA：丙二酰CoA酰基转移酶(Enzyme Commission number(EC号):2.3.1.194)或其同源物。
编码上述乙酰乙酰CoA合酶的基因的碱基序列可参见日本DNA数据库(DDBJ)的登记号AB540131(序列号1)。
以往，作为生成乙酰乙酰CoA的酶，已知β-酮硫解酶。β-酮硫解酶是对乙酰CoA的2个分子为基质来生成乙酰乙酰CoA的反应进行催化的酶，由thiL、phaA等基因来编码。然而，β-酮硫解酶是对合成上述乙酰乙酰CoA的反应、和将乙酰乙酰CoA加水分解而生成乙酰CoA的2个分子的反应可逆地进行催化的酶。由于本实施方式的乙酰乙酰CoA合酶对合成乙酰乙酰CoA不可逆地进行催化，因此在使用该酶的本实施方式的制造方法中，乙酰乙酰CoA的产率较高。
另外，在本实施方式中，可以使用编码乙酰CoA羧化酶的基因，该乙酰CoA羧化酶对以乙酰CoA为基质来生成丙二酰CoA的反应进行催化。由于通过使用乙酰CoA羧化酶，丙二酰CoA的供给增加，因此该乙酰乙酰CoA的不可逆反应被促进。因此，由于能够增大针对生成物的碳通量，因此能够更高效地制造丁二醇。需要说明的是，在本实施方式中，乙酰CoA利用宿主所具有的糖酵解系统，从用于培养的任意的碳源、例如葡萄糖等糖来供给。
在本实施方式中所使用的乙酰CoA羧化酶只要是对以乙酰CoA为基质来生成丙二酰CoA的反应进行催化的酶，便无特别限定。作为具体例子，可举出非专利文献Efficient production of(2S)-flavanones by Escherichia coli containing an artificial biosynthetic gene cluster,Applied Microbiology and Biotechnology,68498-504(2005)中记载的源于棒状杆菌的乙酰CoA羧化酶(EC号：6.4.1.2)或其同源物。已知源于棒状杆菌的乙酰CoA羧化酶由于多个亚基而显现出活性。作为编码乙酰CoA羧化酶的基因的碱基序列的一个例子，可参见DDBJ的登记号YP224999、CCH23890。
(编码乙酰乙酰CoA还原酶的基因)
在本实施方式中所使用的乙酰乙酰CoA还原酶只要是对还原乙酰乙酰CoA并生成3-羟基丁酰CoA的反应进行催化的酶，便无特别限定。作为具体例子，可举出乙酰乙酰CoA还原酶(EC号：1.1.1.36)、3-羟基丁酰CoA脱氢酶(EC号：1.1.1.35)、3-羟酰CoA脱氢酶(EC号：1.1.1.157)或其同源物等。例如，关于乙酰乙酰CoA还原酶(EC号：1.1.1.36)及其基因的具体内容，在Poly-beta-hydroxybutyrate biosynthesis in Alcaligenes eutrophus H16.Characterization of the genes encoding beta-ketothiolase and acetoacetyl-CoA reductase.,The Journal of Biological Chemistry,264,15293-15297(1989)中记载。
需要说明的是，当使用乙酰乙酰CoA还原酶(EC号：1.1.1.36)时，能够获得(R)-3-羟基丁酰CoA，当使用3-羟基丁酰CoA脱氢酶(EC号：1.1.1.35)或3-羟酰CoA脱氢酶(EC号：1.1.1.157)时，能够获得(S)-3-羟基丁酰CoA。在本实施方式中，在制造1,3-丁二醇时，可以根据所需的手征性，来分开使用上述酶。
(编码烯酰CoA水合酶的基因)
在本实施方式中所使用的烯酰CoA水合酶只要是对将3-羟基丁酰CoA脱水并生成巴豆酰CoA的反应进行催化的酶，便无特别限定。作为具体例子，作为对由(S)-3-羟基丁酰CoA生成巴豆酰CoA的反应进行催化的酶，可举出烯酰CoA水合酶(EC号：4.2.1.17)或其同源物等。对于编码烯酰CoA水合酶(EC号：4.2.1.17)的基因的详细内容，可参见非专利文献The complete stereochemistry of the enzymatic dehydration of4-hydroxybutyryl coenzyme A to crotonyl coenzyme.A.,Friedrich P,Darley DJ,Golding BT,Buckel W.,Angewandte Chemie International Edition,200847(17)3254-3257(2008)等。另外，作为对由(R)-3-羟基丁酰CoA生成巴豆酰CoA的反应进行催化的酶，可举出烯酰CoA水合酶(EC号：4.2.1.119)或其同源物等。对于编码烯酰CoA水合酶(EC号：4.2.1.119)的基因的详细内容，可参见非专利文献Metabolism of poly-beta-hydroxybutyrate.II.Enzymatic synthesis of D-(-)-beta hydroxybutyryl coenzyme A by an enoyl hydrase from Rhodospirillum rubrum.,Moskowitz GJ,Merrick JM.Journal Biochemistry.,82748-2755(1969)等。
如上所述，对由乙酰乙酰CoA生成3-羟基丁酰CoA的反应进行催化的乙酰乙酰CoA还原酶，根据所使用的酶的种类，能够生成(R)体和/或(S)体的3-羟基丁酰CoA。另外，对由3-羟基丁酰CoA生成巴豆酰CoA的反应进行催化的烯酰CoA水合酶也具有同样的光学异构体的选择性。也即，在本实施方式的丁二醇的制造方法中，能够适当地组合乙酰乙酰CoA还原酶和烯酰CoA水合酶的光学选择性，并能够对由乙酰乙酰CoA生成巴豆酰CoA为止的反应进行控制。
(编码4-羟基丁酰CoA脱水酶的基因)
在本实施方式中，作为编码对由巴豆酰CoA生成4-羟基丁酰CoA的反应进行催化 的酶的基因，例如使用序列号8所示的基因。在本实施方式中，只要是编码对由巴豆酰CoA生成4-羟基丁酰CoA的反应进行催化的酶的基因，就可使用序列号8所示基因的同源物，优选是具有序列号8记载的碱基序列的基因、或者具有缺失、取代或插入一个或多个该碱基的碱基序列的基因。
序列号8所示的基因的针对氨基酸序列的翻译结果、与可参见GenBank的登记号AJ250267的源于氨基酪酸梭菌(Clostridium aminobutyricum)的abfD基因的翻译结果相同。
abfD基因所编码的酶的详细内容记载在非专利文献Fermentation of4-aminobutyrate by Clostridium aminobutyricum:cloning of two genes involved in the formation and dehydration of 4-hydroxybutyryl-CoA,Archives of Microbiology,174(3)189-199(2000)等中。可以认为，使序列号8所示的基因根据翻译序列及该基因所提供的反应，来编码具有4-羟基丁酰CoA脱水酶活性的酶。然而，作为比较例，当使用包含abfD基因序列的重组体时，不能制造丁二醇。换言之，在本实施方式中，可以认为，在重组体中，通过具有序列号8的碱基序列的基因和其他基因的共表达，从而能够制造1,4-丁二醇。需要说明的是，对于本实施方式的序列号8所示的基因与上述abfD基因，其编码的氨基酸序列相同，但利用基因信息处理软件(GENETYX；GENETYX CORPORATION制造)的碱基序列的相同性为75％有较大不同。在使用碱基序列较大不同的基因的本实施方式中，能够提供高效的丁二醇的制造方法。
(编码醛脱氢酶或醇脱氢酶的基因)
在本实施方式中所使用的醛脱氢酶只要是对还原羟基丁酰CoA并生成羟基丁醛的反应进行催化的酶，便无特别限定。需要说明的是，所生成的羟基丁醛进一步被源于宿主微生物的醇脱氢酶还原，生成丁二醇。另外，根据作为目的的丁二醇，可以选择以3-羟基丁酰-CoA和/或4-羟基丁酰CoA为基质。作为醛脱氢酶的一个例子，可举出Clostridium beijerinckii strain NRRL B592菌株的醛脱氢酶(EC号：1.2.1.10)或其同源物。编码醛脱氢酶(EC号：1.2.1.10)的基因的碱基序列可参见DDBJ的登记号AY20821。
在本实施方式中所使用的醇脱氢酶只要是对还原羟基丁酰CoA并生成丁二醇的反应进行催化的酶，便无特别限定。根据作为目的的丁二醇，可以选择以3-羟基丁酰-CoA和/或4-羟基丁酰CoA为基质。作为醇脱氢酶的一个例子，可举出Clostridium acetobutylicum ATCC 824菌株的醇脱氢酶(EC号：1.1.1.1)或其同源物。编码醇脱氢酶(EC号：1.1.1.1)的基因的碱基序列可参见National Center for Biotechnology Information(NCBI)的基因ID号1116040。
在本实施方式的丁二醇的制造方法的优选形态中，使根据所需的丁二醇所选择的一系列的酶组在利用基因重组而转化的微生物体内共表达。例如，在1,3-丁二醇的制造中，将编码乙酰乙酰CoA合成酶、3-羟基丁酰CoA脱氢酶、醛脱氢酶或醇脱氢酶、或其同源物，单独或作为一系列簇插入到任意的载体中，对宿主微生物进行转化。例如通过将所得到的转化体在以葡萄糖为碳源的培养基中进行培养，从而表达各基因。当基因在宿主中能够配置并表达时，通过在培养基中培养转化体，从而使基因表达。另一方面，当在设在载体上的调节器的控制下对各基因进行配置时，通过添加诱导基质并使其转移到诱导环境，从而使各个编码的基因表达。以利用宿主的糖酵解系统所供给的乙酰CoA为反应原料进行反应，1,3-丁二醇等丁二醇被高效的制造出。需要说明的是，本实施方式中的培养包括所有通常的微生物培养的培养条件，另外培养步骤意味着以用于制造丁二醇的充分的时间及条件来培养微生物。
在本实施方式中所使用的编码各个酶的基因中，可以原样地使用具有源自原来的微生物的碱基序列的基因。另外，当使用与基因所源自的微生物不同的宿主微生物时，为了良好地进行宿主微生物中的基因表达，可以使用一部分碱基序列被取代了的基因。此时，首先，使用在公知的数据库中登记的原始碱基序列，本领域技术人员根据密码子利用频率和/或GC含量来确定取代的碱基序列。本领域技术人员所确定的一部分碱基序列被取代了的基因可通过化学合成而得到。
作为编码各个酶的基因的例子，例如可举出源于链霉菌(Streptomyces)属微生物的乙酰乙酰CoA合酶(NphT7)基因、源于劳尔氏菌(Ralstonia)属微生物的乙酰乙酰CoA还原酶(PhaB)基因、源于梭菌(Clostridium)属微生物的醛脱氢酶(Ald)基因和/或醇脱氢酶(AdhE)基因、源于棒状杆菌属微生物的乙酰CoA羧化酶(Acc)基因、源于梭菌(Clostridium)属微生物的3-羟基丁酰CoA脱水酶(Crt)基因。
另外，如上所述，作为编码对由巴豆酰CoA生成4-羟基丁酰CoA的反应进行催化的酶的基因，可以使用序列号8所示的基因。序列号8所示的基因、与编码4-羟基丁酰CoA脱水酶的基因(abfD)的翻译结果相同。
(微生物)
作为在本实施方式中所使用的转化宿主微生物的例子，只要是能够使用基因重组技术的微生物，便无特别限定。从产业利用的观点来看，作为具体例子，可以举出大肠杆菌、酵母、棒状杆菌、或梭菌属细菌。作为酵母，可举出酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母等。作为棒状杆菌，可举出谷氨酸棒杆菌、有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)、短杆菌(Brevibacterium divaricatum)、糖短杆菌、immariophilum短杆菌(Brevibacterium immariophilum)、乳发酵短杆菌、玫瑰色短杆菌、黄色短杆菌、生硫短杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌、醋谷棒杆菌、帚石南棒杆菌、百合棒状杆菌、mellassecola棒状杆菌(Corynebacterium mellassecola)、嗜氨微杆菌等。作为梭菌，可举出克氏梭菌、丙酮丁醇梭菌、氨基酪酸梭菌、拜氏梭菌、saccharoperbutylacetonicum梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)等。其中，由于使用大肠杆菌、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母，或谷氨酸棒杆菌容易进行转化，因此优选使用大肠杆菌。
需要说明的是，在本实施方式的丁二醇的制造方法中，可以对于所有构成作为目的的生物合成途径的酶基因，均无需作为外来基因通过转化来提供，而是利用宿主所具有的酶基因来构成生物合成途径。另外，在本实施方式中，利用源于宿主的代谢途径来供给乙酰CoA，但也可以使用基因扩增、外来基因导入、或分散途径的剔除等代谢工程技术，来提高乙酰CoA的供给能力。
需要说明的是，在本实施方式中，编码对各个反应进行催化的酶的基因并不限定于上述具体例子中所举出的基因，可以使用其同源物基因。本说明书中所说的同源物(homolog)包括直系同源物和旁系同源物。直系同源物是指在从共同祖先的基因分化而生成的种类之间对应的基因及由该基因得到的酶的组合。旁系同源物是指在同种内，在不是通过分化而是通过基因重复而生成的种类之间对应的基因及由该基因得到的酶的组合。同源物是指与直系同源物、旁系同源物无关地、在序列上具有同一性的基因及由该基因得到的酶。
具体来说，本实施方式中的同源物基因是含有具有90％以上的同一性、优选95％以上的同一性的碱基序列的基因，更优选是与该基因完全相同、或者缺失、取代或插入了一个或多个碱基的基因以及由该基因得到的酶。
另外，该同源物基因包括在严格条件下将对象基因与具有互补的碱基序列的基因杂交的基因。具体来说，通过应用针对公知的数据库的同源性检索程序(例如BLAST、 FASTA)、或基于在利用由认定基因的至少一部分构成的探针(由该基因的碱基序列构成的DNA和由互补的碱基序列构成的DNA)的严格条件下的杂交或聚合酶链反应(PCR)等常规方法，能够取得基因或由该基因的转化得到的酶。另外，只要是本领域的技术人员，就能够通过对碱基序列进行取代，来亲自进行设计。需要说明的是，作为在此所说的严格条件，例如可以举出非专利文献Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION(Joseph Sambrook,David W.Russell.,Cold Spring Harbor Laboratory Press)中记载的进行杂交的条件。具体来说，是在包含6×SSC(1×SSC的组成：为0.15M氯化钠、0.015M柠檬酸钠，pH：7.0)、0.5％SDS、5×Denhardt溶液及100mg/mL鲱鱼精子DNA的溶液中，与探针一起在65℃下保持恒温8～16小时，进行杂交的条件。
需要说明的是，在本实施方式中所得到的丁二醇的光学选择性取决于作为用于得到丁二醇的前体的有机酸CoA体的光学选择性、或在该有机酸CoA体的生物合成途径中所选择的酶的光学选择性。换言之，通过选择用于得到有机酸CoA的反应途径的手征性，从而能够制造具有所需的光学选择性的丁二醇。例如，通过使用源于劳尔氏菌(Ralstonia)属微生物的乙酰乙酰CoA还原酶(PhaB)，利用乙酰乙酰CoA，从而得到(R)-3-羟基丁酰CoA。另外，例如通过使用源于梭菌(Clostridium)属的乙酰乙酰CoA还原酶(hbd)，从而得到(S)-3-羟基丁酰CoA。因此，通过选择这些酶来作为本实施方式的制造方法，从而能够得到(R)-1,3-丁二醇或(S)-1,3-丁二醇。
(培养条件)
通过对上述基因进行转化而将其导入微生物体内并使其表达，并培养该微生物，从而能够得到丁二醇。
本发明的反应的最方便的实现方式例如是，将转化体在LB培养基等营养培养基中以15℃～40℃、优选18℃～37℃的温度培养24小时左右，之后移植到以通常的碳源、例如0.01～50％、优选0.1～30％的葡萄糖为碳源的培养基中，接着以同样的温度培养1小时～200小时左右，在该过程中使丁二醇积存在培养液中。另外，可以根据菌的增值或反应的进行引起的碳源的消耗，连续地或间断地添加碳源，此时的反应液中的碳源的浓度不限于上述浓度。
作为用于培养微生物的培养基碳源，可单独地或组合地利用葡萄糖、蔗糖、果糖等糖类、甘油等多元醇、乙醇、乙酸、柠檬酸、琥珀酸酸、乳酸、苯甲酸、脂肪酸等 有机物质或其碱金属盐、正链烷烃等
脂肪族烃、芳香烃、或者例如蛋白胨、肉提取物、鱼肉提取物、大豆粉、麸皮等天然有机物，从而能够以通常0.01％～30％、优选0.1％～20％左右的浓度来使用。
作为用于培养微生物的培养基氮源，例如可单独地或组合地利用硫酸铵、磷酸铵、硝酸钠、硝酸钾等无机氮化合物、尿素、尿酸等含氮有机物、或蛋白胨、肉提取物、鱼肉提取物、大豆粉等天然有机物，从而能够以通常0.01％～20％、优选0.1％～10％左右的浓度来使用。
进一步根据需要，为了改善菌的生长、酶活性，可以添加磷酸二氢钾等磷酸盐、硫酸镁、硫酸亚铁、醋酸钙、氯化锰、硫酸铜、硫酸锌、硫酸钴、硫酸镍等金属盐。添加浓度根据培养条件而不同，但通常磷酸盐为0.01％～5％，镁盐中为10ppm～1％，其他化合物中为0.1ppm～1,000ppm左右。另外，根据所选择的培养基，作为维生素、氨基酸、核酸等供给源，为了改善菌的生长、酶活性可以添加1ppm～100ppm左右的酶提取物、酪蛋白氨基酸、酵母核酸。
培养基的pH值，优选调整为4.5～9，更优选调整为5～8。另外可以利用离心分离或膜过滤等方法将在上述培养基中预先培养的微生物菌体从培养液中分离、并使其再次悬浊、反应为包含反应原料的水、生理食盐水、或与培养的pH值同等的pH值的磷酸、乙酸、硼酸、三(羟甲基)氨基甲烷等和该盐组成的缓冲液等有助于降低反应液中的杂质、简化后续生成物的分流。对于反应中的pH值，当使用足够浓度的缓冲液时通常可被维持，但当由于反应而脱离上述pH值时，优选使用氢氧化钠、氨等将其适当调整为同样的pH值。
对于在反应液中生成的丁二醇的分离回收及提纯，可在丁二醇的生成量到达实质量的时点，利用离心分离将菌体从反应液中除去后，或直接在反应液中，利用一般的有机化合物的分离回收及提纯的手段来进行。例如，从将菌体和其他从培养液中除去的滤液中，利用适当的有机溶剂进行萃取。除了将该提取物直接蒸馏除去，还进一步用适当的溶剂进行再提取、或使用硅胶等色谱仪进行提纯、或利用多极蒸馏等，来得到高纯度的丁二醇。
优选通过在反应液中积蓄丁二醇，而在反应速度降低时，根据生成物的浓度而在反应液中增加水、生理食盐水、反应缓冲液等而连续进行稀释的方法。另外在反应速度降低时，通过对菌进行分馏、将上清作为生产物溶液进行回收，并将所分馏的菌再 次回收到包含反应原料的溶液或悬浊液中，从而能够恢复反应速度。该操作可使用离心分离器或分离膜等连续地或分批地实施。
(实施例)
(实施例1)
在序列号3所示的基因序列(对应于醛还原酶)的5’末端利用通常方法完全合成CAT(与起始密码子一起相当于限制酶Ndel位点)，在3’末端利用通常方法完全合成附加GAGCTC(相当于Scal位点)的平滑末端片段，得到在pUC18的多克隆位点的Smal位点中插入的质粒。对所得到的质粒进行限制酶处理，得到包含序列3的区域的Ndel-Sacl片段。利用通常方法将该基因片段插入表达载体pET17b(Novagen公司制)的多克隆位点中，得到pETBD3。
利用通常方法完全合成序列号1所示的基因序列(对应于乙酰乙酰CoA合酶)的平滑末端片段，得到在pUC18的多克隆位点中的Smal位点插入的质粒。利用以所得到的质粒为模板的PCR，通过调制在序列号1区域前后的pET17b的多克隆位点中附加了与Ndel位点前后互补的序列的扩增片段、并利用In-Fusion HD Cloning Kit(TAKARA BIO公司制)插入pET17b的Ndel位点，从而得到包含序列1的pETBD1。
利用与pETBD1同样的方法，得到将序列2所示的基因序列(对应于乙酰乙酰CoA还原酶)插入pET17b中的、包含序列2的pETBD2。
利用限制酶处理将位于pETBD3的序列1的终止密码子下游的、源于pET17b多克隆位点的EcoRl位点切断，调制pETBD3的开环片段。接着，利用PCR来调制在pETBD1的序列1的区域和包括源于上游的pET17b的启动子的区域的上下游附加了与包含上述pETBD3的EcoRl位点的上游侧15bp、下游侧的15bp对应的序列的片段。利用In-Fusion HD Cloning Kit对所得到的两个片段进行连接(ligation)，得到包含序列3及1的pETBD31。同样地，通过针对利用位于pETBD31的序列1的下游的Xhol位点的pETBD31的开环片段，插入包含以pETBD2为模板调制的T7启动子和序列2的PCR片段，从而得到包含序列3、1、2的pETBD312。
需要说明的是，在各个步骤中使用的PCR扩增产物是利用电泳将预定尺寸的带分离、切割并提纯，在连接步骤中使用。
利用通常方法使用所得到的pETBD312对大肠杆菌JM109(DE3)进行转化。利用包含100mg/L的氨苄青霉素的LB培养基5mL，在37℃下以需氧条件将转化体 pETBD312/JM109(DE3)培养12小时。将0.1mL的培养液移植到包含1％葡萄糖、100mg/L的氨苄青霉素、0.2mM的IPTG的5mL的LB培养基中，在30℃下以需氧条件培养48小时。将培养液上清供应至高速液体色谱仪(HPLC：色谱柱；shodex SH-1011(昭和电工制)、柱温度：60℃、洗脱液：25mM硫酸水溶液、流速0.6mL/min、检测：差分折射检测器)。在培养液中检测到140mg/L的1,3-丁二醇。
(实施例2)
利用通常方法完全合成序列号4所示的基因序列(对应于醇/醛还原酶)的平滑末端片段，得到插入在pUC18的多克隆位点中的Smal位点的质粒。将所得到的质粒作为模板，利用PCR来调制以与实施例1同样的方法调制的pETBD312的、附加有对应于序列号3的部分的上游侧、下游侧各个15bp的平滑末端片段。
通过使用了从用与实施例1相同的方法调制的pETBD312的、对应于序列号3的部分的上游侧、下游侧向外侧退火的引物的反向PCR，调制从pETBD312除去了序列3的直链平滑片段。
利用In-Fusion HD Cloning Kit将所得到的两个平滑末端片段结合，调制将pETBD312的序列3取代为序列4的pETBD412。利用通常方法将所得到的pETBD412转化为大肠杆菌JM109(DE3)。
用与实施例1同样的方法将大肠杆菌JM109(DE3)菌株用于培养、分析。在培养液中检测出90mg/L的1,3-丁二醇。
(实施例3)
利用通常方法完全合成序列号5所示的基因序列(对应于乙酰CoA羧化酶的DtsRl亚基)的平滑末端片段，得到在pUC18的多克隆位点中的Smal位点中插入的质粒。以所得到的质粒作为模板，分别添加到序列4的5’末端、3’末端15bp，分别调制附加了与包含pRSFDuet(Novagen公司制)的多克隆位点2的Ndel位点中“TA”的上游侧15bp、下游侧15bp对应的序列的两端各个30bp的引物并进行扩增反应，得到包含序列5的平滑末端片段。将用限制酶Ndel对所得到的平滑末端片段和pRSFDuet进行限制酶处理而得到的直链片段，利用In-Fusion HD Cloning Kit进行连接，得到包含序列5的pRSBD05。
利用通常方法完全合成序列号6表示的基因序列(对应于乙酰CoA羧化酶的AccBC亚基)的平滑末端片段，得到在pUC18的多克隆位点中的Smal位点插入的质粒。 以所得到的质粒作为模板，添加在序列6的5’末端、3’末端各个15bp，调制附加有对应于包含pRSFDuet的多克隆位点1的Ncol位点中“CC”的上游侧、包含“ATGG”的下游侧的序列的引物并进行扩增反应，得到包含序列6的平滑末端片段。利用In-Fusion HD Cloning Kit对将pRSBD05反向PCR为限制酶Ncol位点的外向的直链平滑片段连接，得到包含序列5、序列6的pRSBD65。
利用所得到的pRSBD65和在实施例1中得到的pETBD312，使用通常方法来转化大肠杆菌JM109(DE3)。
将所得到的转化体pETBD312+pRSBD65/JM109(DE3)，用包含100mg/L的氨苄青霉素、50mg/L的卡那霉素的5mL的LB培养基，在37℃下以需氧条件培养12小时。将0.1mL的培养液移植到包含1％的葡萄糖、100mg/L的氨苄青霉素、50mg/L的卡那霉素、0.2mM的IPTG的5mL的LB培养基中，在30℃下以需氧条件培养48小时。利用与实施例1同样的方法将培养液用于HPLC。在培养液中，检测出360mg/L的1,3-丁二醇。
(实施例4)
利用通常方法完全合成在序列号8所表示的基因序列(对应于人工合成基因、4-羟基丁酰CoA脱水酶)的5’末端附加有CATATG(相当于Ndel位点)、在3’末端附加有AAGCTT(相当于Hindlll位点)的平滑末端片段，得到在pUC18的多克隆位点中的Smal位点中插入的质粒。对所得到的质粒进行限制酶处理，得到包含序列8区域的Ndel-Hindlll片段。使用常规方法将该基因片段插入在表达载体pET17b(Novagen公司制)的多克隆位点中的Ndel-Hindlll位点中，得到pETSD8。以该pETSD8为模板，使其退火为源于pETSD8的pET17b载体的T7启动子上游，并进一步对将GGATCC(相当于BamHI位点)添加在5’侧的引物及pETSD8的序列8的3’末端进行互补，并进一步利用将GAGCTC(相当于Sacl位点)添加在5’侧的引物来进行PCR。对所得到的扩增产物进行Sacl处理，得到片段8。
利用通常方法完全合成在序列号7所示的基因序列(对应于烯酰CoA水合酶)的5’末端附加了CATATG(相当于Ndel位点)、在3’末端附加了CTCGAG(相当于Xhol位点)的平滑末端片段，得到在pUC18的多克隆位点中的Smal位点插入的质粒。对所得到的质粒进行限制酶处理，得到包含序列7的区域的Ndel-Xhol片段。利用通常方法将所得到的基因片段插入表达载体pETDuet(Novagen公司制)的多克隆位点2中的Ndel-Xhol位点中，得到pEDSD07。以该pEDSD07为模板，将其退火至源于pEDSD07的pETDuet 载体的T7启动子上游，进一步对将GAGCTC(相当于Sacl位点)增加至5’侧的引物及pEDSD07的序列7的3’末端进行互补，进一步使用将GGATCC(相当于BamHl位点)的互补序列添加至5’侧的引物来进行PCR。得到对所得到的扩增产物进行了Sacl处理的片段7。
利用通常方法在Sacl位点将片段8和片段7连接，作为包含序列8及序列7的一系列的片段87。在进一步利用PCR对片段87进行了扩增之后，得到进行了BamHl处理的BamHl处理片段。利用通常方法将所得到的BamHl处理片段和pETBD312的BamHl处理片段连接之后，通过使用了PCR的映射对插入方向进行确认，得到所有的插入序列的翻译方向被构成为同方向的pETBD38712。
使用所得到的pETBD38712，利用常用方法对大肠杆菌Rosetta Blue(DE3)菌株(Novagen公司制)进行转化。
将转化体pETBD38712/Rosetta Blue(DE3)，用包含100mg/L的氨苄青霉素、32mg/L的氯霉素的5mL的LB培养基，以需氧条件培养12小时。将0.1mL的培养液移植到含有100mg/L的氨苄青霉素、32mg/L的氯霉素、0.2mM的IPTG的5mL的评价培养基1中，在30℃下以需氧条件培养48小时。评价培养基1的详细内容如下。
评价培养基1的组成为：
2％ 葡萄糖；
1％ 蛋白胨(Difco公司制)；
0.5％ 酵母提取物(Difco公司制)；
2.4％ K2HPO4；
0.6％ KH2P04；
600ppm 柠檬酸铁；
100ppm 核黄素/蒸馏水(pH7.2)。
完全混合上述组成物，在常温下搅拌2小时后，使用0.45μm的过滤器进行过滤灭菌。
利用与实施例1同样的方法将培养后的培养液用于HPLC。在培养液中，检测出220mg/L的1,3-丁二醇及18mg/L的1,4-丁二醇。
(实施例5)
通过在实施例3中得到的pRSBD65和在实施例4中得到的pETBD38712，利用通常 方法对大肠杆菌Rosetta Blue(DE3)菌株进行转化。
将得到的转化体pRSBD65+pETBD38712/Rosetta Blue(DE3)，用包含100mg/L的氨苄青霉素、50mg/L的卡那霉素、32mg/L的氯霉素的5mL的LB培养基，在37℃下以需氧条件培养12小时。
将0.1mL的培养液移植到包含100mg/L的氨苄青霉素、50mg/L的卡那霉素、32mg/L的氯霉素、0.2mM的IPTG的5mL的评价培养基1中，在30℃下以需氧条件培养48小时。
利用与实施例1同样的方法将培养液用于HPLC。在培养液中检测出410mg/L的1,3-丁二醇和50mg/L的1,4-丁二醇。
本申请以2012年9月24日申请的日本专利申请第2012-209981号作为要求优先权的基础，本申请援引该日本专利申请第2012-209981号的全部内容。