说明书一种蝉花菌素及其制备和用途
技术领域
本发明涉及真菌胞内多糖领域，具体涉及一种蝉花菌素及其制备和用 途，属于高分子和分子生物学领域。
背景技术
蝉花(Cordyceps cicadae)为麦角菌科真菌寄生在蝉类若虫上的子座及 若虫尸体的复合物，为传统名贵中药，蝉花和冬虫夏草、蛹虫草同属虫草 属，是一类珍贵的药用虫草，同时也是滋补食品，具有很高的经济应用价 值(Zhang S.W.,Xuan L.J.Five aromatics bearing a 4-O-methylglucose unit from Cordyceps cicadae.Helvetica chimica acta,2007,90:404-410.)。蝉拟青 霉(Paecilomyces cicadae Miq.Samson)又名雌蝉花，是从蝉花子实体中有丝 分裂出的孢子真菌，被视为“中药八珍”之一。我国把蝉花等药用菌作为 药材使用的历史已很久远，早在明代的《本草纲目》就已记载了包括冬虫 夏草、蝉花、灵芝等40多种药用菌。现代研究报道蝉拟青霉多糖具有较 高的免疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂等生物功效(Takano P.,Yahagi N., Yahagi R.,Takada S.,Yamaguchi M.,Shoda S.,et al.The liquid culture filtrates of Paecilomyces tenuipes(Peck)Samson(＝Isaria japonica Yasuda) and Paecilomyces cicadae(Miquel)Samson(＝Isaria sinclairii(Berk.)Llond) regulate Th1and Th2cytokine response in murine Peyer’s patch cells in vitro and ex vivo.International Immunopharmocology,2005,5:903-916.)。
蝉花生长需要特定的生态环境和昆虫寄主，因而蝉花野生资源有限， 人工采集困难，因此人们大多采用固体或液体深层发酵的方法获得蝉花的 替代品。中国专利ZL201110120360.1(授权公告号CN102242154A)中公 开了一种生产蝉拟青霉菌丝体的液体发酵方法及其培养产物的应用，该培 养方法能生产出大量蝉拟青霉菌丝体，工艺周期短、产量高，且产物具有 抗肿瘤、免疫调节、降脂等功效。中国专利ZL201110122002.4(授权公告 号CN 102242079A)中公开了生产蝉拟青霉分生孢子的培养基，包括固相 培养基和液体培养基；该方法能够产生大量蝉拟青霉分生孢子，且其培养 产物中含有多糖、虫草酸、腺苷、三萜类、多种氨基酸等成分，具有免疫 调节等功能。中国专利ZL201110174054.6(授权公告号CN102835245A) 中公开了一种蝉花的仿生培养方法，包括菌种分离、筛选、孢子培养、浸 染感染体、介质培养、采收等步骤及其培养条件，易于规模化培养，腺苷 含量高。Ukai研究组从蝉花子实体中分离得到3种水溶性半乳甘露聚糖 C-3、CI-P和CI-A。C-3的相对分子质量为2.7×104Da，由D-甘露糖和 D-半乳糖组成，摩尔比是4:3，主链由α-D-(1→2)和α-D-(1→6)吡喃甘露糖 残基构成，支链为β-D-(1→2)-呋喃半乳糖残基。CI-P和CI-A均由D-甘露 糖和D-半乳糖组成，摩尔比分别为1.0:0.85和1.0:0.57，相对分子质量均 为2.5×104Da，两种半乳甘露聚糖具有相似的结构，主链由α-D-(1→6) 吡喃甘露糖残基构成，支链为β-D-(1→2)-呋喃半乳糖残基(Ukai S, Matsuura S,Hara C,et al.Structure of a new galactomannan from the ascocarps of Cordyceps cicadae shing[J].Carbohydrate Research,1982,101(1): 109-116；Kiho,T.,Miyamoto,I.,Nagai,K.,et al.Minor,protein-containing galactomannans from the insect-body portion of the fungal preparation Chán huā(Cordyceps cicadae)[J].Carbohydrate Research,1988,181,207-215.)。 Chyau等从蝉花菌丝中得到3种糖蛋白，平均分子量分别为543、31和6.3 kDa(Chyau C C,Chen C C,Chen J C,et al.Mycelia glycoproteins from Cordyceps sobolifera ameliorate cyclosporine-induced renal tubule dysfunction in rats[J].Journal of Ethnopharmacology,2014,153(3): 650-658.)。Ren等从固体发酵的蝉花菌丝中获得多糖FPCPS，由甘露糖、 鼠李糖、木糖和阿拉伯糖组成，摩尔比为43.2:32.1:14.5:10.2，Mw为3.754 ×106Da，Rg＝41.1nm，在溶液中呈无规线团链构象(Ren X,He L,Cheng J,et al.Optimization of the solid-state fermentation and properties of a polysaccharide from Paecilomyces cicadae(Miquel)Samson and its antioxidant activities in vitro[J].PloS One,2014,9(2):e87578.)。蝉拟青霉多 糖具有免疫调节功能，PCP可以提高RAW 264.7细胞中NO的含量和促进 细胞因子IL-1b、IL-6、TNF-a基因的表达(Cheng J W,Wang Y B,He L,et al.Optimization of fermentation process for the production of intracellular polysaccharide from Paecilomyces cicadae and the immuno-stimulating activity of intracellular polysaccharide[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2012,28(12):3293-3299.)。上述报道大多是关于蝉拟青霉发 酵培养方法及生物活性、蝉花子实体多糖及固体培养基多糖的结构研究， 未涉及蝉拟青霉液体深层发酵获得的菌丝体多糖的高级结构分析，比如对 其单糖组成、糖苷键连接方式等未见报道；而且越来越多的研究表明多糖 重要功能的发挥是由其结构特征决定的，其高级结构(二级及三级结构) 更为密切，多糖的生物活性与其分子量、分子链构象(Conformation)紧 密相关，了解该糖分子的构象更有助于阐明其生物活性作用机制。所以发 现新的多糖组分及活性，对研究开发新药是具有非常重要的科学意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种从蝉拟青霉深层发酵所得菌丝体中分离确 定出化学结构特征的蝉拟青霉菌丝体多糖，即蝉花菌素。
本发明的另一目的是提供所述蝉花菌素的制备和用途，该蝉花菌素的 制备方法，具有操作简单、易于控制的优点。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种蝉花菌素，由重量百分含量为99％以上的多糖组成；所述的多糖 的组成为甘露糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖，其中，甘露糖、半乳糖、鼠 李糖和葡萄糖的物质的量之比为45.20-50.20:5.50-8.30:2.10-2.60: 0.80-1.30。
所述的甘露糖为α-甘露糖，优选为α-D-甘露糖；所述的半乳糖为α- 半乳糖，优选为α-D-半乳糖；所述的鼠李糖为β-鼠李糖，优选为β-L-鼠 李糖；所述的葡萄糖为α-葡萄糖，优选为α-D-葡萄糖。
所述的多糖的结构单元中优选主链结构为(1→4)连接β-L-鼠李糖 (β-L-Rhap)残基和(1→6)连接的α-D-甘露糖(α-D-Manp)残基，支 链为(1→4)连接的α-D-半乳糖(α-D-Galp)残基和端基α-D-葡萄糖 (α-D-Glcp)，支链连接在α-D-甘露糖残基的O-3位。
所述的蝉花菌素的侧链有多种不同的变化组合，如可具有如式Ⅰ所示 的结构单元：
式Ⅰ中，Rhap为吡喃型鼠李糖，Manp为吡喃型甘露糖，Galp为吡喃 型半乳糖，Glcp为吡喃型葡萄糖。
所述的蝉花菌素的重均分子量为25KDa-40KDa，进一步优选为 29.4KDa-30.9KDa，KDa为千道尔顿。
所述的蝉花菌素由蝉拟青霉菌液体深层发酵、提取分离得到。具体技 术方案如下：
一种蝉花菌素的制备方法，包括步骤：
(1)深层发酵：在培养基中接入蝉拟青霉菌种，接种量5％-10％(重 量百分比)，在18℃-26℃条件下，静置培养6天-12天，得到蝉拟青霉发 酵菌丝体；其中所用的培养基包含(重量百分比)：葡萄糖10％-20％、酵 母粉5％-10％、蛋白胨3％-9％、蝉蛹粉0.2％-1.0％、KH2PO40.5％-1.2％和 MgSO4.7H2O 0.1％-0.8％；
(2)提取：将步骤(1)中的蝉拟青霉发酵菌丝体粉碎后，加入蒸馏 水形成料液，70℃-90℃提取、离心，所得提取液浓缩，得到浓缩液，再 加入乙醇水溶液，搅拌混匀，沉淀过夜，离心，取离心所得沉淀得到一次 蝉拟青霉菌丝体粗多糖；
(3)去蛋白：将步骤(2)所得的一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖的水溶 液用蛋白酶酶解，灭酶并离心除去变性蛋白和酶，离心所得上清液再用有 机溶剂离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用有机溶剂离心的步骤 直至无白色沉淀产生，得到提取液；
(4)透析：步骤(3)所得的提取液用孔径为3000Da-6000Da的透析 袋在去离子水中透析，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次蝉拟青 霉菌丝体粗多糖；
(5)纯化：将步骤(4)得到的二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖用去离子 水溶解得到二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖水溶液，经二乙氨基乙基纤维素- 琼脂糖(DEAE纤维素-Sepharose)离子交换层析柱层析，收集的洗脱液 用苯酚-硫酸法检测多糖，收集第二洗脱峰的洗脱液经凝胶过滤层析，凝 胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集富含多糖的洗 脱液，经浓缩、透析和冻干得到白色疏松絮状蝉拟青霉菌丝体多糖(即蝉 花菌素)，命名为PCIPS2。
所述的蝉拟青霉菌种可采用任意一种蝉拟青霉菌种，可采用市售产 品。例如蝉拟青霉菌株Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson CGMCC No.3453，该菌株已于2009年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心(简称CGMCC)注册保藏。
所述的接种量指接入的菌种体积与培养基体积之比的百分数。
为了达到更好的发明效果，优选：
步骤(2)中，所述的乙醇水溶液的用量优选为浓缩液体积的4倍-5 倍；所述的乙醇水溶液的体积百分浓度优选为90％-96％；所述的沉淀过夜 的温度优选为2℃-5℃。
步骤(3)中，所述的蛋白酶为胰蛋白酶；所述的蛋白酶的重量为一 次蝉拟青霉菌丝体粗多糖重量的1％-2％。
所述的用蛋白酶酶解的条件优选为：50℃-55℃水浴2h-2.5h。
本发明灭酶的条件采用本领域的常规条件，例如可在100℃-105℃下 灭酶15min-20min。
所述的有机溶剂为氯仿和正丁醇，其中氯仿和正丁醇的体积比为4:1。
步骤(4)中，在去离子水中透析的时间优选为60h-120h。
步骤(5)中，所述的二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖水溶液的浓度为 5mg/mL-20mg/mL，流速为0.5ml/min-1.2ml/min。
步骤(5)中，所述的二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱层 析的条件为：采用梯度洗脱，洗脱液为0.1mol/L-1.0mol/L的NaCl水溶液， 流速0.5ml/min-1.2ml/min。
步骤(5)中，所述的凝胶过滤层析的条件为：流速0.5ml/min，洗脱 液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液和0.15mol/L的NaCl水溶液，其中磷酸盐缓 冲液与NaCl水溶液的体积比为2-3:1。所述的凝胶选用葡聚糖凝胶，如市 售的Sephacryl S100等。
所述的磷酸盐缓冲液的配制方法按照本领域通用的方法，一般可参照 2005年版《中国药典》。
所述的培养基中一般还含有余量的无菌水。
所述的蝉拟青霉菌丝体中蝉花菌素具有较强的氧自由基清除作用，其 中在ABTS·+清除率模型当中，PCIPS2(IC50206.8μg/ml)与对照组Vc(IC50158.2μg/ml)比较接近；在DPPH清除率模型中，PCIPS2(IC5047.7μg/ml) 也与对照组Vc(IC5036.4μg/ml)非常接近；表明本发明蝉花菌素具有较 强的抗氧自由基活性，可以作为抗氧化剂使用或者用于制备抗氧化剂，可 广泛用于化妆品、食品保健品、动物饲料添加剂、医药等方面。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明首次通过对蝉拟青霉菌液体深层发酵，提取分离获得一种具有 生物活性的大分子蝉拟青霉菌丝体多糖PCIPS2，经单糖组成鉴定发现该 多糖是由甘露糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖组成，其物质的量之比为 45.20-50.20:5.50-8.30:2.10-2.60:0.80-1.30；FTIR证明PCIPS2是杂多糖 类，含有α与β构型；激光光散射法证明它是单一组分且分子量为25KDa -40KDa，核磁共振图谱确定其糖苷键连接方式，主链结构为(1→4)连接 β-L-Rhap残基和(1→6)连接的α-D-Manp残基，支链为(1→4)连接的 α-D-Galp残基和端基α-D-Glcp，支链连接在α-D-Manp残基的O-3位。原 子力显微镜观测出该多糖链直径在0.6nm-1.0nm。
本发明方法操作简便，易于控制，能够获得具有较高有序性、结构明 确的大分子，为深入研究其高级结构与功能关系提供研究价值。利用本发 明方法制备蝉花菌素，不影响其天然结构和活性，且该方法对设备要求较 低、成本低，利于工业生产上大规模的推广、开发和使用。
本发明蝉拟青霉菌丝体中蝉花菌素具有较强的氧自由基清除作用，其 中在ABTS·+清除率模型当中，PCIPS2(IC50206.8μg/ml)与对照组Vc(IC50158.2μg/ml)比较接近；在DPPH清除率模型中，PCIPS2(IC5047.7μg/ml) 也与对照组Vc(IC5036.4μg/ml)非常接近；表明本发明蝉花菌素具有较 强的抗氧自由基活性，可以作为抗氧化剂使用或者用于制备抗氧化剂，可 用于化妆品、食品保健品、动物饲料添加剂、医药等方面，有利于进一步 高效开发该真菌资源。
附图说明
图1A为蝉拟青霉菌丝体多糖DEAE纤维素-琼脂糖离子交换层析收 集的洗脱液在490nm的吸光度曲线，Tube number为管数；图1B为蝉拟 青霉菌丝体多糖丙烯酰胺葡聚糖凝胶Sephacryl S100纯化洗脱液在490nm 的吸光度曲线，Tube number为管数；
图2为1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化后PCIPS2溶液的 HPLC图谱；A为对照图谱，B为样品图谱；
图3为PCIPS2的红外光谱；
图4为PCIPS2的激光光散射图；
图5为PCIPS2的1H-NMR图谱(A)与13C-NMR图谱(B)；
图6为PCIPS2的1H/13C HMQC图谱(A)与1H/13C HMBC图谱(B)；
图7为PCIPS2原子力显微镜测试图。
具体实施方式
蝉拟青霉菌种，购自金寨嘉德中药材有限公司。
实施例1
(1)深层发酵：在培养基中接入蝉拟青霉菌种，接种量8％(重量百 分比)，在24℃条件下，静置培养8天，得到蝉拟青霉发酵菌丝体；其中 所用的培养基重量百分比组成为：葡萄糖14％，酵母粉8％，蛋白胨5％， 蝉蛹粉0.6％，KH2PO40.8％，MgSO4.7H2O 0.4％，余量为无菌水。
(2)提取：将步骤(1)中的蝉拟青霉发酵菌丝体粉碎后，加入蒸馏 水形成料液，85℃提取、离心，所得提取液浓缩，得到浓缩液，再加入占 浓缩液体积4倍量的乙醇水溶液(体积百分浓度为92％)，搅拌混匀，3℃ 沉淀过夜，离心，取离心所得沉淀得到一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖；
(3)去蛋白：将步骤(2)所得的一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖溶于水， 得到一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖的水溶液，将胰蛋白酶溶液加到一次蝉拟 青霉菌丝体粗多糖的水溶液中，胰蛋白酶的重量为一次蝉拟青霉菌丝体粗 多糖重量的1.3％，然后在50℃水浴2h，再在100℃下灭酶15min，冷却 至室温，10000rpm离心30min除去变性蛋白和酶；在离心所得上清液中 加入二分之一上清液体积的Sevage试剂(氯仿和正丁醇，其中氯仿和正 丁醇的体积比为4:1)，剧烈振摇15min，离心除去下层有机相和中间的蛋 白层，重复用Sevage试剂离心的步骤三次至无白色沉淀产生，得到提取 液；
(4)透析：步骤(3)所得的提取液用孔径为3000Da-6000Da的透析 袋在去离子水中透析100h，该过程可以除去寡糖、色素、有机溶剂、无机 盐等，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖；
(5)纯化：将步骤(4)得到的二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖用去离子 水溶解得到6mg/mL的二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖水溶液；用去离子水平 衡二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱(3cm×26cm)，将二次蝉 拟青霉菌丝体粗多糖水溶液经二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析 柱层析，上样量5ml，流速1.0ml/min；洗脱液为0.8mol/L-1.0mol/L NaCl 水溶液，流速1.0ml/min，梯度洗脱，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测 490nm多糖吸收峰(如图1)，收集第二洗脱峰的洗脱液；
将收集的第二洗脱峰的洗脱液经凝胶过滤层析(Sephacryl S100)进 一步纯化，层析柱的规格为2.6cm×100cm，上样量5ml，洗脱液为0.05mol/L 磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/L NaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl 水溶液的体积比为2:1)，流速0.5ml/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液 用苯酚-硫酸法检测多糖峰，收集含多糖的洗脱液，经浓缩、孔径为 3000Da-6000Da的透析袋透析和冻干得到白色疏松絮状均一的蝉拟青霉 菌丝体多糖即蝉花菌素，命名为PCIPS2。
实施例2
(1)深层发酵：在培养基中接入蝉拟青霉菌种，接种量5％(重量百 分比)，在18℃条件下，静置培养6天，得到蝉拟青霉发酵菌丝体；其中 所用的培养基重量百分比组成为：葡萄糖10％，酵母粉5％，蛋白胨3％， 蝉蛹粉0.2％，KH2PO40.5％，MgSO4.7H2O 0.1％，余量为无菌水。
(2)提取：将步骤(1)中的蝉拟青霉发酵菌丝体粉碎后，加入蒸馏 水形成料液，70℃提取、离心，所得提取液浓缩，得到浓缩液，再加入占 浓缩液体积5倍量的乙醇水溶液(体积百分浓度为90％)，搅拌混匀，2℃ 沉淀过夜，离心，取离心所得沉淀得到一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖；
(3)去蛋白：将步骤(2)所得的一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖溶于水， 得到一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖的水溶液，将胰蛋白酶溶液加到一次蝉拟 青霉菌丝体粗多糖的水溶液中，胰蛋白酶的重量为一次蝉拟青霉菌丝体粗 多糖重量的1％，然后在50℃水浴2h，再在100℃下灭酶15min，冷却至 室温，10000rpm离心30min除去变性蛋白和酶；在离心所得上清液中加 入二分之一上清液体积的Sevage试剂(氯仿和正丁醇，其中氯仿和正丁 醇的体积比为4:1)，剧烈振摇15min，离心除去下层有机相和中间的蛋白 层，重复用Sevage试剂离心的步骤三次至无白色沉淀产生，得到提取液；
(4)透析：步骤(3)所得的提取液用孔径为3000Da-6000Da的透析 袋在去离子水透析60h，该过程可以除去寡糖、色素、有机溶剂、无机盐 等，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖；
(5)纯化：将步骤(4)得到的二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖用去离子 水溶解得到5mg/mL的二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖水溶液；用去离子水平 衡二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱(3cm×26cm)，将二次蝉 拟青霉菌丝体粗多糖水溶液经二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析 柱层析，上样量5ml，流速1.2ml/min；洗脱液为0.1mol/L-1.0mol/L NaCl 水溶液，流速1.2ml/min，梯度洗脱，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测 490nm多糖吸收峰(和图1一样)，收集第二洗脱峰的洗脱液；
将收集的第二洗脱峰的洗脱液经凝胶过滤层析(Sephacryl S100)进 一步纯化，层析柱的规格为2.6cm×100cm，上样量5ml，洗脱液为0.05mol/L 磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/L NaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl 水溶液的体积比为2:1)，流速0.5ml/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液 用苯酚-硫酸法检测多糖峰，收集含多糖的洗脱液，经浓缩、孔径为 3000Da-6000Da的透析袋透析和冻干得到白色疏松絮状均一的蝉拟青霉 菌丝体多糖即蝉花菌素，命名为PCIPS2。
实施例3
(1)深层发酵：在培养基中接入蝉拟青霉菌种，接种量10％(重量 百分比)，在26℃条件下，静置培养12天，得到蝉拟青霉发酵菌丝体；其 中所用的培养基重量百分比组成为：葡萄糖20％，酵母粉10％，蛋白胨 9％，蝉蛹粉1.0％，KH2PO41.2％，MgSO4.7H2O 0.8％，余量为无菌水。
(2)提取：将步骤(1)中的蝉拟青霉发酵菌丝体粉碎后，加入蒸馏 水形成料液，90℃提取、离心，所得提取液浓缩，得到浓缩液，再加入占 浓缩液体积5倍量的乙醇水溶液(体积百分浓度为96％)，搅拌混匀，5℃ 沉淀过夜，离心，取离心所得沉淀得到一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖；
(3)去蛋白：将步骤(2)所得的一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖溶于水， 得到一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖的水溶液，将胰蛋白酶溶液加到一次蝉拟 青霉菌丝体粗多糖的水溶液中，胰蛋白酶的重量为一次蝉拟青霉菌丝体粗 多糖重量的2％，然后在50℃水浴2h，再在100℃下灭酶15min，冷却至 室温，10000rpm离心30min除去变性蛋白和酶；在离心所得上清液中加 入二分之一上清液体积的Sevage试剂(氯仿和正丁醇，其中氯仿和正丁 醇的体积比为4:1)，剧烈振摇15min，离心除去下层有机相和中间的蛋白 层，重复用Sevage试剂离心的步骤三次至无白色沉淀产生，得到提取液；
(4)透析：步骤(3)所得的提取液用孔径为3000Da-6000Da的透析 袋在去离子水透析120h，该过程可以除去寡糖、色素、有机溶剂、无机盐 等，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖；
(5)纯化：将步骤(4)得到的二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖用去离子 水溶解得到20mg/mL的二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖水溶液；用去离子水 平衡二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱(3cm×26cm)，将二次 蝉拟青霉菌丝体粗多糖水溶液经二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层 析柱层析，上样量5ml，流速0.5ml/min；洗脱液为0.1mol/L-1.0mol/L NaCl 水溶液，流速0.5ml/min，梯度洗脱，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测 490nm多糖吸收峰(和图1一样)，收集第二洗脱峰的洗脱液；
将收集的第二洗脱峰的洗脱液经凝胶过滤层析(Sephacryl S100)进 一步纯化，层析柱的规格为2.6cm×100cm，上样量5ml，洗脱液为0.05mol/L 磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/L NaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl 水溶液的体积比为3:1)，流速0.5ml/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液 用苯酚-硫酸法检测多糖峰，收集含多糖的洗脱液，经浓缩、孔径为 3000Da-6000Da的透析袋透析和冻干得到白色疏松絮状均一的蝉拟青霉 菌丝体多糖即蝉花菌素，命名为PCIPS2。
下面是对PCIPS2结构鉴定或性能分析的实施例：
实施例4：理化性质组分及分子量检测
将实施例1制得的蝉拟青霉菌丝体多糖即蝉花菌素PCIPS2，用苯酚- 硫酸法检测总多糖含量为99.3％。从图4看出，检测到90°光散射LS信 号、示差检测器检RI信号和粘度检测器VIS的信号峰具有相似的峰形， 几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。很显然，样 品PCIPS2的保留时间主要分布在10min-19min，RI信号显示多糖呈单一 对称的峰形，表明PCIPS2是均一的多糖，而LS信号主峰前的小峰可能 是由多糖部分团聚而引起。此外，分子量分布由Mw/Mn表示，即样品的 分散度，分子量分布越宽，分散度就越大。蝉花菌素Mw/Mn的比值为 1.044，比较接近1，表明PCIPS2是一个低分散、分子量较为均一的多糖 组分，其分子量Mw＝3.09×104Da。
将实施例2制得的蝉拟青霉菌丝体多糖即蝉花菌素PCIPS2，用苯酚- 硫酸法检测总多糖含量为99.1％。其激光光散射图与图4相同，检测到90° 光散射LS信号、示差检测器检RI信号和粘度检测器VIS的信号峰具有相 似的峰形，几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。 很显然，样品PCIPS2的保留时间主要分布在10min-19min，RI信号显示 多糖呈单一对称的峰形，表明PCIPS2是均一的多糖，而LS信号主峰前 的小峰可能是由多糖部分团聚而引起。此外，分子量分布由Mw/Mn表示， 即样品的分散度，分子量分布越宽，分散度就越大。蝉花菌素Mw/Mn的 比值为1.025，比较接近1，表明PCIPS2是一个低分散、分子量较为均一 的多糖组分，其分子量Mw＝3.02×104Da。
将实施例3制得的蝉拟青霉菌丝体多糖即蝉花菌素PCIPS2，用苯酚- 硫酸法检测总多糖含量为99.5％。其激光光散射图与图4相同，检测到90° 光散射LS信号、示差检测器检RI信号和粘度检测器VIS的信号峰具有相 似的峰形，几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。 很显然，样品PCIPS2的保留时间主要分布在10min-19min，RI信号显示 多糖呈单一对称的峰形，表明PCIPS2是均一的多糖，而LS信号主峰前 的小峰可能是由多糖部分团聚而引起。此外，分子量分布由Mw/Mn表示， 即样品的分散度，分子量分布越宽，分散度就越大。蝉花菌素Mw/Mn的 比值为1.016，比较接近1，表明PCIPS2是一个低分散、分子量较为均一 的多糖组分，其分子量Mw＝2.94×104Da。
实施例5：单糖组成
实施例1、实施例2或者实施例3制得的蝉拟青霉菌丝体多糖PCIPS2 3mg，加入1mL 4mol/L TFA溶液，置于具塞试管中、氮气封口，121℃ 水解6h，冷却至室温，加入200μL甲醇，60℃真空离心浓缩，去除残留 的三氟乙酸，反复3次，待衍生化。将各种单糖和糖醛酸标准品溶在0.3M (mol/L)氢氧化钠水溶液中配制每种单糖和糖醛酸浓度为5mmol/L(mM) 的单糖和糖醛酸标准品溶液，将多糖PCIPS2水解样品溶在0.3M氢氧化 钠水溶液中配制蛋白多糖PCIPS2水解样品浓度为5mmol/L的PCIPS2溶 液，然后分别取50μl单糖和糖醛酸标准品溶液、取50μlPCIPS2溶液，各 加入50μl 0.5M PMP甲醇液，混匀，70℃水浴100min，冷却至室温，加入 50μl、0.3M HCl水溶液中和，10000rpm离心3min，将上清液转移至另一 干净离心管，加水至1ml，加入等体积氯仿，充分震荡，静置分层后收集 水相，为了除去PMP、过剩反应试剂等杂质，收集的水相，重复“加水至 1ml，加入等体积氯仿，充分震荡，静置分层”的步骤三次，过0.22μm膜， 分别得到PMP衍生化后单糖和糖醛酸标准品溶液和PMP衍生化后 PCIPS2溶液，待HPLC检测。
HPLC条件:柱子APS-2HYPERSIL(5μm，4.6×250mm)，检测波长 245nm，流速1.0ml/min，柱温：室温，注入体积：10μl PMP衍生化后单 糖和糖醛酸标准品溶液或10μl PMP衍生化后PCIPS2溶液，流动相A(乙 腈):流动相B(0.05mol/L磷酸盐缓冲液(PH6.8))＝16:84(体积比)。
如图2，对应单糖和糖醛酸标准品，实施例1PCIPS2多糖部分的单糖 组成为由甘露糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖组成，其物质的量之比为47.2: 6.5:2.3:1.0；说明PCIPS2是以甘露糖为主链，并含有分支的多糖。
对应单糖和糖醛酸标准品，实施例2PCIPS2多糖部分的单糖组成为由 甘露糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖组成，其物质的量之比为50.2:8.3:2.1: 0.8；说明PCIPS2是以甘露糖为主链，并含有分支的多糖。
对应单糖和糖醛酸标准品，实施例3PCIPS2多糖部分的单糖组成为由 甘露糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖组成，其物质的量之比为45.2:5.5:2.6: 1.3；说明PCIPS2是以甘露糖为主链，并含有分支的多糖。
实施例6：FITR
取5mg实施例1、实施例2或者实施例3制得的蝉拟青霉菌丝体多糖 PCIPS2，用KBr压片，美国Nicolet5700红外光谱仪4000-600cm-1红外扫 描。
如图3，IR谱图在3049cm-1，出现一强宽吸收峰，为多糖上O-H伸 缩振动的强吸收峰，表明多糖的分子内和分子间均存在氢键。2929cm-1为C-H伸缩振动，1400-1200cm-1处的吸收峰为C-H的变形振动，表明该 组分为多聚糖。1615cm-1和1401cm-1为-CH2的变形振动吸收峰。此外， 在1041cm-1存在多糖结构中吡喃环的特征吸收峰，即糖苷键C-O-C的非 对称振动吸收峰。在896cm-1和860cm-1处的吸收峰分别表征多糖中同时 存在β-型糖苷键和α-型糖苷键，而且810cm-1为甘露糖的特征吸收峰，说 明PCIPS2中含有甘露糖。350-660cm-1处存在的吸收峰，表明该多糖为吡 喃型。
实施例7：甲基化分析
取2mg实施例1、实施例2或者实施例3制得的蝉拟青霉菌丝体多糖 PCIPS2样品溶于1ml DMSO中，通氮气密封，超声片刻助溶，然后按照 Ciucanu,et al.方法进行甲基化制备(Ciucanu,L.,&Kerek,F..A simple and repid method for permethylation of carbohydrates.Carbohydrate Research, 131,209-217)。
PCIPS2经过三次甲基化后，再经酸水解、还原，乙酰化制备成部分 甲基化阿尔迪醇乙酸酯衍生物，进行GC-MS分析(见表1)。由表可知： 鼠李糖和半乳糖均存在端基，(1→4)键两种连接方式，甘露糖以1,6-link ed Manp和1,3,6-linked Manp两种方式连接，而且PCIPS2的分支点主要 位于甘露糖上。上述结果表明PCIPS2由L-Rhap-(1→，→4)-L-Rhap-(1→， D-Glcp-(1→，D-Galp-(1→，→4)-D-Galp-(1→，→1)-D-Manp-(6→，→1)- D-Manp-(3,6→组成，摩尔比为0.226:2.559:1.00:0.778:6.625:47.040:1.407。
通过比较PCIPS2的甲基化结果发现，多糖中(1→6)糖苷键连接的 甘露糖含量最高，其次是(1→4)糖苷键连接的鼠李糖，而(1→3,6)糖 苷键连接的甘露糖含量较少，另外还有少量的葡萄糖、鼠李糖和半乳糖的 端基，表明多糖的主链是以(1→6)糖苷键连接的甘露糖，支链由D-Glcp-(1 →和→4)-D-Galp-(1→组成。此外，经NMR分析得到证明，→4)-L-Rhap-(1 →连接在半乳糖主链的首端。糖残基的摩尔比与上述单糖组成的摩尔比基 本一致。
表1PCIPS2甲基化分析
实施例8：核磁共振
取60mg实施例1、实施例2或者实施例3制得的蝉拟青霉菌丝体多 糖PCIPS2溶于1ml氘水中，瑞士Bruker-AVIII500M进行600MHz NMR 扫描。
根据PCIPS2的1H-NMR(见图5A)、13C-NMR(见图5B)结合HMQC 谱(见图6A)，检测到11个峰，然而只有7个峰较为显著可用于分析。 在1H-NMR谱中，PCIPS2的异头质子区(δ4.42-5.18ppm)主要有7个异 头氢信号(见图5A)，按低场道高场分别为δ5.18、δ5.13、δ5.13、δ5.11、 δ5.03、δ4.88和δ4.42ppm，分别命名为糖残基A、B、C、D、E、F、G， 分别与13C-NMR谱中异头碳区的碳信号(图5B)，δ107.16、δ109.12、δ 103.67、δ108.74、δ110.68、δ104.51和δ106.28ppm逐一对应。其中A、 E归属于半乳糖(Galp)残基，B归属于葡萄糖(Glcp)残基，C、D归 属于甘露糖(Manp)残基，F、G归属于鼠李糖(Rhap)残基。从各个糖 残基异头氢的化学位移可以判断异头碳的构型(δ>5.00ppm为α-型，δ<5.00 ppm为β-型)，除Rhap异头氢的化学位移处于相对高场(δ<5.00)，为β- 吡喃鼠李糖构型，Galp、Glcp、Manp的异头氢的化学位移均处于相对低 场(δ>5.00)，为α-构型。糖残基A-G的1H-NMR、13C-NMR谱化学位移 经结合1H-1H COSY、TCOSY、HMQC和HMBC谱归属完毕(表2)。
通过NMR数据比对发现(见表2)，残基A归属于(1→4)-α-D-Galp 残基，C-1/H-1(δ107.16/5.18ppm)，C-4/H-4(δ78.47/4.05ppm)发生 取代，化学位移向低场移动。残基E，B分别为(1→)-α-D-Galp和(1→)-α- D-Glcp残基，因为它们的仅有C-1位发生取代，向低场移动δ110.68pp m(E)，δ109.12ppm(B)。残基C，D的C-6化学位移为δ69.91-69.34 ppm，表明其C-6位被取代，此外D残基的C-3(δ84.62ppm)化学位 移向低场移动，表明D为(1→3,6)-α-D-Manp残基，C为(1→6)-α-D-Manp 残基。同理F残基，δ104.51ppm(C-1)和G残基δ106.28ppm(C-1)， δ71.30ppm(C-4)分别是(1→)-β-L-Rhap残基和(1→4)-β-L-Rhap残基。
表2PCIPS2糖残基的化学位移全归属
通过HMBC谱(图6B)可以推断出多糖PCIPS2糖残基之间的连接 方式。在HMBC谱中，残基C的H-1(δ5.13ppm)与残基C的C-6(δ 69.91ppm)存在交叉峰，表明残基C的自身连接为→6)-α-D-Manp-(1→6) -α-D-Manp-(1→。残基D的H-1(δ5.11ppm)与残基D的C-6(δ69.34 ppm)存在交叉峰，表明残基D的自身连接为→3,6)-α-D-Manp-(1→3,6)- α-D-Manp-(1→。残基C的H-1(δ5.13ppm)与残基D的C-6(δ69.34 ppm)有相关点，残基D的H-1(δ5.11ppm)与残基C的C-6(δ69.91 ppm)有相关点，则表明残基C与残基D的连接为→6)-α-D-Manp-(1→3, 6)-α-D-Manp-(1→，→3,6)-α-D-Manp-(1→6)-α-D-Manp-(1→，而且其摩尔 比远大于其他残基，是残基C、D组成主链。残基A的H-1(δ5.18ppm) 与残基A的C-4(δ65.65ppm)存在交叉峰，表明残基A的自身连接为 →4)-α-D-Galp-(1→4)-α-D-Galp-(1→。残基A的H-1(δ5.18ppm)与残 基D的C-3(δ84.62ppm)关联，表明残基A的C-1与主链的C-3连接。 残基E的H-1(δ5.03ppm)与残基A的C-4(δ78.47ppm)有相关点， 表明残基E连接在由(1→4)-α-D-Galp残基组成的支链的末端。残基B的H -1(δ5.13ppm)与残基D的C-3(δ84.62ppm)相关，表明(1→)-α-D- Glcp残基与主链的C-3连接。残基G的H-1(δ4.42ppm)与残基G的C -4(δ71.30ppm)存在交叉峰，表明残基G的自身连接为→4)-β-L-Rhap- (1→4)-β-L-Rhap-(1→。残基G的H-1(δ4.42ppm)与残基C的C-6(δ 69.91ppm)关联，表明残基G以O-6连接在主链上，而残基F连接在残 基G的末端。上述结果与甲基化分析的结果相符。
实施例9：原子力显微镜测试
将质量百分浓度为5％-10％的实施例1、实施例2或者实施例3制得 的蝉拟青霉菌丝体多糖PCIPS2水溶液涂抹在云母片上测试，获得该多糖 的原子力图，如图7，其中图7A为2维原子力形貌图，图7B为3维立体 形貌图，图7C为各形貌测量值，从结果中可以看出样品轮廓长度约为80 nm-100nm，高度为0.6nm-1.0nm，从而可以判断大多数由多个分子聚集 而成的，进一步证实PCIPS2是具有一定分支的柔顺链。
本发明建立了蝉拟青霉菌丝体多糖提取纯化的方法，获得均一多糖， 并初步研究其一级结构，对进一步进行生物活性及构效关系的探讨有重要 的意义。
综合实施例4-实施例9的分析结果，证实了PCIPS2由重量百分含量 为99％以上的多糖组成；多糖的组成为甘露糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖， 其中，甘露糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖的物质的量之比为45.20-50.20: 5.50-8.30:2.10-2.60:0.80-1.30。甘露糖为α-D-甘露糖，半乳糖为α-D-半 乳糖，鼠李糖为β-L-鼠李糖，葡萄糖为α-D-葡萄糖。多糖的结构单元中主 链结构为(1→4)连接β-L-Rhap残基和(1→6)连接的α-D-Manp残基， 支链为(1→4)连接的α-D-Galp残基和端基α-D-Glcp，支链连接在α-D- Manp残基的O-3位；具体结构单元如结构式Ⅰ所示。
实施例10：ABTS·+自由基清除活性
本发明检测了实施例1、实施例2或者实施例3制得的蝉拟青霉菌丝 体多糖PCIPS2的ABTS·+自由基清除能力。
参考Re等的方法(Re,Pellegrini,Proteggente,Pannala,Yang,& Rice-Evans,1999)。ABTS·+由7mmol/L ABTS溶液和2.45mmol/L K2S2O8水溶液室温避光反应16h后生成，该溶液提前1天配制，并且必须当天使 用。使用前用0.1M PBS(pH7.4)稀释到吸光值在734nm处为0.70± 0.02。0.1mL样品(50-500μg/ml)溶液加到3.9mL ABTS·+溶液中，充分混合， 避光反应6min进行吸光值测定，Vc作为对照。按照下列公式计算待测样 品对ABTS自由基的清除率:
清除率(％)＝(1-A/A0)×100％
式中A0为3.9mL ABTS溶液加0.1mL蒸馏水的吸光值；A为3.9mL ABTS溶液加0.1mL待测样品的吸光值。检测结果见表3。
实施例11：DPPH自由基清除活性
本发明检测了实施例1、实施例2或者实施例3制得的蝉拟青霉菌丝 体多糖PCIPS2的DPPH自由基清除能力。
参考Cheng等的方法并作适当修改(Cheng,Feng,Jia,Li,Zhou,&Ding, 2013)。取0.5mL不同浓度的多糖待测样品(15μg/mL-250μg/mL)于试管中， 加入1.5mL去离子水，2.0mL 0.1mmol/L DPPH乙醇溶液，混合均匀，室 温避光反应30min，在517nm波长处测吸光度，Vc作为对照。按照下列 公式计算待测样品对DPPH自由基的清除率。
清除率(％)＝(1-A1/A0)×100％
式中A0为2mL 0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液加2mL蒸馏水的吸光 值；A1为2mL 0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液加2mL待测样品的吸光值。 检测结果见表3。
表3PCIPS2与对照组Vc的抗氧化活性比较
样品 ABTS·+(IC50μg/ml) DPPH(IC50μg/ml)
Vc 158.2±0.03 36.4±0.06
PCIPS2 206.8±0.12 47.7±0.07
从表3中看出，在ABTS·+清除率模型当中，PCIPS2(IC50206.8μg/ml) 与对照组Vc(IC50158.2μg/ml)比较接近；在DPPH清除率模型中，PCIPS2 (IC5047.7μg/ml)也与对照组Vc(IC5036.4μg/ml)非常接近；表明本发明 蝉花菌素具有较强的抗氧自由基活性，可以作为抗氧化剂使用或者用于制 备抗氧化剂，可用于化妆品、食品保健品、动物饲料添加剂、医药等方面。