降低有毒成分含量的咔哇提取物及含其组合物与制备方法 【技术领域】
本发明涉及含有降低有毒副作用成分含量的咔哇提取物、其制备方法和包含有该提取物组合物，具体为含有该降低了有毒副作用成分含量、甚至去除了有毒副作用成分的咔哇提取物的药物、食品添加剂和保健食品。
背景技术
咔哇(即KAVA)为胡椒科植物卡瓦Piper methysticum的干燥根。在南太平洋岛国具有2000多年的使用历史，传统上咔哇的根被用来制备咔哇茶或直接咀嚼，使人产生放松和愉悦的感觉。近代药理学研究表明，咔哇中的主要成分咔哇内酯类化合物具有良好的抗焦虑、抗抑郁和镇静功能并在全世界得到广泛的应用，参见：M.H.Pittler，E.Ernst，J.Clin.Psychopharmacol 20，84(2000)。咔哇内酯类化合物中已有7个咔哇吡喃酮经鉴定，其中醉椒素(kawain)、二氢醉椒素(dihydrokawain)、麻醉椒素(methysticin)、二氢麻醉椒素(dihydromethysticin)、甲氧基醉椒素(yangonin)、去甲氧基醉椒素(desmethoxyyangonin)被认为是抗焦虑、抗抑郁和镇静的活性成分。咔哇还含有两个黄色色素：黄醉椒素A和B(flavokawain A和B)，一般认为这两种成分使长期食用咔哇者肤色变黄。有药理实验证明黄醉椒素A作用于膀胱肿瘤细胞。
咔哇的传统制法是用椰子奶或水提取，在使用中未见明显的毒副作用，动物实验也证明咔哇的水提取物没有肝脏毒性。但是由于水或椰子奶提取的咔哇提取物中的咔哇内酯含量低，目前商业上所使用的咔哇提取物是以乙醇水溶液、丙酮水溶液或氯仿等溶剂进行提取，制备的咔哇提取物一般称为“标准提取物”。HPLC检测表明，按照美国制备标准提取物的方法提取的咔哇提取物中，黄醉椒素B地含量大于2％。自1999年以后，大量文献报道含有该咔哇提取物的药物或保健食品可能引起严重的肝损伤。参见：Center for Food Safetyand Applied Nutrition，Morbidity Mortality Weekly Rep.51，1065(2002)；M.Blumenthal，Herbal.Gram.47，64(1999)；A.Denham，M.A.McIntyre，J.Whitehouse，J.Altern.Complement.Med.8，237(2002)。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题是降低或去除咔哇提取物中对肝有毒副作用的成分，提供基本上不含有毒副作用成分或显著降低有毒副作用成分含量的咔哇提取物，其含有公认的六种咔哇内酯活性成分：去甲氧基醉椒素，甲氧基醉椒素，二氢醉椒素，醉椒素，二氢麻醉椒素和麻醉椒素；其咔哇内酯的总含量大于10％，可达11-90％；本发明还包括研究纯化咔哇提取物的方法，以及含有所述提取物的组合物，如药物、食品添加剂和保健食品。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案。
一种降低黄醉椒素B含量的咔哇提取物，其中按重量计黄醉椒素B含量≤1.0％。
所述咔哇提取物，其中按重量计咔哇内酯含量≥10％，黄醉椒素B含量0-1.0％；咔哇提取物中咔哇内酯含量可以为11-90％，黄醉椒素B含量可以为0-0.5％。
含咔哇提取物的组合物，其中含有前述的咔哇提取物，还含有常规药用、食用或保健品用的载体。
片剂、颗粒剂或缓释制剂的辅料有：崩解剂如羟丙纤维素，羧甲基淀粉钠，交联聚维酮，交联羧甲基纤维素钠；填充剂如乳糖，微晶纤维素，糊精，淀粉，磷酸钙；粘合剂如：预胶化淀粉，聚维酮，羧甲基纤维素钠，羟丙甲纤维素；润滑剂如滑石粉，硬脂酸镁，微粉硅胶，氢化植物油；润湿剂如十二烷基硫酸钠，吐温80；骨架材料如羟丙甲纤维素，乙基纤维素等。
液体制剂、混悬液的辅料有：增溶剂如吐温80，普流罗尼F-68，聚氧乙烯氢化蓖麻油等；助悬剂如羧甲基纤维素钠，聚维酮，羟丙甲基纤维素等；防腐剂如尼泊金甲，乙，丙和丁酯；pH调节剂如枸橼酸及枸橼酸盐；磷酸盐等。
前述咔哇提取物的制备方法，包括如下步骤：
取咔哇原料，用含水或不含水的低级醇、含水或不含水的低级酮、含水或不含水的含4-10个碳原子的酯类、含水或不含水的氯代低级烷烃或者这些溶剂的混合物提取，提取液除去溶剂，得粗咔哇提取物；低级醇可以是甲醇、乙醇，低级酮可以是丙酮，4-10个碳原子的酯类可以是乙酸乙酯；用大孔树脂、聚酰胺、硅胶、氧化铝、壳聚糖常规处理粗咔哇提取物；或者，对碱性水液中的粗咔哇提取物，用沸点为30至100℃的脂族溶剂和/或脂环族溶剂萃取去除黄醉椒素B后；将水相调至酸性，用乙酸乙酯和/或氯代低级烷烃萃取水相，浓缩萃取液至干，得精制咔哇提取物；
或者，将用沸点为30至100℃的脂族溶剂和/或脂环族溶剂提取了黄醉椒素B后的咔哇，再用含水或不含水的低级醇、含水或不含水的低级酮、含水或不含水的含4-10个碳原子的酯类、含水或不含水的氯代低级烷烃或者这些溶剂的混合物提取，浓缩提取液至干，得降低黄醉椒素B含量的精制咔哇提取物；
或者，将粗咔哇提取物加入适量水，用石油醚、环己烷和/或己烷萃取水相，将萃取后的水相浓缩至干，得降低黄醉椒素B含量的精制咔哇提取物；
或者，选择上述方法组合使用。
所述咔哇提取物的制备方法中：脂族溶剂和/或脂环族溶剂是石油醚、环己烷、正己烷和/或汽油；氯代低级烷烃是二氯乙烷、三氯甲烷；大孔树脂为非极性或弱极性大孔树脂；氧化铝为酸性或中性氧化铝；壳聚糖为甲壳素脱乙酰基后的产物；大孔树脂或聚酰胺层析柱的洗脱液选用含水乙醇、含水甲醇和/或含水丙酮；硅胶柱层析的洗脱液先选石油醚、环己烷和/或乙酸乙酯，再选异丙醇、乙酸乙酯、氯代低级烷烃、甲醇或含水甲醇、乙醇或含水乙醇、丙酮或含水丙酮，或者它们的混合物洗脱；碱水液含无机碱和/或有机碱与水；酸水液含无机酸和/或有机酸与水。其中，大孔树脂可以选用HP20、AB-8、XAD-2、D-101、HP21、SP825、SP850、SP70、SP700、SP207、H107；无机碱可以为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾和/或磷酸氢二钠，有机碱可以为柠檬酸盐、葡甲胺、泛酸钠、L-半胱氨酸、苯甲酰胺、烟酰胺、硫脲、乙醇胺和/或脲；无机酸为硫酸和/或盐酸；有机酸可以为柠檬酸、醋酸、草酸、马来酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、酒石酸和/或抗坏血酸。
咔哇提取物具体的制备方法是：将粗咔哇提取物上硅胶柱，先用石油醚或环己烷与乙酸乙酯的体积比为10-20∶1的混合溶剂洗脱硅胶柱，再用异丙醇、乙酸乙酯、氯代低级烷烃、甲醇或含水甲醇、乙醇或含水乙醇、丙酮或含水丙酮，或者它们的混合物洗脱，回收溶剂至干得降低黄醉椒素B含量的精制咔哇提取物。
咔哇提取物具体的制备方法还有：向粗咔哇提取物的水混悬液中，加入适量甲醇和/或乙醇，形成咔哇提取物溶液后，加入壳聚糖；或者向粗咔哇提取物的水混悬液中加入壳聚糖物溶液；混匀，放置后，离心或过滤去除沉淀物，将清液浓缩干燥，得降低黄醉椒素B含量的精制咔哇提取物。
咔哇提取物较好的制备方法是：向粗咔哇提取物水溶液或水混悬液中加入有机碱和/或无机碱，使水溶液或水混悬液呈碱性，混合后，用石油醚、环己烷和/或己烷萃取去除黄醉椒素B，获得的水相加入无机酸和/或有机酸，使溶液成酸性，混匀后，用乙酸乙酯、氯仿和/或二氯甲烷萃取酸性溶液，回收萃取液至干，得降低黄醉椒素B含量的精制咔哇提取物。
咔哇提取物更为理想的制备方法是：将咔哇的含水或不含水乙醇、含水或不含水甲醇、含水或不含水丙酮的提取液，除去有机溶剂得到的溶液或混悬液，或者用少量与水能混溶的溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等溶解粗咔哇提取物，然后加入适量水制成咔哇提取物的溶液或混悬液，上大孔树脂柱，用含水或不含水的乙醇、含水或不含水的甲醇、含水或不含水的丙酮、氯代烷烃和/或甲醇的混和物、乙酸乙酯和/或石油醚的混合物洗脱，洗脱液浓缩至干，得降低黄醉椒素B含量的精制咔哇提取物。
我们的非常偶然地发现，咔哇提取物中的查尔酮类成分，具体地说是黄醉椒素B，表现出强烈的肝脏毒性作用，是咔哇提取物中的主要毒性成分。为此，进行了大量实验研究。
A：黄醉椒素B对正常人肝细胞株L02的细胞毒性作用
L02细胞株用含有10％小牛血清的RPM1640培养基培养，以1×105细胞浓度接入96孔细胞培养板，每孔接种100μl，二氧化碳培养箱培养24小时后，弃去培养液，加入含有不同浓度黄醉椒素B的培养基，继续培养48小时，以MTT法(参见：T.Mossman，J.Immunol.65，55(1983)；A.P.Li et al.，Chem.Biol.Interact.121，117(1999))测定细胞存活率。结果表明黄醉椒素B对L02细胞有显著的细胞毒性，其IC50为9.2μg/ml。
B：黄醉椒素B对ICR小鼠的肝脏毒性作用
选用18-20克雄性ICR小鼠，随机分组，每组6只。将动物保持在标准化的环境下，自由进食和饮水。黄醉椒素B以0.5％羧甲基纤维素钠悬浮，实验组小鼠以25mg/kg的剂量灌胃给药7天，对照组平行给以0.5％羧甲基纤维素钠。7天后小鼠取血，测定血清谷草转氨酶活性，结果显示，实验组小鼠血清谷草转氨酶活性显著高于对照组。
取小鼠肝脏进行病理切片，常规染色，显微镜观擦，结果显示，所有对照组小鼠肝脏细胞正常，所有实验组小鼠(黄醉椒素B25mg/kg)肝脏汇管区浸润，有大量炎症细胞，肝细胞浊肿，空泡化，与文献报道服用含有咔哇提取物导致肝损伤的临床病例肝脏病理切片现象一致(参见：J.G.Paul，J.C.Nathan，L.H.Richard，C.Peter，W.A.Peter.Med.J.Aust.178，442(2003))。
本发明提供的技术方案降低或去除咔哇提取物中对肝有毒副作用的成分，提供基本上不含有毒副作用成分或显著降低有毒副作用成分含量的咔哇提取物，其含有公认的六种咔哇内酯活性成分：去甲氧基醉椒素，甲氧基醉椒素，二氢醉椒素，醉椒素，二氢麻醉椒素和麻醉椒素；其咔哇内酯的总含量大于10％，可达11-90％。本发明研究的纯化咔哇提取物的方法简便、实用。
【附图说明】
图1、咔哇丙酮提取物HPLC图(箭头所指色谱峰为黄醉椒素B)
图2、咔哇丙酮提取物经大孔树脂HP20精制后，含有降低黄醉椒素B含量的咔哇提取物HPLC图(箭头所指色谱峰为黄醉椒素B)
【具体实施方式】
本发明使用的咔哇原料为来源于斐济群岛的咔哇根粉末(100-200目)，购自美国夏威夷Kava Kauai公司(Kava Kauai，PO Box 1202，Kapaa Kauai Hawaii，96746，USA)。
本发明中咔哇提取物中咔哇内酯的含量测定方法见文献H.S.Alexander，M.Imre，Journal of Chromatography A，948，51(2002)
实施例1：
取咔哇原料，粉碎后，分别用水、60％丙酮(含水60％)、丙酮、95％乙醇提取，除去溶剂后，分别得到咔哇水提取物、咔哇60％丙酮提取物、咔哇丙酮提取物、咔哇95％乙醇提取物，测定其相应的咔哇内酯与黄醉椒素B的含量，测定结果表明丙酮提取物中黄醉椒素B的含量最高，所以下面的制备方法用丙酮提取物作为粗咔哇提取物的代表。参见下表。
不同溶剂提取的咔哇提取物中咔哇内酯的总含量及黄醉椒素B百分含量
提取溶剂 干提取物中的 干提取物中的
黄醉椒素B(％) 咔哇内酯(％)
水 0.02 4.66
60％丙酮 2.60 47.48
丙酮 3.37 57.00
95％乙醇 3.23 54.88
实施例2：以大孔树脂层析制备含有降低的黄醉椒素B含量的咔哇提取物
取1克咔哇的丙酮提取物(即粗咔哇提取物，下同)，加入1ml乙醇溶解，再加入10ml水制成咔哇提取物悬液，加入柱体积为50毫升的HP20大孔树脂层析柱，以200毫升35％的乙醇(体积比)溶液洗脱，将洗脱液浓缩至干，HPLC法测定，提取物中的内酯总含量为58.2％，黄醉椒素B含量0.04％。参见图2。
实施例3：通过硅胶层析制备降低黄醉椒素B的提取物
取1克咔哇的丙酮提取物，加入1ml乙酸乙酯溶解，加入适量硅胶拌样，挥干有机溶剂，获得硅胶柱层析样品。将层析样品加于柱体积为50毫升的硅胶柱顶端，以石油醚与乙酸乙酯的体积比为10∶1的混合溶剂洗脱硅胶柱。由于黄醉椒素B具有黄颜色并且极性比活性成分咔哇内酯小，层析洗脱的第一个黄颜色的色带即为黄醉椒素B。在层析洗脱第一个黄颜色的色带黄醉椒素B后，以TLC检测后面的洗脱液中无黄醉椒素B，以甲醇洗脱层析柱上的其它成分，将甲醇洗脱液浓缩至干，获得降低黄醉椒素B含量的咔哇提取物。HPLC测定，提取物中的内酯总含量为61.2％，不含有黄醉椒素B成分。
实施例4：通过酸性、中性氧化铝柱层析制备降低黄醉椒素B的提取物
取1克咔哇的丙酮提取物，加入1ml氯仿溶解，分别加入柱体积为30毫升的酸性、中性氧化铝干柱顶端。酸性、中性氧化铝层析柱分别以200毫升的氯仿∶甲醇体积比为2∶1混合溶剂洗脱，TLC辅助检测。洗脱液浓缩至干，获得降低黄醉椒素B含量的咔哇提取物。HPLC法测定，提取物中咔哇内酯的总含量为38.2％，黄醉椒素B含量为0.3％。
实施例5：通过壳聚糖处理获得降低黄醉椒素B的咔哇提取物
取1克咔哇的丙酮提取物，以50毫升40％的乙醇溶解，向此溶液中加入壳聚糖使壳聚糖的在总体积中的浓度为1％，充分搅拌溶解，在室温下静置60分钟，离心去除沉淀物，离心所得清液浓缩至干，获得降低黄醉椒素B含量的咔哇提取物。HPLC法测定，提取物中咔哇内酯的总含量为46％，黄醉椒素B含量为0.1％。
实施例6：通过酸碱处理的降低黄醉椒素B的提取物的制备方法
取1克咔哇的丙酮提取物，加入1ml乙醇溶解，加入50毫升水制成咔哇提取物的混悬液，向咔哇提取物悬液中加入碳酸钠，搅拌溶解，使咔哇提取物悬液的pH值为9，充分混匀，30分钟后用50毫升环己烷萃取三次。获得的水相以盐酸调节酸碱性，使溶液的pH值为2，充分混匀，静置2小时后用50毫升乙酸乙酯萃取三次，合并萃取的乙酸乙酯并回收溶剂至干，获得降低黄醉椒素B含量的咔哇提取物。HPLC法测定，提取物中咔哇内酯的总含量为41％，黄醉椒素B含量为0.05％。
实施例7：通过环己烷萃取处理获得降低黄醉椒素B含量的提取物
取3克经粉碎的咔哇根，加入30毫升60％的丙酮溶液，浸泡30分钟，然后再超声提取60分钟，离心去除药渣，去除药渣的上清液减压回收去除丙酮，剩下的咔哇提取液以45毫升的环己烷萃取三次(每次15毫升)，将经过环己烷萃取后的水相部分浓缩至干，获得降低黄醉椒素B含量的咔哇提取物。HPLC法测定，提取物中咔哇内酯的总含量为32.5％，黄醉椒素B含量为0.2％。
实施例8：以大孔树脂AB-8处理制备含有降低的黄醉椒素B含量的咔哇提取物
取1克咔哇的丙酮提取物，加入1ml乙醇溶解，再加入4ml水制成咔哇提取物悬液，加入柱体积为30毫升的AB-8大孔树脂层析柱，先用50毫升的水洗脱，然后用150毫升体积比为80％的乙醇溶液洗脱，将乙醇洗脱液浓缩至干，HPLC法测定，提取物中的内酯总含量为58.5％，黄醉椒素B含量0.05％。