一种动物组织DNA的保存方法.pdf

本发明公开了一种动物组织DNA的保存方法，属于生物组织固定技术领域。本发明的技术方案要点为：将动物新鲜组织或冷冻组织切成组织块后用食盐干粉或氯化钠干粉沾满组织表面或者将动物新鲜组织或冷冻组织置于质量浓度为10%-36.5%的氯化钠溶液中即能实现动物组织的长期保存，其中以质量浓度为10%的食盐水固定效果为最佳。本发明除了能够实现酒精固定样品满足长期保存动物组织的目的和后续实验要求外，同时具有试剂廉价易得、试剂安全无挥发性和可用于长途运输尤其是空运的要求，优于现在采用的酒精固定的方法，尤其适用于野外动物样品的采集和固定保存。

权利要求书
1.  一种动物组织DNA的保存方法，其特征在于：将动物新鲜组织或冷冻组织切成组织块后用食盐干粉或氯化钠干粉沾满组织表面或者将动物新鲜组织或冷冻组织置于质量浓度为10%-36.5%的氯化钠溶液中即能实现动物组织的长期保存。

2.  根据权利要求1所述的动物组织DNA的保存方法，其特征在于：所述的氯化钠溶液的质量浓度为10%。

说明书一种动物组织DNA的保存方法
技术领域
本发明属于生物组织固定技术领域，具体涉及一种动物组织DNA的保存方法。
背景技术
目前对于动物组织的保存方法主要存在以下三种：
（1）酒精固定组织保存法
在科学研究和动物遗传资源保护中，常采用将获取的新鲜动物组织，如肌肉，取适量加入到无水酒精或者体积分数为95%的酒精中保存，以达到保存动物DNA等遗传信息的目的，此种方法因取材量少且样品保存质量好，能够满足多数实验的需求而被广泛应用，因此此种方法在实验和样品不需要长途运输（如空运）中多被采用。但是酒精保存的样品存在如下缺点：（1）酒精价格较贵，若采用大批量保存时和整个样品保存时，成本较高；（2）酒精易挥发，固定样品后要经常更换固定液；（3）酒精为易燃品，不适宜长途运输或空运（为违禁品）；（4）在野外实验和采样中，需要酒精的量比较大，而大量携带酒精也不现实，尤其在偏远地区，酒精更不易获得；（5）酒精固定之后的样品多需要在低温条件下保存，才能达到长期保存的目的。
（2）低温保存法
在研究中，也有采用将需固定组织保存在低温的条件下（-20℃一般冰箱，或-80℃超低温冰箱，或-196℃液氮中），以抑制体内的各种酶的活动，达到长期保存组织的目的，但是此种方法也存在以下缺点：（1）此种方法需要特殊设备，且超低温冰箱和液氮罐等成本较高，其存储空间也有一定的局限性；（2）存储设备要持续供电，一旦发生较长时间断电，样品可能腐坏，不能用于后续实验；（3）此种方法不适宜野外采样，仅适用于实验室内少量保存样品。
（3）RNA保存试剂及低温保存法结合
采用将样品加入到保存试剂，如RNAlater中，4℃保存过夜，之后移入低温保存设备中长期保存，这些样品不仅可以应用于RNA实验，且同时其离心后分层悬浮液也可以用于DNA的提取。但是此种方法也存在如下缺陷：（1）试剂成本比较高，如RNAlater进口试剂价格约为1000元/100mL，而国产的价格也要200元/100mL，远远高于酒精的保存方法；（2）用以上试剂之后仍需将样品保存在低温条件下，所以仍存在低温保存的诸多局限性；（3）此种方法主要用于保存动物的RNA组织，而DNA一般在RNA提取后的残余液体中，其DNA有较大一部分在RNA提取过程中损失掉了，不能满足DNA实验的后续实验需求。
以上三种组织的保存方法都存在一定的缺陷，因此，有必要研制一种使用方便且成本低廉的动物组织的保存方法以解决上述技术问题，尤其是解决长途运输中存在的问题。
发明内容
本发明为解决现有酒精固定样品的酒精在野外环境下不易获得、成本高、长期保存易挥发及不能空运等缺陷，提供了一种试剂廉价易得且使用安全方便的动物组织DNA的保存方法。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种动物组织DNA的保存方法，其特征在于：将动物新鲜组织或冷冻组织切成组织块后用食盐干粉或氯化钠干粉沾满组织表面或者将动物新鲜组织或冷冻组织置于质量浓度为10%-36.5%的氯化钠溶液中即能实现动物组织的长期保存。
进一步优选，所述的氯化钠溶液的质量浓度为10%。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：（1）所需试剂经济安全，固定后样品可以空运；（2）扩增效率高，测序结果可靠，适宜野外采样；（3）所需试剂来源稳定，分布广泛，方法简单易行；（4）氯化钠和食盐可以相互替换，且在采用高盐法提取DNA时，均不影响后续实验结果。
附图说明
图1是基因组提取和PCR扩增结果电泳检测图。M为marker，其条带长度从上到下分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。图1A 中X1、X2为新鲜鲫组织，F1、F2为同一条鱼未加任何固定剂的组织用酚-氯仿法提取后电泳检测图。图1A 中73、74、75、76分别是X1、X2、F1、F2的RH引物PCR扩增产物；77、78、79、80是X1、X2、F1、F2的RAG引物PCR扩增产物。图1B中81、82、83、84为X1、X2、F1、F2的Cytb引物的PCR扩增产物；85、86、87、88为X1、X2、F1、F2的COI引物PCR扩增产物。
图2是酚-氯仿法提取的基因组DNA电泳检测图。M：marker；N：NaCl干粉；C：无水乙醇；S：食盐干粉；10：10%的NaCl溶液；15：15%的NaCl溶液；20：20%的NaCl溶液；25：25%的NaCl溶液；30：30%的NaCl溶液；36.5：36.5%的NaCl溶液。
图3是无水乙醇、NaCl干粉和食盐干粉固定样品四个基因扩增结果电泳检测图。M：marker；N：NaCl干粉；C：无水乙醇；S：食盐；10：10%NaCl溶液；15：15%NaCl溶液；20：20%NaCl溶液；25：25%NaCl溶液；30：30%NaCl溶液；36.5：36.5%NaCl溶液。
图4是RAG2各位点测序结果图。框中显示的为兼并碱基位点，自左至右（a-m）分别位于23bp，44bp，62bp，92bp，113bp，119bp，155bp，257bp，296bp，347bp，441bp，445bp，458bp。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例
        样品的采集及处理
鲫鱼经麻醉后去掉背部鳞片及皮肤，分别取其背部肌肉0.1g放于1.5mL的离心管，离心管中分别放入1mL无水乙醇（编号37）、NaCl干粉（沾满组织表面，编号38）、食盐干粉（沾满组织表面，编号39）、1mL质量浓度为10%的NaCl溶液（编号40）、1mL质量浓度为15%的NaCl溶液（编号41）、1mL质量浓度为20%的NaCl溶液（编号42）、1mL质量浓度为25%的NaCl溶液（编号43）、1mL质量浓度为30%的NaCl溶液（编号44）、1mL质量浓度为36.5%的NaCl溶液（NaCl 25℃时的溶解度，编号45）。另取0.1g放于不加任何试剂的1.5mL离心管中（编号76）。另取同尾鱼背部肌肉0.1g放于不加任何试剂的1.5mL离心管中（编号74，放于-20℃冰箱中保存做处理组对照）。以上每个离心管取两份，样品放于室温（25-30℃）1周后用于后续实验。
                DNA        提取
采用经典的酚-氯仿法提取以上组织的DNA，具体步骤如下：
         A        、试剂配制
配药品所用的枪头、双蒸水，离心管需经过121℃高压灭菌30分钟，试剂瓶、量筒、烧杯等均洗涤干净后用双蒸水冲洗。
（1）0.5mol/L的EDTA：称取37.22g EDTA溶解于150mL蒸馏水中，在磁力搅拌器上搅拌至其溶解，用NaOH调节溶液的pH值，使溶液的pH值约为8.0，此时EDTA全部溶解，大约需要加入NaOH颗粒4g，加水定容至200mL，高压灭菌4℃保存。
（2）1mol/L的Tirs-HCl：称取24.22g Tirs碱，溶解于150mL水中，加浓盐酸调pH值，使其pH值在8.0左右，大约需加入0.4mL浓盐酸，加水定容至200mL，高压灭菌4℃保存。质量浓度为5%的SDS：称取5g SDS加80mL水溶解，最后定容至100mL，室温保存。3mol/L的醋酸钠：称取40.83g三水醋酸钠溶于适量蒸馏水最后定容至100mL，4℃保存。
（3）蛋白酶K：称取蛋白酶K 60mg，溶于适量蒸馏水中，定容到3mL，分装3管，-20℃保存。
（4）DNA提取液：用移液枪分别吸取0.2mL 1mol/L的Tris-HCl，0.4mL 0.5mol/L的EDTA，2mL质量浓度为5%的SDS，加水定容至20mL，室温保存。
（5）50倍的TAE电泳缓冲液（pH约8.5）：称取24.22g Tirs碱，加少量蒸馏水溶解，用移液枪吸取冰醋酸5.71mL加入Tirs碱溶液中，量筒量取20mL 0.5mol/L的EDTA，加水定容至100mL，4℃保存，用时稀释至1倍。6倍的上样缓冲液：0.25%（m/v）的溴酚蓝（bromophenol blue，PBP）1mL，质量浓度为40%的蔗糖水溶液5mL，分装6管，-20℃保存。质量浓度为1%的琼脂糖凝胶：称取0.4g琼脂糖加入1倍的TAE缓冲液40mL，用时现配，加入EB(溴化乙锭，ethidium bromide，凝胶温度降至50℃左右加入）。现配现用。
（6）氯仿：异戊醇（24:1，v/v）：氯仿24mL，异戊醇1mL混匀，4℃备用，现配现用。
（7）酚：氯仿：异戊醇（25:24:1，v/v/v）：取配好的氯仿：异戊醇（24:1）10mL，加10mL的饱和酚，4℃备用。现配现用。
（8）体积分数为70%的乙醇：无水乙醇70mL加蒸馏水至100mL，4℃备用。
                DNA        提取
（1）取肌肉或其溶液各加入400uL DNA提取液，再各加入4uL的蛋白酶K，放入56℃水浴锅中，消化8-10小时，其间轻轻上下颠倒数次，直到离心管内组织消化完全（悬液完全透明）为止。
（2）取出消化好的液体各管加入等体积即404uL的饱和酚，轻轻上下颠倒数次充分混匀，室温静置10分钟，然后在离心机上常温以10000转/分钟的转速离心10分钟，转移上清至一新离心管内。
（3）重复（2）一次。
（4）在各离心管内加入同上清一样体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1，v/v/v），轻轻上下颠倒数次充分混匀，室温放置10分钟，然后以10000转/分钟的转速室温离心10分钟，转移上清至一新离心管中。
（5）重复（4）一次。
（6）取上清，加等体积的氯仿：异戊醇（24:1，v/v），轻轻上下颠倒混匀，室温静置10分钟，10000转/分钟室温离心10分钟，转移上清至一新离心管中。
（7）重复（6）一次。
（8）取上清，加各入十分之一上清体积的3mol/L的醋酸钠充分混匀，再各加入2倍上清体积-20℃的无水乙醇，轻轻充分混匀，室温静置10分钟，10000转/分钟室温离心5分钟。
（9）弃去上清，保留沉淀，加入体积分数为70%的冷乙醇洗DNA两次，室温离心2000转/分钟离心3分钟。
（10）弃去体积分数为70%的乙醇，拿枪把乙醇吸干净，室温晾15分钟，每管加入100uL的灭菌双蒸水溶解DNA，4℃保存备用。
                DNA        浓度和质量检测
从已经稀释充分的各管中吸取1uL溶解DNA，用Nanodrop 2000检测其浓度。同时吸取3uL的DNA溶解液在电压为120V的条件下，电泳15分钟，在凝胶成像系统下拍照，见图1和图2。
        分子生物学实验检验
        A        、引物合成
从商业公司合成以下引物，用于检测以上提取DNA的质量：
RH_28F   5'-TACGTGCCTATGTCCAAYGC-3’
RH_1039R 5'-TGCTTGTTCATGCAGATGTAGA-3’（Chen et al，2003；Chen et al，2008）
COI_Fish-F：5’-TCTCAACCAACCATAAAGACATTGG-3’
COI_Fish-R：5’-TATACTTCTGGGTGCCCAAAGAATCA-3’（Hubert et al，2008）
RAG1-2533F：CTGAGCTGCAGTCAGTACCATAAGATGT
RAG1-4078R：TGAGCCTCCATGAACTTCTGAAGRTAYTT（López et al, 2004）
GluF_cytb：AACCACCGTTGTATTCAACTACAA
ThrR_cytb：ACCTCCGATCTTCGGATTACAAGACCG（Machordom，2001）
        B        、        PCR        扩增
采用如下的反应体系：（30uL体系）
Taq Mixture  15uL
模板DNA  1uL
引物P1（10uM）  1.5uL
引物P2 (10uM)   1.5uL
ddH2O  11uL
PCR扩增条件如下：
94℃  5分钟
94℃  30秒
50-55℃  30秒-1分钟
72℃  1分钟 30个循环
72℃  10分钟  产物4℃保存
        C        、目的条带检测回收及送样测序
质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在凝胶成像系统内拍照并切胶，按SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工（生物工程）有限公司）说明书进行胶回收。并用质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的胶回收结果，达到测序要求的送样测序，测序由商业公司完成，见图1和图3。
        测序结果分析及处理
测序获得的结果经Lasergene Version 7.0软件包中的SeqMan软件进行组装并可视化其测序结果可靠性并作出评价比较，以图4为例。
        最优条件的选择
根据试剂成本、试剂安全性和可获得性、固定组织的可操作性、组织固定后异味程度、基因组DNA提取浓度、电泳检测其基因组DNA浓度结果、线粒体基因和核基因扩增效率、电泳检测PCR产物亮度、测序结果可靠性等综合评价食盐固定效果及其最优浓度，优选结果见下表。
不同组织经处理后均采用酚-氯仿法提取基因组DNA，并分别用琼脂糖电泳检测DNA质量、Nanodrop 2000检测基因组DNA产物浓度、PCR扩增四个目的条带情况、四个基因目的条带扩增电泳检测情况、测序结果分析并结合各种方法的野外适用性，认为采用食盐干粉或NaCl干粉沾满组织表面或质量浓度为10%的NaCl（食盐）溶液均能获得较高的基因组DNA产物浓度、全部成功的四个基因扩增效率、单一的四个目的条带电泳图和全部成功且可靠的测序结果，以上结果并结合试剂成本、固定剂的安全性、挥发性、是否适用野外采样及保存条件等认为，采用食盐干粉固定动物组织为最适野外固定样品的方法。本发明除了能像酒精固定样品满足长期保存动物组织的目的和后续实验要求外，同时具有试剂廉价易得、试剂安全无挥发性且可用于长途运输尤其是空运的要求，优于现在采用的酒精固定的方法，尤其适用于野外动物样品的采集和固定保存。
        
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  河南师范大学
<120>  一种动物组织DNA的保存方法
<160>  8    
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
Tacgtgccta tgtccaaygc                          20
 
 
<210>  2
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
Tgcttgttca tgcagatgta ga                         22
 
 
<210>  3
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
Tctcaaccaa ccataaagac attgg                       25
 
 
<210>  4
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
Tatacttctg ggtgcccaaa gaatca                       26
 
 
<210>  5
<211>  28
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
Ctgagctgca gtcagtacca taagatgt                       28
 
 
<210>  6
<211>  29
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  6
Tgagcctcca tgaacttctg aagrtaytt                       29
 
 
<210>  7
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  7
Aaccaccgtt gtattcaact acaa                       24
 
 
<210>  8
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  8
Acctccgatc ttcggattac aagaccg                       27