一种改性羧甲基壳聚糖纳米凝胶的制备.pdf

本发明公开了一种改性羧甲基壳聚糖纳米凝胶的制备方法，属于载体与缓释材料技术领域。首先制备了甲基丙烯酰羧甲基壳聚糖，然后通过自由基聚合以N,N-双(丙烯酰)胱胺为交联剂，制备了改性羧甲基壳聚糖纳米凝胶。测定了不同pH值条件下纳米粒子的粒径及ζ电位，证明其具有pH敏感性。通过蛋白吸附实验证明纳米凝胶可防止蛋白吸附。利用所得到纳米凝胶成功负载了抗癌药物盐酸阿霉素，在以不同pH及不同谷胱甘肽浓度的PBS溶液为介质的体外释放实验中，证明了该载药纳米粒子具有较好的pH和还原敏感性。

权利要求书
1.  一种改性羧甲基壳聚糖纳米凝胶的制备方法，依次包括以下步骤：
1)将羧甲基壳聚糖溶液与甲基丙烯酸酐反应，制备了甲基丙烯酰羧甲基壳聚糖，并对其进行提纯；
2)将甲基丙烯酰羧甲基壳聚糖与N,N-双(丙烯酰)胱胺一起溶解于蒸馏水中，加热并氮气保护，加入引发剂，使得体系中的碳碳双键发生自由基聚合，得到改性羧甲基壳聚糖纳米凝胶；
3)将所制备的纳米凝胶以蒸馏水为介质进行透析，得到纯净的纳米凝胶溶液。

2.  根据权利要求1所述改性羧甲基壳聚糖纳米凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤1)采用的羧甲基壳聚糖的羧甲基化度为87.0％，粘均分子量为Mη＝6.3×105。

3.  根据权利要求1所述改性羧甲基壳聚糖纳米凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中羧甲基壳聚糖与甲基丙烯酸酐的质量比分别为1:0.5、1:1.0、1:1.5、1:2.0、1:2.5；羧甲基壳聚糖配成1w％水溶液，与甲基丙烯酸酐混合，机械搅拌，在0℃反应24h。

4.  根据权利要求1所述改性羧甲基壳聚糖纳米凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，甲基丙烯酰羧甲基壳聚糖与N,N-双(丙烯酰)胱胺的质量比为1:0.2～1:2。

5.  根据权利要求1所述改性羧甲基壳聚糖纳米凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤2)反应温度为40～90℃，加入的引发剂为过硫酸钾或过硫酸铵，引发剂用量为甲基丙烯酰羧甲基壳聚糖质量的2％～20％。

6.  根据权利要求1所述改性羧甲基壳聚糖纳米凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中，使用的透析袋截留分子量为8000～14000，透析时间不少于3天。

7.  一种改性羧甲基壳聚糖纳米凝胶，其特征是通过甲基丙烯酰羧甲基壳聚糖与N,N-双(丙烯酰)胱胺按照权利要求1所述方法制备的交联共聚物，此共聚物在水中形成纳米凝胶，其粒径随溶液的pH不同而变化，分布范围在220纳米到485纳米之间。

8.  一种改性羧甲基壳聚糖纳米凝胶的应用，其特征是将权利要求7所述改性羧甲基壳聚糖纳米凝胶与盐酸阿霉素溶液混合搅拌，纳米凝胶通过静电作用负载盐酸阿霉素，通过透析去除游离的阿霉素，在体外释放实验中，载药纳米凝胶显示较好的pH和还原敏感性。

说明书一种改性羧甲基壳聚糖纳米凝胶的制备
技术领域
本发属于载体与缓释材料技术领域，涉及一种改性羧甲基壳聚糖纳米凝胶的制备方法及其应用。
背景技术
羧甲基壳聚糖是壳聚糖的一种水溶性衍生物，是一种两性聚电解质。由于羧甲基壳聚糖具有良好的水溶性、生物相容性、可生物降解性、抗菌性及无细胞毒性等性能，已被广泛地应用于生物医学领域，如创伤修复、组织工程、药物输送、基因治疗、生物成像等。作为药物载体，羧甲基壳聚糖纳米粒子可以提高药物的稳定性，延长药物的有效作用时间，能够增强药物对生物膜的透过性，消除生物屏障。通过控制羧甲基壳聚糖的分子量、取代度以及对载体进行修饰等方法制备环境敏感性羧甲基壳聚糖纳米粒子，对药物进行控制释放和靶向给药，可以在保证药物作用的前提下减少给药量，减小药物对人体产生的副作用。
癌症是人类健康的主要杀手之一。作为临床上治疗肿瘤的主要手段，化学疗法由于抗癌药物存在缺乏选择性、稳定性差、体内半衰期短和多药耐药性等缺点，不仅对癌症治疗效果有限，还会对正常组织和细胞产生毒副作用。为了克服癌症治疗药物的这些缺点，制备具有良好的生物相容性、能够智能控制药物释放的抗癌药物载体已成为当前的研究热点。本发明以含碳碳双键和二硫键的小分子为交联剂，通过自由基共聚的方法制备共价交联的羧甲基壳聚糖纳米凝胶，避免了使用戊二醛等有毒交联剂，同时所得纳米凝胶具有pH和还原双重敏感性，纳米凝胶在体内循环时可保持粒子的稳定性，一旦与肿瘤细胞接触，纳米凝胶将与肿瘤细胞内的谷胱甘肽作用，二硫键断裂促使交联结构破坏，增加药物在肿瘤细胞内的靶向释放。
发明内容
本发明的目的是利用羧甲基壳聚糖为主要原料，将其改性后通过自由基聚合的方法制备改性羧甲基壳聚糖纳米凝胶，所得纳米凝胶具有pH和还原双重敏感性。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下:
(1)利用甲基丙烯酸酐对羧甲基壳聚糖进行改性，制备了甲基丙烯酰羧甲基壳聚糖，并对其进行提纯。
(2)将甲基丙烯酰羧甲基壳聚糖与N,N-双(丙烯酰)胱胺一起溶解于蒸馏水中，加热并氮气保护，加入引发剂，使得体系中的碳碳双键发生自由基聚合，得到纳米凝胶。
(3)将所制备的纳米凝胶以蒸馏水为透析介质进行透析，得到纯净的纳米凝胶溶液。
(4)将纳米凝胶用于抗癌药物盐酸阿霉素的控制释放，证明了药物载体具有pH和还原敏感性。
本发明的有益效果：
(1)本发明通过N,N-双(丙烯酰)胱胺与甲基丙烯酰羧甲基壳聚糖进行自由基共聚合反应，在形成纳米凝胶的同时，结构中引入了二硫键，使得纳米凝胶具有还原敏感性。
(2)由于羧甲基壳聚糖分子中含有大量的羧基及部分氨基，因此所制备的纳米凝胶具有pH敏感性。
(3)由于羧甲基壳聚糖分子中含有大量的羧基，因此本发明所制备的纳米凝胶表面在一定的pH条件下带有负电荷，可防止蛋白吸附，延长粒子在体内的循环。
(4)本发明所制备纳米凝胶的过程简单，不使用有机溶液，因此绿色环保。
(5)本发明所制备的纳米凝胶可通过所含有的羧基与盐酸阿霉素氨基间的静电作用进行药物负载。
附图说明
图1纳米凝胶的制备过程示意图
图2纳米凝胶的扫描电镜照片图
图3纳米凝胶在谷胱甘肽(GSH)水溶液中(10mM)孵育不同时间后的粒径分布，温度37℃
图4纳米凝胶MCB5在不同pH磷酸盐缓冲溶液中的释放曲线
图5载药纳米凝胶MCB5在不同谷胱甘肽浓度的磷酸盐缓冲溶液中的释放曲线(pH＝7.4)
图6在不同浓度空白纳米凝胶MCB5的作用下，3T3细胞和Hela细胞的存活率
具体实施方式：
实施例1：
甲基丙烯酰羧甲基壳聚糖的制备
将1g羧甲基壳聚糖溶于100mL蒸馏水，在冰水浴条件下搅拌30min后逐滴缓慢加入一定量的甲基丙烯酸酐，保持冰水浴条件机械搅拌24h，甲基丙烯酰羧甲基壳聚糖的合成配方如表1所示。将反应后的产物用乙醇进行沉淀，过滤后沉淀用乙醇洗涤三次，30℃条件下真空干燥至恒重后放入-20℃冰箱保存。改变原料重量配比可得到5个甲基丙烯酰羧甲基壳聚糖样品，见表1。
表1甲基丙烯酰羧甲基壳聚糖的合成配方

实施例2：
纳米凝胶的制备
在100mL三口烧瓶中加入80mg甲基丙烯酰羧甲基壳聚糖及40mL蒸馏水，磁力搅拌，待其完全溶解后向烧瓶中加入40mg N,N-双(丙烯酰)胱胺，将烧瓶移入80℃油浴锅，并向烧瓶中通入氮气，加热5min后向烧瓶中加入1mL浓度为8mg/mL的过硫酸钾水溶液，80℃继续反应1h。整个反应过程均在磁力搅拌和氮气保护的条件下进行。将反应后的纳米凝胶溶液装入透析袋(截留分子量MWCO＝8000～14000)以蒸馏水为透析介质透析5天，每隔8h换一次透析介质，得到纯净的纳米凝胶溶液。采用N,N-双(丙烯酰)胱胺分别与CB1、CB2、CB3、CB4、CB5反应，所制备的纳米凝胶分别命名为MCB1、MCB2、MCB3、MCB4、MCB5，纳米凝胶的扫描电镜照片如图2所示。
实施例3：
纳米凝胶的pH敏感性分析
用0.1M NaOH溶液和0.1M HCl溶液调节纳米凝胶溶液pH分别为4.5、5.8、7.4、8.0，待溶液pH稳定后，采用ζ电位及纳米粒度分析仪测定各pH值下纳米凝胶的ζ电位及其粒径。结果如表2、表3所示。可以看出，随着pH值由8.0减小到4.5，纳米凝胶的ζ电位呈现减小的趋势。这主要是由于随着pH值减小，一方面粒子表面-COO-逐渐转变为-COOH，另一方面-NH2转变为带正电荷的-NH3+与-COO-产生静电作用，使得负电荷中和，这两方面原因导致纳米凝胶表面所带的-COO-的量减小，表面电荷值降低。随着pH值由8.0减小到4.5，纳米凝胶的粒径总体呈现减小的趋势，其主要原因有两点：一方面，随着pH值的减小，纳米凝胶中-COO-逐渐转变为-COOH，凝胶内部羧酸根之间的静电排斥作用减小，而羧基间还会产生氢键作用。 另一方面，随着pH值的减小纳米凝胶中未质子化的-NH3转变为带正电荷的-NH3+，与-COO-产生静电作用。这两种原因共同导致了纳米凝胶内部的分子链间的作用力增强，凝胶的粒径收缩。
表2纳米凝胶在不同pH值下的ζ电位
纳米凝胶名称pH4.5pH5.8pH7.4pH8.0MCB1-10.3±1.9-13.8±0.9-20.9±1.7-25.8±2.3MCB2-10.1±0.8-16.3±1.5-22.7±1.4-25.5±1.3MCB3-13.7±1.3-16.5±2.3-18.0±2.8-23.6±1.4MCB4-12.0±1.3-15.1±1.0-23.2±2.2-25.9±3.1MCB5-13.5±2.4-14.9±1.6-21.7±0.9-23.4±2.5
表3纳米凝胶在不同pH值下的粒径
纳米凝胶名称pH4.5pH5.8pH7.4pH8.0MCB1293330446485MCB2287326423461MCB3224306392453MCB4220289331360MCB5205231249300
实施例4：
纳米凝胶的抗蛋白吸附分析
取1mg/mL的纳米凝胶溶液(pH 7.4)，精密称取一定量的牛血清蛋白加入其中，使牛血清蛋白的浓度为0.5mg/mL，混合均匀后置于37℃恒温水浴振荡器中分别孵育24h后取出，12000r/min离心30min，取上层清液，测定279nm处吸光度，根据牛血清蛋白溶液的标准曲线计算纳米凝胶对牛血清蛋白的吸附量。结果如表4。在24h内，纳米凝胶对牛血清蛋白的吸附量很小。由表2知道，当pH为7.4时，纳米凝胶的ζ电位为-20mV左右，此时纳米凝胶表面大量的羧基以羧酸根的形式存在，使得其表面带有负电荷。人体内大部分蛋白质的等电点pI<6，因此在正常人体生理环境蛋白质带负电荷(当pH<pI时，蛋白质带正电荷；pH＝pI时，蛋白质显电中性，不带电荷；pH>pI时，蛋白质带负电荷)。牛血清蛋白的等电点pI＝4.7，因此，在pH为7.4时，牛血清蛋白带有负电荷，与纳米凝胶存在着静电排斥作用，使得纳米凝胶不易吸附牛血清蛋白。纳米凝胶的这种抗蛋白吸附的能力可以使得其在血液中具有一定 的“隐身”性能，避免被网状内皮系统清除，延长纳米凝胶在血液中的循环时间。
表4纳米凝胶对牛血清蛋白在24小时内的吸附(％)

实施例5：
纳米凝胶的还原敏感性分析
选取纳米凝胶MCB5为研究对象，向1mg/mL纳米凝胶溶液中加入GSH，使GSH的浓度为10mM，37℃孵育，利用纳米粒度仪分别测定孵育0、5、12、24h时的粒径及其分布，结果如图3所示，随着还原性环境中孵育时间的延长，纳米凝胶的粒径变大，分布宽度变宽，这是由于GSH使得纳米凝胶中的二硫键断裂，纳米凝胶内部交联结构遭到破坏，粒子的溶胀性增加。
实施例6：
纳米凝胶用于负载阿霉素及其体外释放
选取纳米凝胶MCB5为研究对象，取50mL pH＝8的1mg/mL的纳米凝胶溶液，加入10mg盐酸阿霉素，避光磁力搅拌5h后装入透析袋，在蒸馏水中透析24h，每隔8h换一次透析液，除去游离的盐酸阿霉素，即可得到载药纳米凝胶溶液，根据盐酸阿霉素的标准曲线可以计算出纳米凝胶的载药率和包封率分别为18.17％和90.86％。
取5mL载药纳米凝胶溶液，分别考察了其在不同pH(pH分别为5.8、7.4、8.0的PBS溶液)以及不同还原性环境(GSH浓度分别为0、10、20mM pH＝7.4的PBS溶液)下的体外释放(37℃，恒温振荡)，初始释放介质的体积均为50mL。每隔一段时间取3mL释放介质在紫外分光光度计上测定波长在485nm处的吸光度，通过标准曲线计算盐酸阿霉素的浓度，同时每次补充等量新鲜释放介质以维持其总体积不变。从不同pH环境下的释放曲线(如图4所示)可以看出pH值越小，纳米凝胶对阿霉素的释放速率越快，累积释放率也越大。在释放24h后，pH 5.8条件下的累积释放率达到83.2％，而pH 8.0条件下仅为57.0％。这是由于纳米凝胶及阿霉素的结构会受到pH的影响。pH 5.8时，阿霉素的氨基完全质子化，而纳米凝胶中羧酸根也会出现部分质子化转变为羧基，导致纳米凝胶与阿霉素间的静电作用减小，使所负载的阿霉素更容易释放出来。随着pH值的升高，纳米凝胶中的羧酸根含量增加，凝 胶与阿霉素间的静电作用增加，使得阿霉素的释放速率减慢，累积释放率减小。不同还原性环境的释放曲线如图5所示可以发现释放介质未加GSH的最终累积释放率为58.0％，而释放介质中GSH浓度分别为10mM和20mM的最终累计释放率分别为66.0％和83.6％，说明还原性环境可明显加快药物的释放，提高药物的累积释放率。这主要是由于GSH能够使纳米凝胶中的S-S键断裂，破坏纳米凝胶的结构，凝胶内部的药物分子可快速释放到介质中
实施例7：
纳米凝胶细胞毒性测试
采用MTT法对空白纳米凝胶的细胞毒性进行评估，用于细胞毒性测试的细胞为3T3细胞和Hela细胞，具体操作步骤如下：
取对数期生长的3T3细胞或Hela细胞，经胰酶消化后，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(RPMI-1640完全培养基)稀释成浓度为6×104个/mL的细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔接种100μL，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h后弃去培养基。阴性对照组、阳性对照组和实验组每孔分别加入100μL RPMI-1640完全培养基、含0.64％苯酚的RPMI-1640完全培养基、含不同浓度纳米凝胶MC5B的RPMI-1640完全培养基(纳米凝胶的浓度分别为10、20、50、100、200μg/mL)，每组设4个复孔，继续置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h后，每孔加入20μL MTT溶液，继续培养4h后，弃去培养板中的溶液，每孔加入150μL DMSO，摇匀，用酶标仪于570nm处测定OD值，并计算细胞存活率.
结果如图6所示，虽然纳米凝胶的浓度对细胞的存活率有一定的影响，但即使纳米凝胶浓度达到了200μg/mL，两种细胞的存活率也仍达到85％以上，说明所制备的纳米凝胶无细胞毒性。
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。