调节心血管及呼吸功能的生物活性制剂 所属技术领域
本发明涉及一种调节心血管及呼吸功能的生物活性制剂的制备方法，更具体地说，本发明涉及一种通过免疫接种有效剂量的特殊疫苗至妊娠母牛，诱发其进入高免疫状态，从免疫乳牛的牛奶中制备对抗心血管及呼吸系统紊乱的制剂。
发明技术背景
人类心血管系统疾病主要是动脉粥样硬化及由于年龄增长而引起的血管壁弹性降低及老化，动脉粥样硬化是全球最普遍的疾病之一，也是引起死亡的最常见和最主要的原因，其发生原因是由于脂质在血管壁局部沉积，血小板聚集形成粥样硬化斑，侵犯血管肌层，引起血管弹性降低，血管壁变脆和血管硬化。
某些具有易患因素的高危人群，更容易发展为动脉粥样硬化，这些危险因素包括，高血压、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、肥胖、吸烟、糖尿病等。尽管目前认为通过减肥、控制脂肪饮食、戒烟、增加运动，维持血压、血脂在正常范围可能有助于减少动脉硬化的发生、发展，但效果并不十分明显，医学界正在寻找更有效的方法或联合应用多种方法以达到更理想效果。
吸烟损害肺功能已经是众所周知的常识，吸烟也会同时加快和加重动脉硬化的发生、发展，影响肺部组织结构的正常。
某些动物实验和临床研究证实，处于高免疫状态下母牛分泌地牛奶中含有能明显改善心血管功能和呼吸系统功能、延缓和抑制动脉粥样硬化发生、减少吸烟对肺部组织结构和功能伤害的有效的生物活性成分。
目前研究证明，经过特异性免疫母牛的牛奶中含有多种治疗成份，美国专利(4324782)介绍的技术中，公开了通过制备抗变异链球菌抗体治疗龋齿的方法，但没有提及用于改善心血管和呼吸系统功能制剂的制备方法。
中国专利(申请号96199507)介绍的技术中，公开了采用中耳炎病原菌免疫母牛制备抗中耳炎病原菌特异性免疫球旦白的方法，也未提及改善心血管和呼吸功能有效成份的方法。
本发明所要解决的技术问题是，提供一种制备改善心血管和呼吸功能制剂的方法及应用，与现有技术相比，其来源是纯天然成份，长期服用无毒付作用
【发明内容】
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是，选择特殊的抗原，制备高浓度疫苗，免疫接种妊娠母牛，以激发被接种母牛的高免疫敏感性，通过血清检测而确定被接种母牛的高敏感免疫状态，通过反复追加注射疫苗而维持其高免疫状态，测试其分泌牛奶中改善心血管和呼吸功能的有效成份，从处于高免疫状态的母牛分泌的牛奶中制备改善心血管和呼吸功能的制剂，应用该制剂帮助患者改善其心血管和呼吸功能。
本发明的技术特征是，本发明所选择的抗原，可以是任何单个抗原，也可以是联合应用的多价抗原，抗原的类型可以是细菌、病毒、孢子体或任何能引发母牛免疫系统反应的物质，采用任何形式或类型的抗原，最终均需诱发母牛处于高敏感的免疫状态，最适宜的抗原形式是多价抗原，细菌可以作为抗原的首要选择。
本发明的技术特征是，免疫接种的方式可以是肌肉内注射、静脉内注射、会阴部注射、口服或灌肠，最佳选择为肌肉内注射，同时，提供的剂量必须是以引起有效的免疫反应，并诱导被接种母牛至高敏感免疫状态，剂量范围通常是1.times.10sup.6cells到1times.10sup.20cells优选1.times.10.sup.8cells到1.times.10.sup.10cells最优选为1.times.10.sup.8cells。
本明的技术特征是，在免疫接种足够剂量的疫苗后，必须检测被接种母牛是否对抗原变得敏感，可以采用多种已知的测试方法测定免疫敏感性，包括但不限于皮肤敏感试验、血清免疫测试来测定抗体的存在，用测试方法评价宿主免疫细胞对抗原的反应能力，最佳测试方法是比较在免疫接种前后血清中抗体对多价细菌抗原的粘集反应。
本发明的技术特征是，在成功诱导进入高敏感免疫状态后，应该采用追加免疫接种疫苗的方法，保持被接种母牛的高度敏感免疫状态，追加免疫接种，应该在固定限期内重复，最好是每间隔两周后重复进行免疫接种注射，尤其当采用多价细菌抗原作为疫苗时，间隔两周追加免疫接种注射是最好的选择。与此同时，必须经常检验血清中抗体含量，以及时发现重复追加注射引起的免疫耐受，一旦出现免疫耐受现象，即停止使用该乳牛分泌的牛奶作为源料，在追加免疫接种注射过程中，最好采用不同的接种途径，如果首次接种采用肌肉注射途径，在追加注射时最好采用静脉注射。
本发明的技术特征是，收集接种乳牛的牛奶，测试其中改善心血管和呼吸功能有效成份，可以采用对照组的方式来进行评估，兔子可以用作试验的对象，一组兔子喂养含有改善心血管和呼吸功能有效成份的牛奶作为试验组，另一组用普通牛奶作为对照组，在预定时间后，处死试验组及对照组的兔子，采用下列方法检验兔子的心血管系统和呼吸系统结构，包括采用电子扫描显微镜等技术和设备，观察心血管、肺小支气管内皮组织损害，脂肪组织堆积、纤维化，以及肺组织内白细胞和淋巴细胞浸润等病理变化。
本发明的技术特征是，被接种乳牛的牛奶收集，可以采用传统方法，但必须注意保护牛奶中改善心血管和呼吸功能的有效成份不受破坏，由于这些有效成份都是属于热敏感物质，低温的巴氏消毒法被优选，巴氏消毒法温度应该低于160°F，采用真空冷冻干燥制备粉状物，也是一种良好的选择，可以更好的保护其有效成份不被高温破坏，也可以采用其他方法来获得更高纯度有效成份，在这种方法中通过酸化脱脂牛奶至PH4.7～4.8，在30℃～50℃加热20～50分钟，酪旦白凝结后，采用离心或滤布过滤方式除去酪旦白，最后用超微滤膜浓缩，通过喷雾干燥或真空冷冻干燥制备干粉，选用何种方法取决于对制剂纯度的需求，上述两种方法制备的制剂中都含有改善心血管和呼吸功能的有效成份，后一种方法制备的制剂纯度更高，含量更丰富。
本发明的技术特征是，本发明方法制备的改善心血管和呼吸系统功能的制剂可以单独应用，也可以与其他有效成份联合应用，其应用的方式，可以直接服用免疫乳牛的牛奶，或用水冲服免疫乳牛的奶粉，也可以将上述方法制备的粉状物质添加到其他辅料或其他食物成份中，制备成其他制剂或食品，这些制剂包括片剂、胶囊、粉剂、口服液、散剂、含片等，这些食品包括各种颗粒型冲剂，饮料、酸奶、无糖冰琪淋及其他食品，但在制备上述任何产品的过程中，温度均不能超过160°F。
本发明的技术特征是，本发明方法制备的改善心血管和呼吸系统功能的制剂，服用的剂量从10mg～200g/天，取决于疾病的类型和患者的需求，一般服用时间至少应持续15天～30天，持续时间越持久，效果越显著，每天小剂量分次服用的效果较一次大剂量服用效果更佳。
本发明的技术特征是，本发明方法制备的制剂，能应用于预防和治疗动脉粥样硬化，因年龄增长引起的血管退化和弹性降低，防止血脂及血小板在血管壁沉积，减少血管壁纤维化，降低血液中胆固醇含量和甘油三酯含量，保护吸烟对肺组织的伤害，减少白细胞和淋巴细胞在肺组织中浸润，明显改善心血管和呼吸系统制紊乱。
本发明的有益效果是，与现有技术相比，能够通过免疫接种孕牛和从牛奶中制备改善心血管和呼吸功能的生物活性制剂，从而帮助老年或肥胖患者预防和治疗动脉硬化粥样及减轻吸烟对肺组织的损害，产品无毒、无害，无任何付作用，可以长期服用。
具体实施方案
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
免疫接种及抗体滴度检测
选用大肠杆菌(Escherichia Coli，American Type Culture StrainNo.13076)，用标准细菌培养基在37℃温度下培养48小时，60℃持续2小时以灭活细菌，离心收集细菌，用双蒸馏水冲洗五次，用生理盐水稀释成最终浓度为1times.10.sup.8cells/ml，选择健康母牛，在臀部肌肉注射5ml，然后每周注射一次，连续注射四周，共注射5次，在第五周未，收集接种乳牛牛奶，采用抗体凝集反应测试来测定抗大肠杆菌抗体，并以未免疫注射前的乳牛的牛奶作为对照，表1显示测定结果。
表1：免疫接种前后牛奶抗大肠杆菌滴度对比
免疫接种前 免疫接种后
0 5000
表1结果显示，在免疫接种后母牛体内抗大肠杆菌抗体滴度显著升高，证明免疫接种诱发了高敏感免疫状态。
实例2
制备复合细菌疫苗
从美国菌种培养中心(American Type Culture Collection)获得下列菌种：金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus，ATCC#.11631)、表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis.155)、酿脓葡萄球菌1型(streptococcus pyogenes.Typel.8671)、3型(Type3.10389)、5型(type5.12347)、8型(Type8.12349)、12型(type12.11434)、14型(type14.12972)、18型(type18.12357)、22型(type22.10404)、产气杆菌(Aerobacteraerogenes.884)、大肠杆菌(Escherichia Coli.26)、肠炎(沙门)杆菌(Salmonellaenteritidis13076)、绿浓杆菌(Pseudomonas aeruginosa 7700)、肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae.9590)、鼠伤寒(沙门)杆菌(Salmonella typhimurium.13311)、出血杆菌(Haemophilus typhimurium.9333)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris 13315)、志贺痢疾杆菌(Shigella dysenteriae.13313)、肺炎双球菌(Diplococcus pneumoniae.6303)、变异链球菌(Strep.sanguinis 10556)、小链球菌(Strep.Mitis.6249)、出血链球菌(Strep.Sanguis.10556)、唾液链球菌(Strep.Salivarius.13419)、缺乳链球菌(Strep.Agalactiae.13813)。每种细菌接种按照规定采用合适的培养液，在37℃恒温下培养48小时，观察培养是否正常，如果细菌在培养基中生长良好，用离心机分离培养液，细菌用无菌生理盐水冲洗五次，用60℃温度灭活2小时，杀死所有细菌，从已灭活的细菌中采集样品继续在培养基中培养(37℃下培养2小时)，确认无细菌存活，收集的细菌冷冻干燥成为细菌粉，上述每种粉称取1g，用500ml生理盐水混悬，并反复稀释，直至配制成浓度为2.times.10.sup.8bacterial cells/ml的溶液，(在660nm上显示1.0光密度单位)。
实施例3
制备调节心血管和呼吸系统功能制剂
取实施例1免疫乳牛分娩后10小时内的冰冻牛初乳13升，在5℃～10℃下化冻，用离心机以3000转/分速度离心20分钟脱脂，用700ml 1N HCL酸化初乳，调节PH至4.8，于40℃温度加热30分钟，于4℃静置贮存过夜，用泵抽上清液通过尼龙布过滤器进入贮存容器，滤除酪旦白，用0.9％氯化钠溶液稀释至26升。用稀释上清液通过中空纤维柱过滤，中空纤维柱孔径为0.4μm，表面积为3m2，纤维直径1.2mm，用100升0.9％浓度的氯化钠溶液滤过，使用压力超过大气压0.2～0.6巴，在进行第一次粗滤同时，产生的滤液再通过由三个中空纤维柱组成的系统进行第二次粗滤，每个柱的分离极限为10,000D，表面积为14M2，在此系统中，第一次粗滤的滤液得到初步浓缩，然后用100升0.9％浓度的氯化钠溶液透析过滤，最后再浓缩到23升。所得到特异性免疫球旦白含量为6％，用已知方法过滤消毒，用冷冻干燥方法制备干粉。