说明书一种提高青蒿花蕾的重量和青蒿素含量的方法
技术领域
本发明涉及一种提高青蒿花蕾的重量和青蒿素含量的方法。即采取化学调控剂，让花蕾膨大增重，同时提高其青蒿素含量。
背景技术
青蒿(Artemisiae annie L.)，菊科，艾属。学名黄花蒿，别名臭蒿、香蒿、苦蒿。生长于山坡、林缘及荒地，为一年生草本。老百姓用于消暑、头痛、退热和感冒等的治疗.提取青蒿素则是利用青蒿地上部分叶片和未开放的花蕾，提取生产的有效生理活性成分如青蒿素等产品，是低毒、高效、速效的抗疟新药(中国药典,2005；钟国跃,等，2007)。影响青蒿青蒿素含量的因素有品种、土壤条件、播种时间、加工方法、收获时间、种植密度、光照条件、施肥水平以及青蒿植株的不同部位等。青蒿素合成和贮存的主要器官是花蕾，青蒿野生资源丰富，但青蒿素含量不高。不同地域的青蒿品种，花蕾中青蒿素含量的变化极显著，其中以重庆地区酉阳和秀山青蒿的花蕾青蒿素含量最佳。为了降低制药厂提取青蒿素的制药成本，除利用传统育种方法，近年来研究利用基因工程方法提高青蒿的青蒿素含量，培育高青蒿素含量的生物工程品种成为热点。
青蒿主要药用成分及作用青蒿素化学结构含有过氧基团，是一种倍半萜内酯，青蒿素的多种衍生物如双氢青蒿索(dihydroanemisin)、青蒿琥酯(anesunatc)、蒿甲醚(ancmether)、蒿乙醚(aneether)，均是治疗疟疾的有效药物.研究表明，二氢青蒿素对大鼠C6细胞有选择性细胞毒作用.还可诱导肺癌细胞系PC-14细胞和SPC-A-1细胞凋亡.青蒿琥酯对人大肠癌细胞有抑制作用，能抑制大肠癌细胞增殖和促进凋亡。蒿甲醚、蒿乙醚和青篙琥酯作用于肿瘤细胞后，表达的mRNA与其对肿瘤细胞的抑制作用之间存在相关性。结果显示青蒿素衍生物的药效作用方式与已知的抗癌药物不尽一致.随着对青蒿素类药物药理作用研究的不断深人，已证实其具有抗纤维化、抗弓形虫、抗疟、抗孕、抗血吸虫、肿瘤细胞毒性和抗心律失常等作用.虽然该类药物作用广泛，但其作用机制、特点和应用仍处于初级阶段，研究表明青蒿素可通过抑制肺组织局部炎性反应来减轻脓毒症大鼠的肺损伤。青蒿还含有挥发性成分，主要是挥发油包括篙酮、倍半褚醇、 异篙酮、丁香烯、石竹烯氧化物、按油精、旅烯、左旋樟脑、龙脑等成分.其中、篙酮、樟脑、丁香烯异篙酮、龙脑等含量较高.挥发油具有抗菌消炎、解热镇痛、止咳平喘等功效。
青蒿萜类化合物的合成主要通过MVA和DXP两个途径，即甲羟戊酸(mevalonate pathway，MVA)途径和1-脱氧木酮糖5-磷酸合酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase，DXS)或甲基赤藓醇4-磷酸(methylerythritol 4-phosphatepathway，MEP)DXP途径。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMGR)是MVA途径重要的限速酶，而1-脱氧木酮糖5-磷酸合酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase，DXS)是DXP途径的关键性酶。在3种直接前体物质法呢基二磷酸(farnesyl diphosphate,FPP),香叶基二磷酸(geranyl diphosphate，GPP)和香叶基香叶基二磷酸(geranyl geranyl diphosphate，GGPP)合成之后，即进入萜烯合成过程，几种萜烯合酶(terpene synthase，TPS)在此过程发挥着重要的作用。GPP在单萜烯合酶(monoteterpene synthase)作用下生成单萜烯(monoterpene，C10)，FPP在倍半萜烯合酶(sesquiterpene synthase，SPS)作用下生成倍半萜烯(sesquiterpene，C15)，GGPP在二萜烯合酶(diterpene synthase)作用下成二萜烯(diterpene，C20)。
青蒿素是治疗疟疾的最主要的有效的临床用药，此外,药理学的深入研究表明，青蒿素及其衍生物是一种广谱性的天然药物。研究表明,每年世界上有超过100万人死于疟疾。疟原虫耐药性,使得抗疟药物氯喹的药物效果受限,而青蒿素对疟疾具有低毒和速效的特点。目前青蒿素是公认有效的治疗疟疾首选药物,这使得提取青蒿素的原材料青蒿需求量非常大。青蒿工厂化育苗可以节约种植青蒿的成本，本发明的青蒿嫁接技术让青蒿工厂化育苗成为可能。野生青蒿花蕾是青蒿素含量最高的器官，也是药厂为了降低提取青蒿素的成本，最愿意采用的原材料部分。
然而现有技术中仅对青蒿植株叶片进行调控，忽略了花蕾作为青蒿素含量最多的器官。因此，应当研究对花蕾进行化学调控，使花蕾膨大增重同时提高其青蒿素含量。
发明内容
本发明的目的是解决青蒿花蕾化学调控的问题。
为实现本发明目的而采用的技术方案是这样的，一种提高青蒿花蕾的重量和青蒿素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)青蒿播种及管理
1.1)青蒿采种于10月份下旬在种子达成熟期，采种后，取出种子过筛，去除粗杂质，洗净，摊放在阴凉的通风处，晾至青蒿种子种皮发黑为止。
1.2)青蒿种子消毒和催芽
用50％多菌灵+1：1500倍液的雷多米尔+0.48％高锰酸钾41℃温水对播种前的砧木种子消毒，时间2个小时，然后清水洗净，纱布包裹在33℃恒温箱内催芽30小时。播种前夜用3％过磷酸钙加上2％(NH4)2SO4液浸种20个小时，阴干。并剔除有病毒颜色不正派发霉的空瘪籽。
1.3)青蒿播种苗圃
选择地形平坦、地势较高、排水良好的开阔地，l-3度的缓坡地最佳。既宜灌水又宜排水，土壤肥力和质地一般选土层深厚石砾少，结构疏松肥沃，透水性通气性均良好的轻壤土或者沙壤土或者壤质沙土，作为苗圃土壤中粉粒和黏粒含量介于18％-28％。土壤酸碱度PH6.4-7.6，即一般以中性、微酸性或微碱性的土壤最适宜。青蒿育苗床地应选择疏松的沙壤土地块，阳光充足，10-20℃斜坡地排水较好。锄地深挖翻耕15-22公分。挖小沟成厢宽50公分，根据地形做厢长，一般5米长，厢面要平，泼撒粪水。育苗圃床做好后，泼施农家肥(每亩15-18担)，不干不湿的时候，锄头钦细，整理平顺，喷雾器喷消毒药液消毒，拱膜覆盖。用蔬菜大棚保温，抵御倒春寒。
1.4)青蒿播种后管理
砧木种子出苗前温度≥18℃，同时不高于25℃，防止砧木幼苗徒长，出苗前不需要浇水，覆盖地膜保水保温，出苗后7天，去除地膜，适当浇水，见干见湿，而后0.5％的高锰酸钾溶液+1％多菌灵喷雾器喷消毒药液消毒，拱膜覆盖。用蔬菜大棚保温，抵御倒春寒。
2)大田种植
4月下旬-5月上旬幼苗长出2-3个枝丫的时候，选择健壮无病虫的幼苗移栽到大田，幼苗栽培适宜选择砂壤土，阳光充足，排水通畅。 幼苗大田种植地要求翻梨耙细碎，除杂草后，整理平顺，施肥要求腐熟土杂肥或者农家肥2200-2600kg及磷肥40-55kg,K肥5kg作底肥，盖土作垄。周围开沟，沟深18-22公分，沟宽32-45公分，利于排水排涝。
移栽前幼苗和大田均用1：1500倍液的雷多米尔+0.5％的高锰酸钾溶液+1％多菌灵消毒杀菌。幼苗苗高在15公分左右时候，幼苗苗移栽定植到大田，最好选阴雨天。幼苗苗大田种植密度为株行距0.8×0.8米，每亩850-950株。种植稀密可根据土壤肥沃程度调整，比较简单。幼苗病虫害防治：用甲基托布津等杀菌剂药液喷雾预防茎腐病、霜霉病、白粉病以及炭疽病，撒施乐斯本颗粒剂或喷施敌杀死药液防蚜虫和小地老虎，施用吡虫啉防治蚜虫。
①温度。移栽后用覆盖薄膜，移栽后7天内，白天温度要求控制在25-27℃，晚上22-25℃,最高温度不超过32℃，2天后温度18-25℃,一周后移栽苗温度管理与常规青蒿幼苗同。早晚各通风一次。②湿度。用覆盖薄膜保持水分，移栽后7天内湿度要求86％-95％，视叶片萎焉否，适量喷点水，并喷施50％多菌灵溶液，2天后去薄膜，一周后移栽苗湿度管理与常规青蒿幼苗同。③光照。要求充足，太阳太大的话，用遮阳网覆盖，5天后去除遮阳网覆盖，一周后按照正常苗圃管理。④肥料。与常规青蒿苗圃管理同。
在青蒿的结蕾期喷施混合溶液。所述混合溶液中各个组分的浓度为：亚硫酸锌10g/L，酪氨酸5g/L，法尼基二磷酸5g/L，甲羟戊酸5g/L，二乙基二硫代氨基甲酸钠5g/L，二甲基亚砜2g/L，6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)200mmol/L，赤霉素20毫克每升，β－吲哚乙酸500mg/L，Vc(维生素c)5mg/L，乙烯利300毫克/升，矮壮素(2-氯乙基三甲基氯化铵)20毫克/升。
一种提高青蒿花蕾的重量和青蒿素含量的方法，配制混合溶液，所述混合溶液中各个组分的浓度为：亚硫酸锌10g/L，酪氨酸5g/L，法尼基二磷酸5g/L，甲羟戊酸5g/L，二乙基二硫代氨基甲酸钠5g/L，二甲基亚砜2g/L，6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)200mmol/L，赤霉素20毫克每升，β－吲哚乙酸500mg/L，Vc 5mg/L，乙烯利300毫克/升，矮壮素20毫克/升。在青蒿的结蕾期喷施上述混合溶液。
一种提高青蒿花蕾的重量和青蒿素含量的方法，配制A液和B液。 所述A液中，各个成分浓度为：亚硫酸锌10g/L，酪氨酸5g/L，法尼基二磷酸5g/L，甲羟戊酸5g/L，二乙基二硫代氨基甲酸钠5g/L，二甲基亚砜2g/L。所述B液中，各个成分浓度为：6-BA浓度200mmol/L，赤霉素20毫克每升，β－吲哚乙酸1000mg/L，Vc 5mg/L，乙烯利300毫克/升，矮壮素25毫克/升，二甲基亚砜2g/L。在青蒿的结蕾期先后喷施上述A液和B液。
一种提高青蒿花蕾的重量和青蒿素含量的方法，配制A液和B液。所述A液中，各个成分浓度为：亚硫酸锌10g/L，酪氨酸5g/L，赤霉素20毫克每升，β－吲哚乙酸100mg/L，二甲基亚砜2g/L。所述B液中，各个成分浓度为：6-BA浓度200mmol/L，Vc 5mg/L，乙烯利500毫克/升，矮壮素20毫克/升，法尼基二磷酸5g/L，甲羟戊酸5g/L，二乙基二硫代氨基甲酸钠5g/L，二甲基亚砜2g/L。在青蒿的结蕾期先后喷施上述A液和B液。
本发明的技术效果是毋庸置疑的。该化学调控方法解决青蒿植株青蒿素含量低的瓶颈问题，通过以下的三个实施例进一步说明。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不应该理解为本发明上述主题范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的保护范围内。
值得说明的是，以下三个实施例的测定青蒿素含量的方法是：
青蒿素含量测定采用仪器“普析通用”高效液相色谱仪(P680A四元低压梯度泵,PDA2100二极管阵列检测器,TCC2100柱温箱,Chromeleon色谱工作站)。色谱条件：本实验采用的是色谱柱:Dikma Kromasil C18column(10μm,200mm×4.5mm),流动相:甲醇0.01mol/L醋酸钠/醋酸缓冲液(pH＝6.0)(65∶35∶1),流速:0.8ml/min,检测波长:250nm,柱温:32℃。
对照(种植方法与喷施药物的青蒿一样)和测试样本(按照实施例方法种植的青蒿的花蕾)溶液的制备：置索氏提取器中,加石油醚(30～60℃)35ml,回流提取5h,取提取液,水浴蒸干,残渣用无水乙醇溶解并定容至10ml量瓶中摇匀,取1mL置10ml量瓶中,加入0.2％ 氢氧化钠溶液4ml,摇匀。用0.08mol/L醋酸缓冲溶液稀释后待测。
标准曲线的制作
将上述对照(标准青蒿溶液)在对应的HPLC色谱条件下分别进样1μL,3μL,5μL,7μL,9μL,11μL记录下图谱及色谱参数,分别以峰面积(Y)对标准品含量(X,μg)拟合回归曲线。研究发现,本发明中青篙素在5-25μg范围内的线性曲线回归方程为:Y＝1.311e+OOOX+5.01e+000,R＝0.98853446。称重用电子天平。
4青蒿花蕾化学调控(分为3个实施例)
另外，青蒿栽培的方法可以参考如下方法：
1青蒿播种及管理
1.1青蒿采种于10月份下旬在种子达成熟期，采种后，取出种子过筛，去除粗杂质，洗净，摊放在阴凉的通风处，晾至青蒿种子种皮发黑为止。
1.2青蒿种子消毒和催芽
用50％多菌灵+1：1500倍液的雷多米尔+0.48％高锰酸钾41℃温水对播种前的砧木种子消毒，时间2个小时，然后清水洗净，纱布包裹在33℃恒温箱内催芽30小时。播种前夜用3％过磷酸钙加上2％(NH4)2SO4液浸种20个小时，阴干。并剔除有病毒颜色不正派发霉的空瘪籽。
1.3青蒿播种苗圃
选择地形平坦、地势较高、排水良好的开阔地，l-3度的缓坡地最佳。既宜灌水又宜排水，土壤肥力和质地一般选土层深厚石砾少，结构疏松肥沃，透水性通气性均良好的轻壤土或者沙壤土或者壤质沙土，作为苗圃土壤中粉粒和黏粒含量介于18％-28％。土壤酸碱度PH6.4-7.6，即一般以中性、微酸性或微碱性的土壤最适宜。青蒿育苗床地应选择疏松的沙壤土地块，阳光充足，10-20℃斜坡地排水较好。锄地深挖翻耕15-22公分。挖小沟成厢宽50公分，根据地形做厢长，一般5米长，厢面要平，泼撒粪水。育苗圃床做好后，泼施农家肥(每亩15-18担)，不干不湿的时候，锄头钦细，整理平顺，喷雾器喷消毒药液消毒，拱膜覆盖。用蔬菜大棚保温，抵御倒春寒。
1.4青蒿播种后管理
砧木种子出苗前温度≥18℃，同时不高于25℃，防止砧木幼苗徒长，出苗前不需要浇水，覆盖地膜保水保温，出苗后7天，去除地膜，适当浇水，见干见湿，而后0.5％的高锰酸钾溶液+1％多菌灵喷雾器喷消毒药液消毒，拱膜覆盖。用蔬菜大棚保温，抵御倒春寒。
2大田种植
4月下旬-5月上旬幼苗长出2-3个枝丫的时候，选择健壮无病虫的幼苗移栽到大田，幼苗栽培适宜选择砂壤土，阳光充足，排水通畅。幼苗大田种植地要求翻梨耙细碎，除杂草后，整理平顺，施肥要求腐熟土杂肥或者农家肥2200-2600kg及磷肥40-55kg,K肥5kg作底肥，盖土作垄。周围开沟，沟深18-22公分，沟宽32-45公分，利于排水排涝。
移栽前幼苗和大田均用1：1500倍液的雷多米尔+0.5％的高锰酸钾溶液+1％多菌灵消毒杀菌。幼苗苗高在15公分左右时候，幼苗苗移栽定植到大田，最好选阴雨天。幼苗苗大田种植密度为株行距0.8×0.8米，每亩850-950株。种植稀密可根据土壤肥沃程度调整，比较简单。幼苗病虫害防治：用甲基托布津等杀菌剂药液喷雾预防茎腐病、霜霉病、白粉病以及炭疽病，撒施乐斯本颗粒剂或喷施敌杀死药液防蚜虫和小地老虎，施用吡虫啉防治蚜虫。
①温度。移栽后用覆盖薄膜，移栽后7天内，白天温度要求控制在25-27℃，晚上22-25℃,最高温度不超过32℃，2天后温度18-25℃,一周后移栽苗温度管理与常规青蒿幼苗同。早晚各通风一次。②湿度。用覆盖薄膜保持水分，移栽后7天内湿度要求86％-95％，视叶片萎焉否，适量喷点水，并喷施50％多菌灵溶液，2天后去薄膜，一周后移栽苗湿度管理与常规青蒿幼苗同。③光照。要求充足，太阳太大的话，用遮阳网覆盖，5天后去除遮阳网覆盖，一周后按照正常苗圃管理。④肥料。与常规青蒿苗圃管理同。
3测定青蒿素含量(上述方法)
实施例1：
药物配方如下：
亚硫酸锌10g/L，酪氨酸5g/L，法尼基二磷酸5g/L，甲羟戊酸5g/L，二乙基二硫代氨基甲酸钠5g/L，二甲基亚砜2g/L，6-BA 浓度200mmol/L，赤霉素20毫克每升，β－吲哚乙酸500mg/L，Vc 5mg/L，乙烯利300毫克/升，矮壮素20毫克/升。以28℃清水混匀喷施。
采用对照方式(不喷施药物，其他条件与实施例前文的方式相同)或实施例前文提到的方式栽培青蒿。喷施时间：青蒿有约1％的花蕾结蕾时(即开花前1周)喷施，要将青蒿植株所有茎秆叶片淋透。选择晴天上午10点半，青蒿植株上露水全部干完后喷施。喷施后，人不在青蒿大田里面来回穿梭。
花蕾有8成熟时，采摘青蒿花蕾测定青蒿素含量，烘干后称重。相同栽培条件下，未喷施药物的青蒿花蕾做对照，均重复3次测定。经测定，与对照相比，花蕾青蒿素含量增加20％-40％，花蕾重量增加30％-42％。
表1青蒿素含量％
表2每1kg青蒿的花蕾重量(单位g)
实施例2
药物配方如下：
第一次(A液)：亚硫酸锌10g/L，酪氨酸5g/L，法尼基二磷酸5g/L，甲羟戊酸5g/L，二乙基二硫代氨基甲酸钠5g/L，二甲基亚砜2g/L，第二次(B液)：6-BA浓度200mmol/L，赤霉素20毫克每升，β－吲哚乙酸1000mg/L，Vc 5mg/L，乙烯利300毫克/升，矮壮素25毫克/升，二甲基亚砜2g/L，以28℃清水混匀喷施。
喷施时间分2次，分别于8月20日和9月1日喷施。要将青蒿 植株所有茎秆叶片淋透。选择晴天上午10点半，青蒿植株上露水全部干完后喷施。喷施后，人不在青蒿大田里面来回穿梭。
花蕾有8成熟时，采摘青蒿花蕾测定青蒿素含量，烘干后称重，以未喷施药物的青蒿花蕾做对照，均重复3次测定。经测定，与对照相比，花蕾青蒿素含量增加32％-52％，花蕾重量增加38％-47％。对照方式中，不喷施药物，其他条件与实施例前文的方式相同。
表3青蒿素含量％
表4每1kg青蒿的花蕾重量(单位g)
实施例3
药物配方如下：
第一次(A液)：亚硫酸锌10g/L，酪氨酸5g/L，赤霉素20毫克每升，β－吲哚乙酸100mg/L，二甲基亚砜2g/L，
第二次(B液)：6-BA浓度200mmol/L，Vc 5mg/L，乙烯利500毫克/升，矮壮素20毫克/升，法尼基二磷酸5g/L，甲羟戊酸5g/L，二乙基二硫代氨基甲酸钠5g/L，二甲基亚砜2g/L，以28℃清水混匀喷施。
喷施时间分2次，分别于8月20日和9月1日喷施。要将青蒿植株所有茎秆叶片淋透。选择晴天上午10点半，青蒿植株上露水全部干完后喷施。喷施后，人不再青蒿大田里面来回穿梭。
花蕾有8成熟时，采摘青蒿花蕾测定青蒿素含量，烘干后称重，以未喷施药物的青蒿花蕾做对照，均重复3次。经测定，与对照相比，花蕾青蒿素含量增加38％-56％，花蕾重量增加42％-52％。对照方式中， 不喷施药物，其他条件与实施例前文的方式相同。
表5青蒿素含量％
表6每1kg青蒿的花蕾重量(单位g)
综上所述，本发明提供的化学调控青蒿花蕾的重量和青蒿素含量的方法，操作简单可靠，成本低，易被药农接受，经济效益显著。花蕾重量和青蒿素含量均有大幅度提高，推广前景广阔。