硬脂酰氨基酸化合物及其制备方法和应用.pdf

本发明公开了一种硬脂酰氨基酸化合物，该化合物具有抗氧化活性，其结构如下述通式（I）所示，其中，R1表示H或可以被一个或多个取代基取代的C1-6的直链或带有支链的烷基，所述取代基选自：羟基、氨基、巯基、羧基、芳基、酰胺基、烷硫基和具有1-2个氮原子的5或7元杂环基；R2表示H或C1-4的烷基；R3表示C11-25的饱和或不饱和脂肪烃基。本发明还公开了硬脂酰氨基酸化合物的制备方法和应用。本发明的硬脂酰氨基酸化合物，能有效对抗谷氨酸诱导的细胞氧化损伤，具有显著的抗氧化活性，可用于制备抗氧化药物，应用前景非常广阔。

权利要求书
1.  一种具有抗氧化活性的硬脂酰氨基酸化合物，该化合物结构如下述通式（I）所示：

其中，R1表示H或可以被一个或多个取代基取代的C1-6的直链或带有支链的烷基，所述 取代基选自：羟基、氨基、巯基、羧基、芳基、酰胺基、烷硫基和具有1-2个氮原子的5或7 元杂环基；
R2表示H或C1-4的烷基；
R3表示C11-25的饱和或不饱和脂肪烃基。

2.  根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述R1为可以被1-3个取代基取代的C1-4的直链或带有支链的烷基，所述取代基选自：羟基、氨基、巯基、羧基、芳基、酰胺基、烷 硫基和具有1-2个氮原子的5或7元杂环基；R2为H；R3为C17的饱和直链烷基。

3.  根据权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述化合物为下述结构式的N-硬脂酰酪 氨酸：


4.  权利要求1所述硬脂酰氨基酸化合物的制备方法，其特征在于，该方法包括将下式（Ⅳ） 化合物

在碱性条件下与下式（Ⅲ）化合物反应制得通式（I）化合物


5.  根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述式（Ⅳ）化合物是通过下式（Ⅱ） 化合物与偶合剂1-羟基苯并三唑反应制备


6.  根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述式（Ⅱ）化合物是将1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、硬脂酸、三乙胺，在催化剂4-二甲氨基吡啶的作用下反 应制备而成。

7.  根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述式（Ⅲ）化合物是通过氨基酸与 盐酸甲醇反应制备。

8.  一种药物组合物，其特征在于，该组合物包含安全有效量的权利要求1所述的化合物 和药学上可接受的载体。

9.  权利要求1所述的化合物在制备抗氧化药物中的应用。

说明书硬脂酰氨基酸化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的硬脂酰氨基酸化合物及其制 备方法和应用。
背景技术
N-硬脂酰氨基酸（N-stearoyl amino acids，NSAs）是硬脂酸的羧基与氨基酸的α-氨基结 合形成的酰胺类化合物。早在五、六十年代，就有文献报道了其合成方法。近年来，也有其 药理活性的研究报道，但目前尚无此类化合物用于抗氧化作用的研究报道。
（1）NSAs的合成方法
NSAs的合成一般先将硬脂酸制成硬脂酰氯，提高酰化反应的活性；氨基酸与盐酸-甲醇 反应得氨基酸甲酯，以保护羧基。然后硬脂酰氯与氨基酸甲酯在吡啶溶液中发生酰化反应， 生成N-硬脂酰氨基酸甲酯，再水解得NSAs（Zeelen,Havinga.Recl Trav Chim.1958,77, 267-271）。
（2）NSAs的药理活性研究
抗菌作用：此类化合物具有抗革兰氏阴性菌（金黄色葡萄球菌、黄体小球菌和蜡样芽孢 杆菌）、革兰氏阳性菌（大肠埃希杆菌和绿脓假单胞菌）的活性，其中N-硬脂酰脯氨酸的作 用最强，其他化合物的作用活性取决于氨基酸的结构，一般来说，芳香族NSA>酸性NSA>碱 性NSA（Sivasamy A,Krishnaveni M,Rao PG.J Am Oil Chim Soc.2001,78(9),897-902）。
抗病毒作用：此类化合物能作为流感病毒神经氨酸酶（NA）的非N-乙酰神经氨酸酯类抑 制剂，能有效抑制NA的活性，且呈剂量依赖性。在一系列NSAs衍生物中，N-羟基十四酰 -D-半胱氨酸和N-十四酰-O-乙酰-D-丝氨酸作用活性最强，其作用机制为非竞争性方式抑制酶 的活性。由于该类化合物不仅是病毒NA的选择性抑制剂，而且对其它各种病毒的酶均有效 （除了对霍乱Ⅴ型及人胎盘病毒的酶不敏感），因此，能作为抗流感病毒药物的先导化合物 （Kondoh,Mitsuyo,Furutani,et al.Biosci Biotechnol Biochem.1997,61(5),870-874）。
然而，在本发明之前，还没有出现本发明的化合物用于抗氧化作用的公开报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种硬脂酰氨基酸化合物，该硬脂酰氨基酸化合物具有 抗氧化活性，可用于预防或治疗因氧化毒性引起的损伤或疾病。
此外，还需要提供一种上述硬脂酰氨基酸化合物的制备方法及应用。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面，提供了一种具有抗氧化活性的硬脂酰氨基酸化合物，该化合物结 构如下述通式（I）所示：

其中，R1表示H或可以被一个或多个取代基取代的C1-6的直链或带有支链的烷基，所述取 代基选自：羟基、氨基、巯基、羧基、芳基、酰胺基、烷硫基和具有1-2个氮原子的5或7 元杂环基；R2表示H或C1-4的烷基；R3表示C11-25的饱和或不饱和脂肪烃基。
上述C1-6的烷基是指具有1～6个碳原子的直链或支链烷基。例如：甲基、乙基、丙基、异 丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、新戊基、己基。优选具有1～4个碳原子的直 链或支链烷基，更优选具有1～2个碳原子的直链烷基。
上述取代基中，羟基包括醇羟基和酚羟基；具有1-2个氮原子的5或7元杂环基可选自咪唑 基、四氢吡咯基和吲哚基。
上述C11-25的脂肪烃基是指具有11～25个碳原子的饱和或不饱和脂肪烃基，其中，饱和脂 肪烃基是指直链或带有支链的烷基、环烷基，如十二烷基、十八烷基、环十二烷基、环十八 烷基等，而不饱和脂肪烃基是指链烯基、炔基或链二烯基，链烯基如1-十二烯基、2-十二烯 基，炔基如1-十八炔基、2-十八炔基，链二烯基如1，3-十八烯基、7，9-十八烯基等。优选 具有17～25个碳原子的直链或支链烷基，特别优选具有17个碳原子的直链烷基。
R2优选为H。
以如下化合物为例：


R1优选被羟基、芳基、四氢吡咯基和吲哚基取代的具有1～2个碳原子的烷基，更优选R1为 被醇羟基、酚羟基、苯基、四氢吡咯基和吲哚基取代的具有1个碳原子的烷基，最优选R1为被 酚羟基、醇羟基取代的具有1个碳原子的烷基。
特别优选R1为被酚羟基、醇羟基取代的具有1个碳原子的烷基，R2为H，R3为17个碳原子 的直链烷基。
本发明的优选化合物为：
N-硬脂酰酪氨酸
在本发明的另一方面，提供了一种上述硬脂酰氨基酸化合物的制备方法，该方法包括将 下式（Ⅳ）化合物

在碱性条件下与下式（Ⅲ）化合物反应制得通式（I）化合物

优选的，所述式（Ⅳ）化合物是通过下式（Ⅱ）化合物与偶合剂1-羟基苯并三唑反应制 备

优选的，所述式（Ⅱ）化合物是将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、硬脂 酸、三乙胺，在催化剂4-二甲氨基吡啶的作用下反应制备而成。
优选的，所述式（Ⅲ）化合物是通过氨基酸与盐酸甲醇反应制备。
在本发明的另一方面，还提供了还提供一种药物组合物，其包含安全有效量的上述通式 （I）硬脂酰氨基酸化合物，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。
上述可接受的载体是无毒的、能辅助施用并且对通式（I）化合物的治疗效果没有不利影 响。此类载体可以是本领域的技术人员通常能得到的任何固体赋形剂、液体赋形剂、半固体 赋形剂或者在气雾剂组合物中可以是气体赋形剂。固体药物赋形剂包括淀粉、纤维素、滑石、 葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、甘油 硬脂酰酯、氯化钠、无水脱脂乳等。液体和半固体赋形剂可以选自甘油、丙二醇、水、乙醇 和各种油，包括那些源于石油、动物、植物或人工合成的油，例如，花生油、豆油、矿物油、 芝麻油等、优选的液体载体，特别是用于可注射溶液的，包括水、盐水、葡萄糖水溶液和甘 醇。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明的化合物以治疗上的有效量施用，其施用方式可以是口服、全身施用（例如，透 过皮肤的、鼻吸入的或者用栓剂）或肠胃外施用（例如，肌肉内、静脉内或皮下）。优选的施 用方式是口服，它可根据疾病程度调节。
本发明的化合物的实际施用量（即活性组分）依赖于许多因素，如待治疗疾病的严重性、 治疗对象的年龄和相对健康程度、所使用的化合物的效能、施用途径和形式，以及其他因素。
本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规方法制备。例如使该化合物（活 性成分）与一种或者多种载体混合，然后将其制成所需的剂型，如片剂、药丸、胶囊、半固 体、粉末、缓释剂型、溶液、混悬液、配剂、气雾剂等等。
在本发明的另一方面，还提供了上述化合物在制备抗氧化药物中的应用。
通过谷氨酸诱导PC12细胞和皮层神经元的氧化损伤实验证实，本发明的硬脂酰氨基酸 化合物，能有效对抗谷氨酸诱导的细胞氧化损伤，几乎可以完全逆转谷氨酸诱导的细胞氧化 损伤形态学改变，说明本发明的硬脂酰氨基酸化合物具有显著的抗氧化活性，可用于制备抗 氧化药物，应用前景非常广阔。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例4谷氨酸诱导PC12细胞非caspase依赖的氧化损伤柱状图；
图2是本发明实施例4的NsTyr对抗谷氨酸诱导的PC12细胞的氧化毒性柱状图及光镜 观察图；
图3是本发明实施例5谷氨酸诱导原代皮层神经元非caspase依赖的氧化损伤柱状图；
图4是本发明实施例5的NsTyr对抗谷氨酸诱导的皮层神经元氧化毒性柱状图及光镜观 察图；
图5是本发明实施例6的NsTyr抑制谷氨酸诱导的PC12细胞ROS蓄积的光镜观察图。
具体实施方式
实施例1N-硬脂酰氨基酸的制备
（1）氨基酸的保护——羧基甲酯化
氨基酸与盐酸-甲醇反应得氨基酸甲酯。硬脂酸与二氯亚砜加热回流即得硬脂酰氯。
氨基酸甲酯溶于吡啶中，滴加上述硬脂酰氯，搅拌反应过夜。经萃取、重结晶等，制得 硬脂酰氨基酸甲酯。然后碱性条件下水解，得硬脂酰氨基酸。

（2）氨基酸去保护——硬脂酸先活化（活性酯法）
硬脂酸（SA）与N-羟琥珀酰亚胺（N-HOSu）反应生成活化酯，然后与氨基酸类化合物 反应，即可得硬脂酰胺。
硬脂酸与N-羟琥珀酰亚胺在脱水剂DCC作用下，搅拌反应16小时，过滤，结晶，得 N-硬脂酰琥珀酰亚胺（SA-OSu）。氨基酸与SA-ONSu搅拌反应，经酸化、提取、结晶得硬脂 酰氨基酸。

所合成化合物的结构：
1.N-硬脂酰甘氨酸甲酯（NSGlyE）
2.N-硬脂酰谷氨酸甲酯（NSGluE）
3.N-硬脂酰苯丙氨酸甲酯（NSPheE）
4.N-硬脂酰苯丙氨酸(NSPhe、DL-NSPhe)
5.N-硬脂酰脯氨酸（NSPro）
6.N-硬脂酰酪氨酸（NSTyr）
7.N-硬脂酰半胱氨酸（NSCys）
8.N-硬脂酰组氨酸（NSHis）
9.N-硬脂酰色氨酸（NSTrp）
10.N-硬脂酰赖氨酸（NSLys）
11.N-硬脂酰丝氨酸（NESer）
12.N-硬脂酰亮氨酸（NSLeu）
实施例2N-硬脂酰氨基酸的制备
本实施例采用一锅法制备N-硬脂酰氨基酸，一锅法反应条件温和，不受氨基酸溶解度与 体系pH限制，产率和纯度较理想。下面以N-硬脂酰酪氨酸（NSTyr）的一锅法制备为例详细 描述一锅法的反应步骤。
室温下，以1-羟基苯并三唑HOBT为偶合剂，4-二甲氨基吡啶DMAP为催化剂，1-乙基 -(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐在碱性条件下与预先合成的L-酪氨酸甲酯用一锅法合 成N-硬脂酰酪氨酸甲酯，后者经水解得N-硬脂酰酪氨酸（NSTyr）。

1.酪氨酸甲酯的制备
25ml两颈瓶一侧颈接干燥管，另一颈接滴液漏斗，加入5ml甲醇，冰盐浴条件下滴加0.8ml 乙酰氯，搅拌30min，得盐酸甲醇。另一100ml圆底烧瓶内加入0.905g L-酪氨酸，5ml甲醇。 搅拌加入盐酸甲醇，溶液澄清后，回流24h。反应液无水硫酸钠干燥、过滤，滤液挥干溶剂， 得L-酪氨酸甲酯盐酸盐，黄色片状结晶。向该固体加入饱和碳酸氢钠溶液（20ml）至不再产 生气泡，二氯甲烷（30ml）萃取2次，干燥有机相，蒸干，得L-酪氨酸甲酯黄色固体1.07g， 产率为95.6%。
2.N-硬脂酰酪氨酸甲酯（一锅法）
250ml圆底烧瓶中加入硬脂酸1.704g（6mmol)，三乙胺（EtB3BN）1.22ml（9.8mmol），1- 乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐0.920g（4.8mmol），4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.029g （0.24mmol），1-羟基苯并三唑（HOBT）0.648g（4.8mmol），L-酪氨酸甲酯1.11g（4.8mmol） 及80ml二氯甲烷，室温搅拌24h，TLC监控。粗产品中加入1mol/L盐酸溶液洗涤至不再出现 白色絮状物，二氯甲烷萃取3次，合并有机相；在上述收集的有机相中加入饱和碳酸氢钠溶 液洗涤至不再产生气泡，经二氯甲烷萃取3次，合并有机相；饱和食盐水溶液洗涤以上收集 的二氯甲烷相，无水硫酸钠干燥，浓缩，得粗制品1.4g。硅胶柱层析，展开剂二氯甲烷/甲醇 （4/1）得L-硬酯酰酪氨酸甲酯，白色粉末588.6mg，产率82.7%，m.p.100-104℃。产物加入 1mol/L甲醇-氢氧化钾溶液10ml后于70℃加热回流3h，澄清液4℃冷藏24h。过滤，得粗产品， 丙酮淋洗2-3次，干燥，得白色固体NsTyr-2K608.1mg，产率95.6%。
实施例3结构鉴定
上述实施例1合成的硬脂酰氨基酸化合物均经1PHNMR、13PCNMR鉴定其结构。下面所列 为化合物6和11的结构鉴定数据。
化合物6：
白色固体，mp，106～108℃。1HNMR（500MHz，CDCl3，TMS）δppm：7.0（2H，d， J=10.2Hz，苯环上的H）；6.7（2H，d，J=10.5Hz，苯环上的H）；5.9（1H，s，-NH-）；4.8（1H， m，-CH-NH-）；3.1（2H，m，-CH2-），2.17（2H，t，-CH2-CONH-）；1.4（2H，m，-CH2-）； 1.26（28H，m，-(CH2)n-）；0.88（3H，t，-CH3）。13CNMR（500MHz，CDCl3）δppm：174.1 （-CONH-）；173.9（-COOH）；155.3（苯环上连-OH的C）；130.5、130.3、127.6、121.8和 115.8（苯环上另5个C）；53.4（-CH-NH-）；36.8（-CH2-CONH-）；36.6（-CH2-CHNH-）；32.0 （-CH2-）；31.6～22.6（14×-CH2-）；14.0（-CH3-）。
以上数据证实该化合物为N-硬脂酰酪氨酸。
化合物11：
白色粉末，mp，100～102℃。1HNMR（300MHz，CD3OD，TMS）δppm：4.48（1H，t， -CH-NH-）；3.8（2H，m，-CH2OH）；2.26（2H，t，-CH2-CONH-）；1.62（2H，m，-CH2-）； 1.28（28H，m，-(CH2)n-）；0.89（3H，t，-CH3）。13CNMR（500MHz，CD3OD）δppm：176.7 （-CONH-）；173.8（-COOH）；63.3（-CH2OH）；56.3（-CH-NH-）；37.2（-CH2-CONH-）； 33.3（-CH2-）；31.1～24.0（14×-CH2-）；14.7（-CH3-）。
以上数据证实该化合物为N-硬脂酰丝氨酸。
实施例4N-硬脂酰酪氨酸（NsTyr）对抗谷氨酸诱导的PC12细胞的氧化毒性
1.实验方法
(1)细胞培养
大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞购于中国科学院上海细胞库，细胞生长在含有10% 胎牛血清的DMEM培养液中，于5%CO2培养箱内37℃下培养。隔天半换液，生长至80%-90% 汇合时传代。
(2)谷氨酸诱导PC12细胞损伤模型的建立及药物处理
采用培养24h的PC12细胞建立损伤模型，培养板从二氧化碳培养箱中取出后进行10 mmol/L谷氨酸处理24h，建立损伤模型。不同浓度的受试药物NsTyr（白色粉末状固体，由 本教研室研制合成，纯度经HPLC分析为＞98%，使用时用DMSO助溶）在谷氨酸损伤前1h 加入，药物存在于整个损伤过程。
(3)MTT检测
细胞按3×104的密度接种于96孔培养板中生长24h后进行谷氨酸损伤，期间依据实验需 要加入不同的药物处理。作用结束后，加入10μl MTT（10mg/ml，Sigma公司），37℃孵育 4h后弃上清，加入DMSO100μl，振荡约10min至结晶完全溶解，用酶标仪读取490nm吸光 度值。同时设置调零孔（培养基、DMSO、MTT），对照孔（细胞、培养液、相同浓度的药 物溶解介质、DMSO、MTT），每组设定6个复孔，独立实验重复3次。因活细胞内琥珀酸脱 氢酶催化MTT生成有色结晶产物，故吸光度值反映细胞活力，以处理组与未处理对照组的吸 光度平均值的比值代表相对细胞活力改变。
(4)TUNEL染色
脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL染色）是利用染色体DNA 双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，能够在脱氧核糖核苷酸末端转移酶 （TdT）的催化作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素标记到DNA的3'-OH末端，从而进行 凋亡细胞的检测。将PC12细胞以5×105个/ml浓度接种于铺有盖玻片的24孔板中，药物处 理结束后，采用PBS洗去培养液，每孔加入1ml4%多聚甲醛，固定20min，PBS洗3次。 0.1%Triton-X100冰上透膜10min。室温避光孵育TUNEL染色液（试剂1和试剂2按1:9 冰上混匀，TUNEL试剂盒购自Invitrogen公司）90min。抗荧光淬灭封片液封片，采用光学显 微镜观察并拍照。每个盖玻片选取五个视野，TUNEL染色阳性的细胞核呈红色，代表视野 中凋亡细胞。
2.实验结果
(1)谷氨酸诱导PC12细胞非caspase依赖的氧化损伤
10mmol/L谷氨酸处理PC12细胞24h后，采用MTT方法检测细胞活力。如图1A所示， PC12细胞活力显著降低（P＜0.001）。
分别采用谷氨酸受体拮抗剂（5μmol/L MK-801、20μmol/L CNQX）或抗氧化剂（5mmol/L  NAC）预处理PC12细胞1h，然后加入10mmol/L谷氨酸持续作用24h，MTT法检测细胞 活力，结果显示抗氧化剂组PC12细胞活力较谷氨酸组显著提高（P＜0.001），而受体拮抗剂 组细胞活力较谷氨酸组无差异（P＞0.05）。
此外，采用不同浓度caspases抑制剂z-VAD-FMK预处理1h，然后加入10mmol/L谷氨 酸持续作用24h，MTT法检测细胞活力发现，不同浓度的caspases抑制剂对PC12细胞损伤 均无显著保护作用（P＞0.05）（图1B）。这些结果提示，谷氨酸主要通过氧化毒性，而非谷 氨酸受体介导的兴奋毒性诱导PC12细胞损伤；同时提示谷氨酸诱导的PC12细胞氧化毒性为 非caspase依赖途径介导的。
(2)NsTyr可以对抗谷氨酸诱导的PC12细胞的氧化毒性
0-20μmol/L NsTyr预处理PC12细胞1h，然后加入10mmol/L谷氨酸继续作用24h，MTT 结果显示NsTyr可以对抗谷氨酸诱导的氧化损伤，并呈剂量依赖性（1-10μmol/L,图2A）， 且10μmol/L NsTyr的保护作用最强（P＜0.001）。光镜观察发现10μmol/L NsTyr几乎可以完 全逆转谷氨酸诱导细胞形态学改变（图2B）。采用TUNEL染色法发现，谷氨酸作用24h后 TUNEL染色阳性细胞数目显著增加，而10μmol/L NsTyr预处理可显著减少该增加（图2C， P＜0.001），进一步证实10μmol/L NsTyr可减少谷氨酸诱导的氧化损伤。
实施例5NsTyr对抗谷氨酸诱导的皮层神经元氧化毒性
1.实验方法
(1)谷氨酸诱导原代皮层神经元损伤模型的建立及药物处理
乙醚麻醉孕14-16天SD大鼠后，消毒并剖腹取出胎鼠，冰面上断头，置于解剖溶液D-Hank’s 液中，分离大脑皮层，剥除脑膜血管，收集足够皮层，剪碎成糜状，用移液枪移至15ml离心 管中，静置，待皮层沉淀，尽量去除解剖液，按皮层量加入适量胰酶消化液（0.25%胰酶1ml， 用DMEM稀释至5ml），于37℃孵育8min。轻轻吹打，至细胞分散均匀。加入少量胎牛血清 中止消化，1000g离心5min，弃上清液。细胞沉淀中加入含10%胎牛血清及5%马血清的DMEM， 吹打均匀。计数细胞后，调整细胞密度，接种于预先包被有多聚赖氨酸的培养板。细胞培养 箱内37℃培养24h后，改用NeuroBasal培养液+1%B27营养液培养。培养至第三天，从二氧化 碳培养箱中取出神经元进行谷氨酸损伤。不同浓度的受试药物NsTyr（白色粉末状固体，由本 教研室研制合成，纯度经HPLC分析为＞98%，使用时用DMSO助溶）在谷氨酸损伤前1h加入， 药物作用于整个损伤过程中。
2.实验结果
(1)谷氨酸诱导原代皮层神经元非caspase依赖的氧化损伤
1mmol/L谷氨酸处理培养3天的原代皮层神经元24h后，采用MTT方法检测细胞活力， 如图3所示，神经元活力显著降低（P＜0.001）。
如果分别采用谷氨酸受体拮抗剂（5μmol/L MK-801、20μmol/L CNQX）、抗氧化剂（5 mmol/L NAC）或caspases抑制剂（20μmol/L z-VAD-FMK）预处理神经元1h，然后加入1 mmol/L谷氨酸持续作用24h，MTT法检测细胞活力，结果显示抗氧化剂组原代皮层神经元 细胞活力较谷氨酸组显著提高（P＜0.001），而受体拮抗剂组及caspase抑制剂组细胞活力较 谷氨酸组无差异（P＞0.05）。这些结果提示，谷氨酸通过氧化毒性诱导神经元损伤，谷氨酸 诱导的神经元氧化毒性为非caspase依赖途径介导的。
谷氨酸对神经元的损伤机制与其对PC12细胞的损伤机制类似。
(2)NsTyr对抗谷氨酸诱导的皮层神经元氧化毒性
0-20μmol/L NsTyr预处理皮层神经元1h，然后加入1mmol/L谷氨酸继续作用24h，MTT 结果显示NsTyr可以对抗谷氨酸诱导的氧化损伤，并呈剂量依赖性（5-10μmol/L,图4A）， 且10μmol/L NsTyr的保护作用最强（P＜0.001）。光镜观察发现谷氨酸作用24h后，神经元 突触断裂，部分胞体皱缩甚至漂浮，而10μmol/L NsTyr几乎可以完全逆转谷氨酸诱导的神经 元形态学改变（图4B）。
对照上述实施例4的实验结果可知，NsTyr对抗谷氨酸诱导的皮层神经元氧化毒性的活 性作用与其在PC12细胞上所表现的相应活性相似。
实施例6NsTyr抑制谷氨酸诱导的PC12细胞ROS蓄积
1.实验方法
(1)细胞内ROS（活性氧自由基）水平检测
DCFH-DA（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate）是一种非荧光非极性物质，可透 过细胞膜被细胞内的ROS氧化为荧光物质DCF（2’,7’-dichlorofluorescein），故DCF的荧光强度 即代表细胞内的ROS水平，可以直接用荧光显微镜进行检测。PC12细胞以2×106/孔密度接种 于玻片上，谷氨酸损伤6h、8h后，每孔加入10μmol/L DCFH-DA5μl，37℃孵育30min， 弃去培养液，PBS漂洗3次，采用荧光显微镜观察并拍照（激发光波长为488nm，发射光波 长分别为525nm），image J软件计算DCF荧光强度值。
2.实验结果
在谷氨酸诱导的氧化损伤中，ROS蓄积是关键的上游事件。采用H2DCF-DA荧光探针分 别检测不同时间点各组细胞中ROS水平。如图5所示，谷氨酸作用8h，细胞内ROS水平较 CON组显著升高（P＜0.001vs.CON），而NsTyr预处理后，重复以上实验，谷氨酸诱导的 ROS水平升高被显著抑制(P＜0.001vs.GLU)。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而 理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此， 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。