一种垂体后叶激素的纯化方法.pdf

本发明公开了一种垂体后叶激素的纯化方法。该方法包括下述步骤：(1)将垂体后叶激素原液与缓冲液混合，所述的缓冲液的pH值为3.0～5.0；(2)采用超滤膜进行超滤，收集截留液；(3)将截留液用水稀释，加入酸调节溶液pH值至1.0～2.0；(4)采用超滤膜进行反超滤，收集超出液，即可。本发明的纯化方法能够有效去除垂体后叶激素中高分子有关物质，该纯化方法生产周期短，制得的产品纯度高，生产成本低，易于放大生产。

权利要求书
1.  一种垂体后叶激素的纯化方法，其包括下述步骤：
(1)将垂体后叶激素原液与缓冲液混合，所述的缓冲液的pH值为3.0～5.0；
(2)采用超滤膜进行超滤，收集截留液；
(3)将截留液用水稀释，加入酸调节溶液pH值至1.0～2.0；
(4)采用超滤膜进行反超滤，收集超出液，即可。

2.  如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述的垂体后叶激素原液通过下述步骤制得：脑垂体丙酮浸泡→剥取后叶丙酮浸泡→干燥→粉碎→丙酮处理→干燥→粉碎→酸提取→活性炭脱色→过滤→得垂体后叶激素原液。

3.  如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述的缓冲液为醋酸钠-醋酸缓冲液或醋酸铵-醋酸缓冲液。

4.  如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述的垂体后叶激素原液与缓冲液的体积比为(0.5～5)：1。

5.  如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的缓冲液的浓度为10mmol/L～100mmol/L。

6.  如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的超滤膜为截留相对分子量为2kDa的超滤膜，优选来源于德国赛多利斯公司的Hydrosart超滤膜。

7.  如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的酸为盐酸、硫酸和磷酸中的一种或多种。

8.  如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的超滤膜为截留相对分子量为5kDa的超滤膜，优选来源于德国赛多利斯公司的Hydrosart超滤膜。

9.  如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，超滤的时间以超出液体积达到垂体后叶激素超滤起始体积的70％～90％时为止。

10.  如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(4)中，反超 滤的时间以超出液体积达到垂体后叶激素反超滤起始体积的70％～90％时为止。

说明书一种垂体后叶激素的纯化方法
技术领域
本发明涉及蛋白质纯化领域，具体涉及一种垂体后叶激素的纯化方法。
背景技术
垂体后叶激素，是由脑垂体后叶中提取的一种混合类多肽激素，主要包含加压素和缩宫素两种主要成分。加压素由九个氨基酸组成，因含有两个半胱氨酸，所以又称八肽。加压素具有抗利尿和升高血压两种作用，因此也称为抗利尿激素。缩宫素也由九个氨基酸组成，因其对平滑肌有刺激作用，能使子宫平滑肌收缩，具有催产作用，故又称催产素。
现有技术在生物大分子活性物质分离纯化过程中，为了去除分子量较大的有关物质，目前主要采用透析、凝胶层析或超滤技术。在垂体后叶激素粗提液中一部分有关物质会与垂体后叶激素凝聚，另一部分有关物质又保持与垂体后叶激素分离，同时垂体后叶激素自身也会形成多聚体。若采用透析技术纯化垂体后叶激素会使原液稀释，同时收率较低，生产周期长；采用凝胶层析技术则载量小，生产成本高，操作技术要求高，对与有关物质结合的垂体后叶激素不能彻底分离，影响收率。采用超滤时，大部分垂体后叶激素并不能透过超滤膜，而是与有关物质一起存在于截留液，不能有效除去有关物质。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于为了克服现有技术中垂体后叶激素纯化收率低、与有关物质不能彻底分离的缺陷，提供一种垂体后叶激素的纯化方法。本发明的纯化方法能够有效去除垂体后叶激素中高分子有关物质，该纯化方法生产周期短，制得的产品纯度高，生产成本低，易于放大生产。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
本发明提供了一种垂体后叶激素的纯化方法，其包括下述步骤：
(1)将垂体后叶激素原液与缓冲液混合，所述的缓冲液的pH值为3.0～5.0；
(2)采用超滤膜进行超滤，收集截留液；
(3)将截留液用水稀释，加入酸调节溶液pH值至1.0～2.0；
(4)采用超滤膜进行反超滤，收集超出液，即可。
其中，所述的垂体后叶激素原液可为本领域常规使用的各种垂体后叶激素原液，较佳地通过下述步骤制得：脑垂体丙酮浸泡→剥取后叶丙酮浸泡→干燥→粉碎→丙酮处理→干燥→粉碎→酸提取→活性炭脱色→过滤→得垂体后叶激素原液，本发明优选购于上海第一生化药业有限公司的垂体后叶激素原液。
其中，步骤(1)中所述的缓冲液较佳地为醋酸钠-醋酸缓冲液或醋酸铵-醋酸缓冲液。
其中，所述的垂体后叶激素原液与缓冲液的体积比较佳地为(0.5～5)：1。步骤(1)中，所述的缓冲液的浓度较佳地为10mmol/L～100mmol/L。
其中，步骤(2)中，所述的超滤膜较佳地为截留相对分子量为2kDa的超滤膜，优选来源于德国赛多利斯公司的Hydrosart超滤膜。
其中，步骤(3)中，所述的酸较佳地为盐酸、硫酸和磷酸中的一种或多种。
步骤(4)中，所述的超滤膜较佳地为截留相对分子量为5kDa的超滤膜，优选来源于德国赛多利斯公司的Hydrosart超滤膜。
其中，步骤(2)中，超滤的时间较佳地以超出液体积达到垂体后叶激素超滤起始体积的70％～90％时为止。
其中，步骤(4)中，反超滤的时间较佳地以超出液体积达到垂体后叶激素反超滤起始体积的70％～90％时为止。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)本发明通过正反超滤技术，首先采用正超滤超出垂体后叶激素原液杂质并对垂体后叶激素进行浓缩，同时去除大部分缓冲液盐，然后更换超滤膜，并维持低pH环境，使垂体后叶激素与高分子有关物质解聚，在此条件下采用反超滤将垂体后叶激素超出；
(2)本发明单批生产量远大于凝胶过滤技术，投入成本低，便于操作，生产周期短；
(3)本发明得到的样品浓度高，产品质量好。
(4)使用本发明的方法，成功使垂体后叶激素原液中的有关高分子物质(如：后叶激素运载蛋白NP)含量降低至2015版中国药典要求的10％以下，并且保持样品中两种主要物质的含量比相对固定。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中的垂体后叶激素原液均购于上海上药第一生化药业有限公司，批号：lot:140305。其制备方法为脑垂体丙酮浸泡→剥取后叶丙酮浸泡→干燥→粉碎→丙酮处理→干燥→粉碎→酸提取→活性炭脱色→过滤→得垂体后叶激素原液。
实施例1
1.1、缓冲液配制
配制浓度为100mmol/L的CH3COONa-CH3COOH缓冲液，pH调节至3.0。
1.2、样品预处理
量取垂体后叶激素原液(lot：140305)2.0L，按原液：缓冲液＝4：1(体 积比)的比例，加入缓冲液，搅拌混匀。
1.3、超滤
采用截留分子量为2KDa的超滤膜(赛多利斯，Hydrosart)，装入超滤系统(赛多利斯，Sartocon Slice Cassette)，装好后，检测膜完整无损后，采用NaOH溶液清洗系统，之后用纯化水清洗碱液至回流液pH中性，然后在进液口泵入垂体后叶激素溶液，回流口返回至盛有垂体后叶粗提液的烧杯，收集截留液，待超出液体积达到垂体后叶超滤起始体积的90％时，停止超滤。检测超滤膜完整性并分别采用0.5M的氢氧化钠清洗30min，然后采用纯化水清洗超滤系统至回流液pH中性。
1.4、稀释
准确量取垂体后叶激素截留液体积200ml，按照5倍体积加入纯化水，采用2M HCl调节样品pH至2.0。
1.5、反超滤
采用截留分子量为5KDa的超滤膜(赛多利斯，Hydrosart)，装入超滤系统(赛多利斯，Sartocon Slice Cassette)中，装好后，检测膜完整后，在进液口泵入垂体后叶2KDa截留液，回流口返回至盛有垂体后叶激素截留液的烧杯，收集超出液，待超出液体积达到垂体后叶超滤起始体积的90％时，停止超滤。检测超滤膜完整性。
1.6、纯品鉴定
取超滤后的超出液样品鉴定其纯度，具体方法如效果实施例1和效果实施例2。
实施例2
1.1、缓冲液配制
配制浓度为50mmol/L的CH3COONa-CH3COOH缓冲液，pH调节至5.0。
1.2、样品预处理
量取垂体后叶激素原液(lot：140305)2.0L，按原液：缓冲液＝1：1(体 积比)的比例，加入缓冲液，搅拌混匀。
1.3、超滤
采用截留分子量为2KDa的超滤膜(赛多利斯，Hydrosart)，装入超滤系统(赛多利斯，Sartocon Slice Cassette)，装好后，检测膜完整无损后，采用NaOH溶液清洗系统，之后用纯化水清洗碱液至回流液pH中性，然后在进液口泵入垂体后叶激素溶液，回流口返回至盛有垂体后叶粗提液的烧杯，收集截留液，待超出液体积达到垂体后叶超滤起始体积的90％时，停止超滤。检测超滤膜完整性并分别采用0.5M的氢氧化钠清洗30min，然后采用纯化水清洗超滤系统至回流液pH中性。
1.4、稀释
准确量取截留液体积，按照5倍体积加入纯化水，采用2M H2SO4调节样品pH至1.5。
1.5、反超滤
采用截留分子量为5KDa的超滤膜(赛多利斯，Hydrosart)，装入超滤系统(赛多利斯，Sartocon Slice Cassette)，装好后，检测膜完整后，在进液口泵入垂体后叶2KDa截留液，回流口返回至盛有垂体后叶截留液的烧杯，收集超出液，待超出液体积达到垂体后叶超滤起始体积的90％时，停止超滤。检测超滤膜完整性。
1.6、纯品鉴定
取超滤后的超出液样品鉴定其纯度，具体方法如效果实施例1和效果实施例2。
实施例3
1.1、缓冲液配制
按照实验要求，配制浓度为100mmol/L的CH3COONH4-CH3COOH缓冲液，pH调节至5.0。
1.2、稀释
量取垂体后叶激素原液(lot：140305)2.0L，按原液：缓冲液＝4：1(体积比)的比例，加入缓冲液，搅拌混匀。
1.3、超滤
采用截留分子量为2KDa的超滤膜(赛多利斯，Hydrosart)，装入超滤系统(赛多利斯，Sartocon Slice Cassette)，装好后，检测膜完整后，在进液口泵入垂体后叶激素溶液，回流口返回至盛有垂体后叶的烧杯，收集截留液，待超出液体积达到垂体后叶超滤起始体积的90％时，停止超滤。检测超滤膜完整性。
1.4、稀释
准确量取截留液体积，按照5倍体积加入纯化水，采用2M H2SO4调节样品pH至1.5。
1.5、反超滤
采用截留分子量为5KDa的超滤膜(赛多利斯，Hydrosart)，装入超滤系统(赛多利斯，Sartocon Slice Cassette)，装好后，检测膜完整后，在进液口泵入垂体后叶2KDa截留液，回流口返回至盛有垂体后叶截留液的烧杯，收集超出液，待超出液体积达到垂体后叶超滤起始体积的90％时，停止超滤。检测超滤膜完整性。
1.6、纯品鉴定
取超滤后的超出液样品鉴定其纯度，具体方法如效果实施例1和效果实施例2。
对比实施例1
1.1、缓冲液配制
按照实验要求，配制浓度为50mmol/L的CH3COONa-CH3COOH缓冲液，pH调节至5.0。
1.2、样品预处理
量取垂体后叶激素原液(lot：140305)2.0L，按原液：缓冲液＝1：1(体 积比)的比例，加入缓冲液，搅拌混匀。
1.3、超滤
采用截留分子量为2KDa的超滤膜(赛多利斯，Hydrosart)，装入超滤系统(赛多利斯，Sartocon Slice Cassette)，装好后，检测膜完整无损后，采用NaOH溶液清洗系统，之后用纯化水清洗碱液至回流液pH中性，然后在进液口泵入垂体后叶激素溶液，回流口返回至盛有垂体后叶粗提液的烧杯，收集截留液，待超出液体积达到垂体后叶超滤起始体积的90％时，停止超滤。检测超滤膜完整性并分别采用0.5M的氢氧化钠清洗30min，然后采用纯化水清洗超滤系统至回流液pH中性。
1.4、纯品鉴定
取超滤后的截留液样品鉴定其纯度，具体方法如效果实施例1和效果实施例2。
对比实施例2
1.1、缓冲液配制
按照实验要求，配制浓度为100mmol/L的CH3COONa-CH3COOH缓冲液，pH调节至6.0。
1.2、稀释
量取垂体后叶激素原液(lot：140305)2.0L，按原液：缓冲液＝4：1(体积比)的比例，加入缓冲液，搅拌混匀。
1.3、超滤
采用截留分子量为2KDa的超滤膜(赛多利斯，Hydrosart)，装入超滤系统(赛多利斯，Sartocon Slice Cassette)，装好后，检测膜完整后，在进液口泵入垂体后叶溶液，回流口返回至盛有垂体后叶的烧杯，收集截留液，待超出液体积达到垂体后叶超滤起始体积的90％时，停止超滤。检测超滤膜完整性。
1.4、稀释
准确量取截留液体积，按照5倍体积加入纯化水，采用2M H2SO4调节样品pH至2.0。
1.5、反超滤
采用截留分子量为5KDa的超滤膜(赛多利斯，Hydrosart)，装入超滤系统(赛多利斯，Sartocon Slice Cassette)，装好后，检测膜完整后，在进液口泵入垂体后叶2KDa截留液，回流口返回至盛有垂体后叶截留液的烧杯，收集超出液，待超出液体积达到垂体后叶超滤起始体积的90％时，停止超滤。检测超滤膜完整性。
1.6、纯品鉴定
取超滤后的超出液样品鉴定其纯度，具体方法如效果实施例1和效果实施例2。
对比实施例3
1.1、缓冲液配制
按照实验要求，配制浓度为100mmol/L的CH3COONa-CH3COOH缓冲液，pH调节至6.0。
1.2、稀释
量取垂体后叶激素原液(lot：140305)2.0L，按原液：缓冲液＝4：1(体积比)的比例，加入缓冲液，搅拌混匀。
1.3、超滤
采用截留分子量为2KDa的超滤膜(赛多利斯，Hydrosart)，装入超滤系统(赛多利斯，Sartocon Slice Cassette)，装好后，检测膜完整后，在进液口泵入垂体后叶粗提液，回流口返回至盛有垂体后叶的烧杯，收集截留液，待超出液体积达到垂体后叶超滤起始体积的90％时，停止超滤。检测超滤膜完整性。
1.4、稀释
准确量取截留液体积，按照5倍体积加入纯化水，采用2M H2SO4调节 样品pH至4.0。
1.5、反超滤
采用截留分子量为5KDa的超滤膜(赛多利斯，Hydrosart)，装入超滤系统(赛多利斯，Sartocon Slice Cassette)，装好后，检测膜完整后，在进液口泵入垂体后叶2KDa截留液，回流口返回至盛有垂体后叶截留液的烧杯，收集超出液，待超出液体积达到垂体后叶超滤起始体积的90％时，停止超滤。检测超滤膜完整性。
1.6、纯品鉴定
取超滤后的超出液样品鉴定其纯度，具体方法如效果实施例1和效果实施例2。
效果实施例1
采用凝胶过滤层析鉴定纯化前后垂体后叶激素的纯度，色谱条件如下：
色谱柱：Tricorn Superdex 75GL预装柱(24ml)(GE公司生产)
纯化系统：AKTA Explorer(GE公司生产)
上样量：0.5ml
样品浓度：垂体后叶激素原液
平衡液：50mM NaAc-HAc缓冲液(pH 3.0)
检测波长：280nm
流速：1.0ml/min
检测方法：0min→40min：平衡液等度平衡.
凝胶过滤层析结果如下表所示：(百分比为质量百分比)

由上述结果可以看出，本发明的纯化方法可以有效去除高分子有关物质杂质，并且能够确保产品中垂体后叶激素含量达50％以上。
效果实施例2
实验采用C18色谱柱，使用梯度洗脱的方法，对样品中目标多肽缩宫素和升压素进行定性定量分析。
色谱柱：Waters Xbridge C18(4.6×150mm，5μm)
流动相：A：磷酸二氢钾-磷酸(pH＝3.0)B:乙腈：水＝1：1
样品类型：垂体后叶素、加压素、缩宫素
柱流量：1.0ml/min
检测波长：220nm
柱温：25℃
上样体积：10μL
实验步骤：用流动相B平衡柱子至基线，然后上样；采用以下梯度洗脱：
0min：90％A+10％B
7min：60％A+40％B
13min：50％A+50％B
20min：50％A+50％B
20.1min：100％B
26min：100％B
26.1min：90％A+10％B
先上加压素与缩宫素对照品，确定其位置，然后对各个实施例中的样品进行检测，结果如下(百分比为质量百分比)：


由上表中的数据可以看出，本发明的纯化方法可以保持垂体后叶激素样品中两种主要物质的含量比相对固定，有利于保证产品的效价稳定，提高产品质量。