猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒RVHBJX及其应用.pdf

本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒RvHBJX及其应用，属于病毒基因工程技术领域。本发明的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒RvHBJX是以低致病性PRRSV毒株HB-1/3.9为骨架包含高致病性PRRSV毒株JXwn06结构蛋白编码区的嵌合病毒，该嵌合病毒经MARC-145细胞体外连续传代80次，该病毒遗传性质表现稳定；病毒对宿主细胞的适应性随传代次数的增加逐渐增强；嵌合病毒传代60次(P60)及以上对本体动物具有较好的安全性，且接种后能够对高致病性PRRSV毒株感染提供100％的免疫保护，可作为猪繁殖与呼吸综合征的疫苗侯选株，用于预防猪繁殖与呼吸综合征，具有良好的应用前景。

权利要求书
1.  猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒，其特征在于，其为RvHBJX，是以低致病性 PRRSV病毒毒株HB-1/3.9为骨架，含有高致病性PRRSV毒株JXwn06结构蛋白编 码区的嵌合病毒。

2.  如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒，其特征在于，高致病性 PRRSV毒株结构蛋白编码区的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

3.  猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒RvHBJX全长cDNA克隆质粒，其特征在于， 通过以下方法构建得到：
(1)以pWSK-JXwn为模板，PCR扩增得到JXwn06的整个结构蛋白编码区， 扩增产物命名为HJSP-S2；
(2)以pWSK-HB-1/3.9为模板，分别PCR扩增HB-1/3.9结构蛋白编码区两侧 序列，分别命名为HJSP-S1、HJSP-S3；
(3)将步骤(1)和(2)的扩增产物纯化回收后，以HJSP-S1，HJSP-S2，HJSP-S3 3个片段作为模板，PCR扩增得到HJSP-S123；
(4)HJSP-S123纯化后经Rsr II、Asc I双酶切，连接到相同双酶切的 pWSK-HB-1/3.9质粒中，完成PRRSV嵌合质粒的构建，命名为pW-HJSP。

4.  如权利要求3所述的克隆质粒，其特征在于，
步骤(1)PCR扩增使用的引物为JX-S2F和JX-S2R，其核苷酸序列如SEQ ID  NO.2、3所示；
步骤(2)PCR扩增分别以HB-S1F、HB-S1R和HB-S3F、HB-S3R为引物，其 核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4-7所示；
步骤(3)PCR扩增的引物为HJ-fusionF和HJ-fusionR，其核苷酸序列如SEQ ID  NO.8-9所示。

5.  制备权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合病毒的方法，其特征在 于，包括以下步骤：
(1)构建猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒RvHBJX全长cDNA克隆质粒；
(2)嵌合病毒RvHBJX的拯救。

6.  如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)的克隆质粒通过以下方 法构建得到：
1)以pWSK-JXwn为模板，PCR扩增得到JXwn06的整个结构蛋白编码区，扩 增产物命名为HJSP-S2；
2)以pWSK-HB-1/3.9为模板，分别PCR扩增HB-1/3.9结构蛋白编码区两侧序 列，分别命名为HJSP-S1、HJSP-S3；
3)将步骤1)和2)的扩增产物纯化回收后，以HJSP-S1，HJSP-S2，HJSP-S3 3 个片段作为模板，PCR扩增得到HJSP-S123；
4)HJSP-S123纯化后经RsrII、AscI双酶切，连接到相同双酶切的pWSK-HB-1/3.9 质粒中，完成PRRSV嵌合质粒的构建，命名为pW-HJSP。

7.  如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)中PCR扩增使用的引物为 JX-S2F和JX-S2R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2、3所示；步骤2)中PCR扩增分 别以HB-S1F、HB-S1R和HB-S3F、HB-S3R为引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 4-7所示；步骤3)中PCR扩增的引物为HJ-fusionF和HJ-fusionR，其核苷酸序列如 SEQ ID NO.8-9所示。

8.  如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)嵌合病毒RvHBJX的拯 救通过以下方法来实现：
1)用Rsr II、Pac I内切酶消化pW-HJSP全长cDNA克隆质粒，使质粒线性化； 获得的线性化质粒经酚氯仿抽提及无水乙醇沉淀、干燥后，紫外分光光度计测定纯 化后质粒的浓度；
2)进行体外转录；
3)转录产物经TURBO DNase I消化后，用DMRIE-C脂质体转染MARC-145 细胞，每天观察并记录细胞病变CPE的产生情况，将出现明显CPE的细胞培养上清 在MARC-145细胞上进行连续传代，每代3-5d，获得的拯救病毒即为RvHBJX。

9.  含有权利要求1或2所述猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒或其传代培养病毒的 疫苗。

10.  权利要求1或2所述猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒或其传代培养病毒在制 备疫苗中的用途。

说明书猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒RvHBJX及其应用
技术领域
本发明涉及病毒基因工程技术领域，具体地，涉及一种猪繁殖与呼吸综合征嵌 合病毒RvHBJX及其应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种高度传染性疾病，主要以怀孕母猪 发生流产、早产、产死胎和木乃伊胎等繁殖障碍疾病以及仔猪和生长育肥猪出现呼 吸道症状为特征(Rossow et al.,1994)。2006年初夏以来，严重型PRRS暴发，并迅 速席卷我国主要养猪地区，造成大批生猪死亡，给我国养猪业造成巨大经济损失。 疫苗被认为是防控与净化PRRSV的重要工具。但是，PRRSV感染能引起免疫抑制 与持续性感染，减毒活疫苗的长期使用存在毒力返强等潜在风险(Madsen et al., 1998)。感染性克隆技术为新型疫苗的研究提供了技术保障。自从第一株PRRSV的 感染性克隆成功构建以来(Meulenberg et al.,1998)，反向遗传操作技术已用于分析 和研究PRRSV的基因结构与功能、病毒RNA合成的调控机制、致病机制，以及新 型疫苗的研究。
一般说来，用同源性高的毒株进行免疫能获得较好的抵抗力。因此将流行毒株 的某些基因置换到传统疫苗中，也许能提高疫苗的免疫效力。Ellingson等人利用MLV 疫苗毒、MN184毒株为亲本病毒构建了5个嵌合病毒，其中两个是MLV疫苗毒、 MN184毒株5’UTR/ORF1相互置换的病毒，一个是以MLV为骨架置换了MN184 ORF5-6的嵌合病毒，一个是以MLV为骨架置换了MN184ORF7-3’UTR的嵌合病毒， 一个是以MLV为骨架置换了MN184毒株3’UTR的嵌合病毒。这些嵌合病毒免疫后 的攻毒实验显示MLV疫苗毒、MN184毒株5’UTR/ORF1相互置换的病毒及以MLV 为骨架置换了MN184ORF5-6的嵌合病毒能够诱导产生与传统细胞培养疫苗相似的 抵抗力。Lee等人用韩国PRRSV流行毒株的结构蛋白编码区置换了感染性cDNA克 隆质粒中的相应区域并拯救出相应的PRRSV嵌合病毒，该病毒能够被自然感染猪的 血清所中和，相应的体内试验尚未开展。以上结果说明通过嵌合病毒来研制新型疫 苗是可行的。
我国先前的分离毒株PRRSV HB-1(sh)/2002(GenBank收录号AY150312)(Gao  et al.,2004)，在全基因组序列上与高致病性毒株的同源性最高(97.2％)，但致病性 低。该毒株经MARC-145细胞连续传代，获得能在MARC-145细胞中良好增殖的克 隆毒株HB-1/3.9(GenBank收录号EU360130)(冉智光等，2006)，与高致病性毒株 的全基因组序列同源性为97.4％。这两个毒株基因组高度同源而生物学特性，如毒力、 致病性、生长特性、免疫原性等差异较大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒；本发明的另一目的 在于提供该嵌合病毒作为嵌合疫苗候选株的用途。
本发明首先提供了一种猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒，命名为RvHBJX，是以 低致病性PRRSV毒株HB-1/3.9为骨架，含有高致病性PRRSV毒株JXwn06结构蛋 白编码区的嵌合病毒。
其中，高致病性PRRSV毒株JXwn06结构蛋白编码区的基因序列如SEQ ID NO.1 所示。
本发明提供了猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒RvHBJX全长cDNA克隆质粒，是 通过以下方法构建得到：
(1)以pWSK-JXwn为模板，PCR扩增得到JXwn06的整个结构蛋白编码区， 扩增产物命名为HJSP-S2；
(2)以pWSK-HB-1/3.9为模板，分别PCR扩增HB-1/3.9结构蛋白编码区两侧 序列，分别命名为HJSP-S1、HJSP-S3；
(3)将步骤(1)和(2)的扩增产物纯化回收后，以HJSP-S1，HJSP-S2，HJSP-S3 3个片段作为模板，PCR扩增得到HJSP-S123；
(4)HJSP-S123纯化后经Rsr II、Asc I双酶切，连接到相同双酶切的 pWSK-HB-1/3.9质粒中，完成PRRSV嵌合质粒的构建，命名为pW-HJSP。
其中，步骤(1)PCR扩增使用的引物为JX-S2F和JX-S2R，其核苷酸序列如 SEQ ID NO.2、3所示；
步骤(2)PCR扩增分别以HB-S1F、HB-S1R和HB-S3F、HB-S3R为引物，其 核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4-7所示；
步骤(3)PCR扩增的引物为HJ-fusionF和HJ-fusionR，其核苷酸序列如SEQ ID  NO.8-9所示。
本发明还提供了制备猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合病毒RvHBJX的方法，包括 以下步骤：
(1)构建猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒RvHBJX全长cDNA克隆质粒；
(2)嵌合病毒RvHBJX的拯救。
上述方法中，步骤(1)的克隆质粒通过以下方法构建得到：
1)以pWSK-JXwn为模板，PCR扩增得到JXwn06的整个结构蛋白编码区，扩 增产物命名为HJSP-S2；
2)以pWSK-HB-1/3.9为模板，分别PCR扩增HB-1/3.9结构蛋白编码区两侧序 列，分别命名为HJSP-S1、HJSP-S3；
3)将步骤1)和2)的扩增产物纯化回收后，以HJSP-S1，HJSP-S2，HJSP-S33 个片段作为模板，PCR扩增得到HJSP-S123；
4)HJSP-S123纯化后经Rsr II、Asc I双酶切，连接到相同双酶切的pWSK-HB-1/3.9 质粒中，完成PRRSV嵌合质粒的构建，命名为pW-HJSP。
全基因组序列测定表明，pW-HJSP质粒中结构蛋白编码区与JXwn06一致，而 其余骨架与HB-1/3.9一致，同时HB-1/3.9亲本拯救病毒的两个遗传标记Mlu I与Sfi  I酶切位点仍然存在。
进一步地，步骤1)中PCR扩增使用的引物为JX-S2F和JX-S2R，其核苷酸序 列如SEQ ID NO.2、3所示；步骤2)中PCR扩增分别以HB-S1F、HB-S1R和HB-S3F、 HB-S3R为引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4-7所示；步骤3)中PCR扩增的 引物为HJ-fusionF和HJ-fusionR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8-9所示。
本发明的制备猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合病毒RvHBJX的方法中，步骤(2) 的嵌合病毒RvHBJX的拯救通过以下方法来实现：
1)用Rsr II、Pac I内切酶消化pW-HJSP全长cDNA克隆质粒，使质粒线性化； 获得的线性化质粒经酚氯仿抽提及无水乙醇沉淀、干燥后，紫外分光光度计测定纯 化后质粒的浓度；
2)立即进行体外转录；
3)转录产物经TURBO DNase I消化后，用DMRIE-C脂质体转染MARC-145 细胞，每天观察并记录细胞病变CPE的产生情况；将出现明显CPE的细胞培养上清 在MARC-145细胞上进行连续传代，每代3-5d。获得的拯救病毒即为RvHBJX。
在本发明的实施例中，上述步骤2)的体外转录是按照mMessageHigh Yield Capped RNA Transcription kit(Ambion Inc.,Texas,USA)操作说明进行的。
本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合征嵌合疫苗，含有本发明提供的猪繁殖与 呼吸综合征嵌合病毒RvHBJX或其传代培养后的病毒。
本发明提供了猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒或其传代培养后的病毒在制备疫苗 中的用途。
本发明发现嵌合病毒RvHBJX在MARC-145细胞上连续传代80次后，病毒滴 度由第5代的104.5TCID50/mL升高至107.51TCID50/mL。经过多次连续的体外传代， 嵌合病毒的细胞适应能力显著提高。
本发明通过选择RvHBJXP40、P60、P80毒株人工感染仔猪，分析比较其对高致 病性PRRSV感染的免疫保护性，结果发现PRRSV嵌合毒株RvHBJX P40、P60和 P80细胞传代毒株免疫仔猪后均能减轻感染仔猪的临床症状，降低感染仔猪血清中的 病毒载量，显著降低仔猪的死亡数量，减轻病毒感染造成的肺脏损伤。该嵌合病毒 经MARC-145细胞体外连续传代80次，该病毒遗传性质表现稳定；病毒对宿主细胞 的适应性随传代次数的增加逐渐增强；PRRSV嵌合毒株RvHBJX P60传代60次(P60) 及以上对本体动物具有较好的安全性，且接种后能够对高致病性PRRSV毒株感染提 供100％的免疫保护，可作为猪繁殖与呼吸综合征的疫苗候选株开发。
经动物安全性试验及攻毒保护性试验证明，本发明所获得的猪繁殖与呼吸综合 征嵌合疫苗HBJX接种仔猪后不会引起明显的临床症状，作为疫苗使用的安全性较 好；并能够为感染仔猪提供较好的免疫保护，减轻高致病性PRRSV感染带来的危害。 该嵌合疫苗的病毒骨架来源于临床分离的自然低致病性PRRSV HB-1/3.9毒株，避免 了弱毒疫苗株毒力易返强的风险，同时，毒株中置入的高致病性PRRSV毒株结构蛋 白编码区在接种后也能够刺激机体产生针对流行毒株的中和抗体，提高了该疫苗的 免疫保护效力。此外，嵌合疫苗HBJX序列中人为引入的2个遗传标记也为疫苗株 与自然感染毒株的鉴别诊断提供了明确靶点，该嵌合疫苗的应用将有利于我国猪群 PRRS的净化。本发明所提供的嵌合病毒的构建方法获得的拯救病毒能够在体外连续 传代，其遗传学特性较为稳定。
附图说明
图1为嵌合病毒RvHBJX全长cDNA克隆质粒pW-HJSP构建示意图，其中白色 框代表JXwn06毒株的基因；灰色框代表HB-1/3.9毒株的基因；带有“*”的酶切位 点是遗传标记，1为JXwn06结构蛋白编码区，2为HB-1/3.9结构蛋白编码区侧翼。
图2为嵌合病毒RvHBJX在MARC-145细胞上产生的CPE(200×)，其中A图 为RvHB-1/3.9；B图为RvJXwn；C图为RvHBJX；D图为阴性对照。
图3为嵌合病毒RvHBJX的IFA鉴定(200×)，其中A图为RvHBJX；B图为 RvHB-1/3.9；C图为RvJXwn；D图为阴性对照。
图4为嵌合病毒RvHBJX在细胞上的增殖动态图，其中A图为在MARC-145细 胞上；B图为在PAM细胞上。
图5为感染仔猪的体温及日增重变化，图5A为感染仔猪体温变化；图5B感染 仔猪日增重变化。
图6为嵌合病毒感染仔猪肺脏、下颌淋巴结中病毒抗原检测结果免疫组化图， 其中A为P5感染组肺脏；B为P20感染组肺脏；C为P40感染组肺脏；D为对照组 肺脏；E为P5感染组下颌淋巴结；F为P20感染组下颌淋巴结；G为P40感染组下 颌淋巴结；H为对照组下颌淋巴结。
图7为攻毒后仔猪体温变化与临床症状评分情况图，其中图7A为攻毒后仔猪体 温变化图；图7B为攻毒后仔猪临床症状评分。
图8为攻毒后试验仔猪的存活率。
图9为攻毒前后仔猪的日增重图。
图10为攻毒后仔猪血清中的病毒滴度。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背 离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均 属于本发明的范围。
本发明涉及的MARC-145细胞用DMEM培养基培养。HB-1/3.9毒株野生型全长 cDNA克隆载体pWSK-HB-1/3.9、JXwn06毒株野生型全长cDNA克隆载体 pWSK-JXwn、克隆毒株RvHB-1/3.9及RvJXwn公开于文献(Zhou L,Zhang J,Zeng J, Yin S,Li Y,Zheng L,Guo X,Ge X,Yang HC.2009.The 30-amino-acid deletion in the  Nsp2 of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerging  in China is not related to its virulence.J Virol.83(10):5156-5167)；pEASY Blunt克隆质 粒和大肠杆菌Trans5α均购自北京全式金生物技术有限公司；PRRSV N蛋白单克隆 抗体N35保藏编号为CGMCC NO.3238，公开于中国专利CN101661042B中。
实施例1 嵌合病毒全长cDNA克隆质粒的构建
参考PRRSV HB-1/3.9全基因组序列(GenBank收录号EU360130)与PRRSV  JXwn06全基因组序列(GenBank收录号EF641008)，设计引物用于PRRSV嵌合 毒株RvHBJX全长cDNA克隆的构建(表1)，引物由美国Invitrogen英杰生命技术 有限公司(Invitrogen，北京，中国)合成，用无核酸酶的水配成使用浓度。
表1 HBJX全长cDNA克隆构建用引物


注：横线处为限制性内切酶识别序列(包括两侧用来增加酶切效率的保护性碱基)； 引物序列用大写字母书写，表示以HB-1/3.9为模板进行PCR扩增，相应位置代表在 HB-1/3.9基因组中的位置；引物序列用小写字母书写，表示以JXwn06为模板进行 PCR扩增，相应位置代表在JXwn06基因组中的位置。
嵌合病毒RvHBJX全长cDNA克隆质粒的构建策略见图1。用PfuUltraTMII fusion  HS DNA Polymerase(高保真DNA聚合酶)(Stratagene,La Jolla,CA)扩增目的片段， 按照产品说明书构建50μL反应体系，扩增条件为：95℃2min，95℃30s，56-58℃ 30s，72℃2min。其中，以pWSK-JXwn为模板，JX-S2F/JX-S2R为引物，扩增JXwn06 的整个结构蛋白编码区，命名为HJSP-S2；以pWSK-HB-1/3.9为模板， HB-S1F/HB-S1R、HB-S3F/HB-S3R为引物，分别扩增HB-1/3.9结构蛋白编码区两侧 序列，命名为HJSP-S1、HJSP-S3。扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检查后，用 EasyPure Quick Gel Extraction Kit(北京全式金生物技术有限公司，北京，中国)试 剂盒进行纯化回收。以回收后的HJSP-S1，HJSP-S2，HJSP-S33个片段作为模板， HJ-fusionF/HJ-fusionR为引物，扩增HJSP-S123。HJSP-S123纯化后经Rsr II、Asc I 双酶切，连接到相同双酶切的pWSK-HB-1/3.9质粒中，连接产物转化入Trans5α感 受态细胞，菌落PCR鉴定单克隆菌，并送上海英俊生物技术有限公司进行序列测定。 序列测定验证正确的质粒命名为pW-HJSP。质粒的提取使用EasyPure Plasmid  MiniPrep Kit(全式金，北京，中国)试剂盒，获得的重组质粒经PCR和酶切鉴定后 用紫外分光光度计测定浓度，置-20℃保存。
全基因组序列测定表明，pW-HJSP质粒中结构蛋白编码区与JXwn06一致，而 其余骨架与HB-1/3.9一致，同时HB-1/3.9亲本拯救病毒的两个遗传标记Mlu I与Sfi  I酶切位点仍然存在，说明HB-1/3.9基因组中结构蛋白编码区已经成功地被JXwn06 相应区域替换。
实施例2 嵌合病毒RvHBJX的拯救
取15μg实施例1制得的pW-HJSP全长cDNA克隆质粒，用Rsr II、Pac I(NEB， 北京，中国)内切酶消化，37℃水浴过夜，使闭环质粒完全线性化。加入酚氯仿抽 提2-3次，无水乙醇沉淀，离心干燥后，加10μL无RNase水(Ambion,Texas,USA) 溶解沉淀，紫外分光光度计测定纯化后的质粒浓度。立即用Ambion公司的 High Yield Capped RNA Transcription kit进行体外转录。37℃水 浴反应2h后，加入1μL TURBO DNase I混匀，瞬时离心后37℃孵育15min，以消 化模板质粒DNA。
选择形态正常、生长旺盛的MARC-145细胞，胰酶消化后，以约106个/mL的 细胞密度转入六孔细胞培养板，每孔2mL。37℃、5％CO2、饱和湿度下培养过夜， 直至形成80％左右的单层细胞。小心吸出细胞培养上清，每孔加2mL平衡至室温的 I Reduced Serum Medium(Invitrogen Corporation,NY,USA)洗涤1-2次； 向无RNase的1.5mL eppendorf管中加入1mL平衡至室温的I Reduced  Serum Medium；将DMRIE-C脂质体(Invitrogen Corporation,NY,USA)涡旋混匀， 取10μL加入各管中，并涡旋混匀；向管中分别加入10μL全长mRNA，轻微地短暂 地涡旋混匀；立即将脂质体-RNA混合物转入长满80％左右的单层细胞，均匀覆盖； 同时设立pWSK-HB-1/3.9及pWSK-JXwn两个野生型作为对照。CO2培养箱37℃培 养4h后，小心吸出转染液，加入2mL 10％血清含量的生长培养基；每天观察细胞， 出现明显细胞病变(CPE)后，取培养上清接种长满的MARC-145细胞，连续传代 至12代，每代3-5d；并每天观察CPE。
在转染2-3d后，3组细胞均出现了PRRSV典型的CPE。将拯救的以HB-1/3.9 为骨架，置换了JXwn06结构蛋白的嵌合毒株命名为RvHBJX，即嵌合疫苗株。嵌合 病毒在MARC-145细胞上连续传代3次后出现的CPE情况，见图2。
实施例3 JXwn06结构蛋白在嵌合毒株RvHBJX中的表达
对嵌合病毒RvHBJX第3代病毒进行基因序列测定，结果显示，其结构蛋白编 码区与JXwn06的一致，未发生基因缺失或突变。
N蛋白是PRRSV基因组ORF7编码的一个非糖基化结构蛋白。将RvHBJX、 RvHB-1/3.9、RvJXwn P3代病毒分别接种MARC-145细胞，用PRRSV N蛋白单抗 进行免疫荧光试验，观察置换蛋白在嵌合病毒中的表达。嵌合病毒RvHBJX感染的 细胞浆内可见到明亮的黄绿色荧光，与亲本拯救病毒RvHB-1/3.9、RvJXwn相同， 对照细胞无可见的荧光(图3)。表明插入的结构蛋白在嵌合毒株中可以正确表达。
实施例4 嵌合病毒RvHBJX一步生长曲线的绘制
将RvHBJXP3毒株及亲本拯救病毒RvHB-1/3.9、RvJXwn以0.01MOI剂量接种 MARC-145及PAM细胞，每隔12h取上清测定其TCID50值，绘制病毒在宿主细胞 的一步生长曲线。
RvHBJX在感染MARC-145细胞后96h达到增殖高峰，较亲本拯救毒株RvJXwn (72hpi)延迟24h，见图4的A图，但各时相的病毒滴度差异不显著(P＞0.05)； 在感染36h内，其病毒滴度一直显著高于RvHB-1/3.9(P＜0.05)。
各拯救病毒均在感染PAM细胞后48h到达增殖高峰，见图4的B图。RvHBJX 在感染早期的增殖速度比RvHB-1/3.9快，且在24hpi时呈显著性差异(P＜0.05)。 各拯救病毒在感染PAM后早期的增殖能力为RvJXwn＞RvHBJX＞RvHB-1/3.9。以 上结果表明，嵌合毒株RvHBJX在不同的宿主细胞上具有与亲本毒株相同的增殖动 态曲线，病毒增殖能力差异不大。
实施例5 嵌合病毒RvHBJX的体外连续传达及其基因组变异分析
将嵌合毒株RvHBJX P3种毒1mL接种于生长良好的MARC-145细胞单层，37℃ 孵育1h后加入5％DMEM培养液，培养3-5d，至约80％细胞出现CPE时收获病毒， 反复冻融3次；取细胞冻融液1mL，重复以上步骤，进行传代，直至传至80代(P80)。
分别测定嵌合毒株P5-P80的TCID50，并选取P5、P10、P20、P30、P40、P60和 P80进行全基因组序列测定，全基因组测序用引物序列见表2，引物由上海英骏生物技 术有限公司合成。扩增获得的目标基因送华大基因测序。运用DNASTAR，Clustaxl， Genedoc等生物信息软件对嵌合病毒各代次毒株的全基因组核苷酸序列及推导的氨基 酸序列进行分析。
表2 HBJX全基因组序列扩增引物

病毒滴度测定结果见表3。嵌合病毒RvHBJX在MARC-145细胞上连续传代80 次后，病毒滴度由第5代的104.5TCID50/mL升高至107.51TCID50/mL。经过多次连续 的体外传代，嵌合病毒的细胞适应能力显著提高。
表3 PRRSV嵌合毒株RvHBJX不同代次毒株的滴度测定(TCID50/mL)

对PRRSV嵌合毒株HBJX各代次全基因组核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进 行比对。P3结构蛋白编码区与JXwn06一致，除含有HB-1/3.9的两个遗传标记外， 其余基因均与HB-1/3.9相同；P5在ORF2a的12258位核苷酸发生点突变，为同义 突变；P10在P5点突变的基础上又有4个核苷酸发生点突变，其中2个为同义突变； P20在P10点突变的基础上又有6个核苷酸发生点突变，其中3个为同义突变；P30 在P20点突变的基础上有1个点发生点突变，P40在P30点突变的基础上又有9个 点发生突变，其中6个为同义突变。
表4 PRRSV嵌合病毒RvHBJX P1-P40全基因组序列变化分析


进一步对RvHBJX P40、P60和P80全基因组序列进行比对分析，结果显示，P60 与P40相比，增加了10个核苷酸位点的点突变，其中8个为同义突变，以及Nsp2 第279位的氨基酸V→A和3’-UTR第116位氨基酸V→L。P80在P60的基础上新 增8个核苷酸位点的突变，其中5个为同义突变，及Nsp2第543位的氨基酸L→P、 Nsp5第139位氨基酸A→L和Nsp12第76位氨基酸C→A(表5)。
表5 PRRSV嵌合病毒HBJX P40-P80全基因组序列变化分析


实施例6 嵌合病毒RvHBJX P5、P20、P40感染仔猪的致病性试验
将20头28日龄SPF猪随机分为4组，每组5头。分别为嵌合病毒P5感染组， 嵌合毒株P20感染组、嵌合毒株P40感染组及对照组。4个试验组在不同的动物房 内隔离饲养。感染组经滴鼻接种2mL 2×105TCID50病毒液，对照组接种2mL的 5％DMEM培养基，每日观察实验仔猪的临床症状、记录体温及体重变化，连续观察 至试验结束。同时，分别于感染后0、3、5、7、10、14、21、28d采集各实验猪血 液及感染猪鼻腔拭子。将分离到的血清样本10倍梯度稀释后接种MARC-145细胞， 观察CPE，记录各稀释度CPE的孔数，根据Reed-Müench方法计算感染仔猪血液中 病毒的TCID50；处理后的鼻腔拭子用RT-PCR方法检测样本中的病毒核酸，分析感 染仔猪的排毒情况。试验结束时剖杀所有猪只，观察其肺脏、淋巴结、大脑等组织 的大体病变，并选取肺脏、下颌淋巴结组织制成石蜡切片，免疫组化染色法分析各 组织中的病毒抗原分布。
1、感染仔猪的临床症状、体温及日增重变化
嵌合毒株P5感染组仔猪表现皮肤苍白、明显的腹式呼吸、厌食、消瘦、犬坐姿 势、流涕；感染24h后体温开始升高，最高可达41℃；在感染15d后相继死亡。P20 感染组猪只偶而出现精神沉郁、腹泻；体温在感染后6、10、11d升高至40℃，试 验过程中未见猪只死亡。P40感染组仔猪在试验过程中未观察到明显症状；体温仅在 感染后6d和13d升高到40℃以上，感染仔猪全部存活。未感染对照猪至试验结束 临床与体温均未见异常。试验猪体温变化见图5A。感染仔猪日增重变化如图5B所 示，RvHBJX P5感染组在死亡前体重下降，日增重呈现负增长。P20感染组和P40 感染组仔猪感染后体重逐渐升高，每只猪平均日增重大约300g，与对照组没有差异。
2、感染仔猪大体剖检变化
嵌合病毒RvHBJX P5感染组仔猪剖检可见水肿及间质性肺炎等，以及心包积 液、大脑出血、淋巴结出血和肿大等；试验结束时剖杀存活仔猪，P20感染组可见肺 脏弥散性坏死、下颌/腹股沟淋巴结充血肿大；P40感染组仔猪肺脏、淋巴结等无明 显肉眼可见病变。对照组仔猪肺脏、淋巴结等组织无可见病变。
3、感染仔猪病毒血症、鼻腔排毒及其组织中的病毒分布
在不同时间点采集仔猪血清样本，应用RT-PCR检测样本中的病毒核酸，分析仔 猪病毒血症持续情况，结果见表6。P5感染组仔猪在5DPI病毒血症均转为阳性， 全部死亡前的21d仍有1头猪病毒血症未转阴；P20和P40感染组均从7DPI开始 病毒血症全部转为阳性，28DPI全部转为阴性。对照组仔猪病毒血症均为阴性。
表6 仔猪血清中病毒核酸的RT-PCR检测结果

注：分母表示检测样品数，分子表示阳性数，“—”表示未检测
应用RT-PCR，对同时采集的鼻拭子进行病毒核酸检测，分析感染仔猪鼻腔排毒 情况(表7)。P5感染组在3DPI开始有仔猪鼻腔排毒呈阳性，排毒一直持续到14DPI 转为阴性；P20感染组仔猪在5DPI开始鼻腔排毒呈阳性，与P5同样一直持续到14 DPI；P40感染组仔猪在试验过程中未检测出鼻腔排毒。
表7 仔猪鼻腔排毒检测结果

注：分母表示检测样品数，分子表示阳性数，“—”表示未检测
采集仔猪肺脏及下颌淋巴结，制成石蜡切片，进行免疫组化染色，观察PRRSV 抗原在感染仔猪组织中的分布，结果见图6。
参照Halbur等的方法对免疫组化结果进行评分，即随机选取5个视野，按照 PRRSV阳性细胞数计平均值：无PRRSV阳性细胞为0分；1-10个阳性细胞计为1 分；11-30个阳性细胞计为2分；31-100个阳性细胞计为3分；多于100个阳性细胞 计为4分。嵌合病毒不同代次毒株感染仔猪的免疫组化打分情况见表8。由表中可以 看出，随着嵌合病毒传代次数增多，感染仔猪组织中的病毒抗原呈减少趋势。
表8 感染仔猪肺脏及下颌淋巴结PRRSV抗原的免疫组化评分结果

随着嵌合病毒RvHBJX在细胞上传代至20代及以上，病毒感染引起的临床症状 及组织器官的大体病变均逐渐减轻；病毒血症持续时间亦逐渐缩短；病毒在肺脏及 淋巴结组织中的含量也逐渐降低；至40代已检测不到明显的鼻腔排毒；除了P5感 染仔猪能够引起猪只死亡外，P20及P40均未发现仔猪死亡，且不影响仔猪的正常生 长及采食。仔猪致病性试验结果表明，随着细胞传代次数的增加，嵌合病毒对仔猪 的安全性也逐渐增加。
实施例7 嵌合毒株RvHBJX P40、P60、P80的免疫保护效果评估
在致病性试验的基础上，本发明选择RvHBJX病毒P40、P60、P80毒株人工感染 仔猪，分析比较其对高致病性PRRSV感染的免疫保护性，以评估PRRSV RvHBJX作 为基因嵌合疫苗的可行性，为筛选安全性好、保护性高的PRRSV嵌合疫苗候选株提 供参考数据。将2mL 2×105TCID50PRRSV RvHBJX P40，P60，P80滴鼻接种4周龄 仔猪，对照组试验猪接种2mL DMEM培养液，4周后感染相同剂量的高致病性PRRSV  JXwn06P8，21d后剖检所有存活猪。观察仔猪临床症状及肺脏病理变化，记录其体 温及日增重情况，检测感染仔猪的病毒血症及鼻腔排毒情况，分析PRRSV RvHBJX 细胞传代毒株对感染仔猪的免疫保护性。
1、免疫仔猪攻毒后体温变化、临床症状及死亡情况
免疫后至JXwn06攻毒前，所有猪的食欲及精神状态均正常，未观察到明显临床 症状，体温保持在39.5-40.4℃之间。攻毒后4-11d与13d，对照组试验猪的平均体 温高于41.0℃，其中有2头猪体温在攻毒后第5d、7d和9d超过42.0℃；RvHBJX  P40免疫组攻毒后6-12d有2头猪体温高于41.0℃，其中1头猪在攻毒后6d和11d 时体温超过42.0℃，20d后所有猪体温均降至40.0℃以下。RvHBJX P60免疫组攻毒 后6-10d有2头猪体温高于41.0℃，17d后所有猪体温下降到40.0℃以下。RvHBJX  P80免疫组攻毒8d后有3头猪体温升高到41.0℃以上，16d后所有猪体温均降至 40.0℃以下(图7A)。
PRRSV JXwn06感染4d后，对照组猪开始出现喘气、精神沉郁、食欲减退等症 状。攻毒9d后，开始死亡，死前表现食欲废绝、精神沉郁、趴卧、皮肤发绀、被毛 粗乱、呼吸困难、震颤等。RvHBJX P40免疫组在攻毒11d后有3头猪出现呼吸急 促，食欲减退，18d后恢复正常；RvHBJX P60免疫组在攻毒7d后有2头猪出现流 鼻涕、腹式呼吸、采食量减少，13d后症状逐渐减轻，15d后恢复正常。RvHBJX P80 免疫组在攻毒后8-12d只有1头猪出现流鼻涕、精神沉郁、食欲减退等症状。
按照Li等制定的临床症状评分标准为实验仔猪打分(Li Y,et al.2014.Nsp9and  Nsp10 contribute to the fatal virulence of highly pathogenic porcine reproductive and  respiratory syndrome virus emerging in China.PLoS Pathog.)，其中猪只死亡加25分， 具体评分结果见图7B。攻毒后第11d直至试验结束，对照组临床评分与RvHBJX P40、 P60和P80免疫组相比均存在显著性差异(P<0.05)。攻毒后第18-21d，RvHBJX P40 免疫组临床症状评分显著高于RvHBJX P60、P80免疫组(P<0.05)。
对照组于攻毒后9d、12d、13d各有1头猪死亡，16d时全部死亡；RvHBJX P40 免疫组在攻毒后12d和19d各有1头猪死亡；至试验结束时，P60免疫组和P80免 疫组试验猪全部存活(图8)。
攻毒前后试验猪日增重情况见图9。攻毒前，4组试验猪平均日增重在0.19-0.29kg 之间，差异不大。攻毒后，对照组试验猪出现食欲减退甚至废绝，导致体重减轻， 至死亡前的平均日增重仅为0.04kg；而P40免疫组，P60免疫组和P80免疫组的平 均日增重分别为0.14kg，0.22kg和0.26kg，与对照组相比均差异显著(P<0.05)。
2、免疫仔猪攻毒后鼻腔排毒及病毒血症的检测
攻毒后3-7d所有猪均可检测到鼻腔排毒。攻毒后10d，对照组仔猪鼻腔排毒仍 然全部为阳性，而RvHBJX P40免疫组，P60免疫组和P80免疫组鼻腔排毒检测阳性 率依次为1/4，2/4和2/5。攻毒后14d，P80免疫组鼻腔排毒全部转为阴性；对照组、 P40免疫组和P60免疫组各有1头猪检测结果呈阳性。攻毒后21d，3个免疫组仔猪 鼻腔排毒均转阴(表9)。
表9 攻毒后仔猪鼻拭子中病毒核酸检测结果

所有仔猪在攻毒3d后即能检测到病毒血症。对照组仔猪病毒血症状态一直持续 至死亡前。攻毒后10d，P80免疫组1头猪病毒血症消失；攻毒后14d，P40、P60 和P80免疫组猪血清中的病毒核酸检出率分别是33％(1/3)，50％(2/4)和40％(2/5)。 至21d试验结束时，所有免疫组仔猪的病毒血症均消失(表10)。
表10 攻毒后仔猪病毒血症检测结果


将上述病毒核酸检测阳性的血清接种到MARC-145细胞上，测定血清中的病毒 滴度(图10)。攻毒后5d，对照组仔猪血清中的病毒滴度可达105.13TCID50/mL，之 后逐渐降低，14d时降低到102.07TCID50/mL。P40、P60和P80免疫组仔猪血清中 的病毒滴度始终低于对照组，且在5d、10d、14d时差异显著(P＜0.05)。3个免疫 组之间没有明显差异。
3、免疫仔猪攻毒后肺脏病理变化及病毒核酸的组织分布
攻毒后死亡的猪立即剖检。攻毒后21d剖检全部存活试验猪，观察肺脏病理变 化，并参照Halbur制定的肺脏病变评分标准进行打分(Halbur et al.,1995)。对照组 死亡猪肺脏病变较为严重，可观察到大面积实变、坏死、充血、间质性肺炎等。各 免疫组的肺脏病变相对均较轻，仅肺大叶和肺小叶边缘部位发生实变，其病变评分 也显著低于对照组(P＜0.05)(表11)。
表11 各组肺脏病变评分结果

a与对照组相比差异显著(P＜0.05)
采集仔猪肺脏、下颌淋巴结、腹股沟淋巴结、扁桃体、肾脏、脾脏、脑等组织， RT-PCR法检测各组织中的PRRSV核酸。P40，P60，P80免疫组仔猪组织带毒率分 别为36.14％(9/28)，17.86％(5/28)14.29％(5/35)，与对照组相比差异显著(P＜ 0.05)。其中，P40免疫组和P80免疫组之间亦差异显著(P＜0.05)(表12)。
表12 组织器官中的病毒核酸检测情况

a,b不同字母之间表示差异显著
综上所述，PRRSV嵌合毒株RvHBJX P40、P60和P80细胞传代毒株免疫仔猪 后均能减轻感染仔猪的临床症状，降低感染仔猪血清中的病毒载量，显著降低仔猪 的死亡数量，减轻病毒感染造成的肺脏损伤。其中，PRRSV嵌合毒株RvHBJX P60 能够为高致病性PRRSV感染仔猪提供100％的免疫保护，可以作为PRRSV基因嵌 合疫苗的候选株进行后续的疫苗开发。
经动物安全性试验及攻毒保护性试验证明，本发明所获得的猪繁殖与呼吸综合 征嵌合疫苗HBJX接种仔猪后不会引起明显的临床症状，作为疫苗使用的安全性较 好；并能够为感染仔猪提供较好的免疫保护，减轻高致病性PRRSV感染带来的危害。 该嵌合疫苗的病毒骨架来源于临床分离的自然低致病性PRRSV HB-1/3.9毒株，避免 了弱毒疫苗株毒力易返强的风险，同时，毒株中置入的高致病性PRRSV毒株结构蛋 白编码区在接种后也能够刺激机体产生针对流行毒株的中和抗体，提高了该疫苗的 免疫保护效力。此外，嵌合疫苗HBJX序列中人为引入的2个遗传标记也为疫苗株 与自然感染毒株的鉴别诊断提供了明确靶点，该嵌合疫苗的应用将有利于我国猪群 PRRS的净化。
本发明所提供的嵌合病毒的构建方法获得的拯救病毒能够在体外连续传代，其 遗传学特性较为稳定。所以此拯救病毒能够作为有效的科研材料进行与PRRSV结构 蛋白功能相关的科研研究。