一种光水解核酶及其制备和应用.pdf

本发明公开一种光水解核酶及其制备和应用,涉及一种寡核苷酸分子。该方法利用核酸分子进化技术,从寡核苷酸核酸文库中筛选出一种核酶,能在太阳光下催化水分解成氢气和氧气；以及专用于该核酶分解水的设备。该方法利用寡核苷酸文库筛选分解水的核酶，核酶的准确率高，特异性强，活性强、稳定、能够重复利用；所述设备专用于核酶催化水分解成氢气和氧气，结构精巧、制备方法简单，材料易得，使得成本低效率高；核酶催化水分解成的氢气和氧气作为能源属清洁能源，符合国家能源政策。

权利要求书
1.  一种光水解核酶，其特征在于：光水解核酶为序列表SEQ ID No.1 中的核酸序列所示。

2.  如权利要求1所述一种光水解核酶的制备，其特征在于：
（1）核酶光水解反应体系：在10ml测定溶解氧的溶液中加入琼脂0.5克，微波加热3分钟；加入100μl水溶解的1 OD的寡核苷酸文库摇匀；将其倒入平铺平皿中，厚度在2mm，待冷却后形成固体核酶光水解反应体系；
（2）反应：将阳性反应平皿放入太阳下光照，阴性反应液放入避光处，反应6小时；
（3）筛选：将阴阳反应体系中蓝点做对比，并挑出阳性体系中的蓝点；
（4）提取蓝点琼脂中的寡核苷酸，并通过聚合酶链式反应扩增寡核苷酸为次级文库；
（5）将次级库重复1-4步骤3至12轮，得到富集的次级文库；
（6）将次级库转入质粒中，再转染大肠杆菌，挑取阳性克隆测序即为序列表SEQ ID No.1 中的核酸序列所示的光水解核酶。

3.  如权利要求1所述一种光水解核酶应用于催化分解水的方法，其特征在于：所述反应条件为：在太阳光照射6-8小时，核酶催化水分解成氢气和氧气的反应方程式为：                                                。

4.  如权利要求3所述一种光水解核酶应用于催化分解水的设备，其特征在于：主要包括光化反应板（1）、气体压缩器（2）、固定支撑（3）、进出水管线器（4）；气体压缩器（2）由固定支撑（3）连接固定；所述光化反应板（1）倾斜放置通过进出水管线器（4）与气体压缩器（2）连接，光化反应板（1）的上端连接两个进出水管线器（4），一个进出水管线器（4）连接于气体压缩器（2）的底部，另一个进出水管线器（4）连接于气体压缩器（2）的顶部；光化反应板（1）的底端设置有排污开关（7）。

5.  如权利要求4所述一种光水解核酶应用于催化分解水的设备，其特征在于：所述光化反应板（1）由两层粗面玻璃板形成一个具有内部空腔的结构，该空腔内由一层粗面玻璃板即中间层将其分隔成为一个三层两腔结构；所述形成空腔的粗面玻璃板板壁内侧附着一层核酶（8）；中间层为透光板两面各附着一层核酶（8）。

6.  如权利要求4所述一种光水解核酶应用于催化分解水的设备，其特征在于：所述光化反应板（1）为透光玻璃板。

说明书一种光水解核酶及其制备和应用
技术领域
本发明涉及一种核酶，该酶利用太阳能催化分解水产生氢气和氧气，以及利用该酶生产氢气和氧气的仪器设备，具体地说是一种光水解核酶及其制备和应用。
背景技术
经典观念，是人类对核酶化学本质认识的飞跃，启发了生物化学家从进化角度思考研究生命起源问题，补充和发展了“中心法则”。核酶（Rz）广泛存在于由低等到高等的多种生物中。
脱氧核酶（DRz）是利用体外分子进化技术获得的一种具有高效催化活性和结构识别能力的单链DNA片段。体外分子进化技术，从一个人工合成的随机多核苷酸单链DNA库中筛选出具有酶活性的DNA分子,称为脱氧核酶.
脱氧核酶的体外筛选Breaker等［1］根据SELEX技术的原理建立了以PCR为基础的体外“催化洗脱”筛选系统。首先合成一个随机的多核苷酸单链DNA库，随机库的两端为固定序列，中间为50-100个随机核苷酸。以此随机单链库为模板，用一个RNA-DNA杂合分子作为引物，在逆转录酶的催化下，将单链库转变为双链库，此双链库就引入了RNA 靶序列，RNA的引入是一个关键步骤，这样就把潜在的催化型 DNA与RNA分子连在一起，从而进行以分子内切割为基础的选择反应。RNA 的引入是由一个人工合成的RNA-DNA 杂合分子介导的，这杂合分子的特征是：12-15个核苷酸的 RNA的5’端有一个固定序列，其3’端含有一个互补于模板3’端的序列。另外，这一杂合引物的5’端还含有一个生物素基团，用于以后的亲和柱分离。
接着将双链随机库核酸分子通过链亲和素柱，通过生物素基团结合于链亲和素柱上，经碱变性，洗脱下不含生物素的一条单链 DNA，从而产生了一个固相化的单链随机寡核苷酸库。在一定的温度和pH下，用一定的离子缓冲液洗脱柱子，若有切割反应发生，被切割的分子就被洗脱下来。再经PCR放大和亲和分离，可重新回到与起始库类似的随机库，从而完成了第一轮筛选。经过10多轮筛选即可产生具有催化功能的分子。再对功能分子进行克隆及测序，并由此推测其二级结构。
随着越来越多的脱氧核酶被筛选出，对其功能性质的研究也随之深入，发现脱氧核酶具有RNA切割作用、DNA切割作用、金属螯合作用和过氧化物酶活性、DNA激酶活性以及DNA连接酶活性等多种催化功能。
本发明采用SELEX的体外分子进化技术，从文库筛选到能在太阳光下催化水产生氢气和氧气的核酶。 
发明内容
本发明的目的是提出一种光水解核酶及其制备和应用，使水分解成氢气和氧气的方法及其装置。
为实现上述目的，本发明所述一种光水解核酶，光水解核酶为序列表SEQ ID No.1 中的核酸序列所示。
所述光水解核酶的制备，实现方法如下：
（1）核酶光水解反应体系：在10ml测定溶解氧的溶液中（碘量法：GB7489-87）加入琼脂0.5克，微波加热3分钟；加入100ul水溶解的1 OD的寡核苷酸文库（十的十二次方个分子数）摇匀；将其倒入平铺平皿中，厚度在2mm，待冷却后形成固体核酶光水解反应体系；
（2）反应：将阳性反应平皿放入太阳下光照，阴性反应液放入避光处，反应6小时；
（3）筛选：将阴阳反应体系中蓝点做对比，并挑出阳性体系中的蓝点；
（4）提取蓝点琼脂中的寡核苷酸，并通过聚合酶链式反应（PCR）扩增寡核苷酸为次级文库；
（5）将次级库重复1-4步骤3至12轮，得到富集的次级文库；
（6）将次级库转入质粒中，再转染大肠杆菌，挑取阳性克隆测序即为序列表SEQ ID No.1 中的核酸序列所示的光水解核酶。
本发明所述一种光水解核酶的检测鉴定方法如下：
（1）核酶的制备：将上述光水解核酶的制备步骤（6）中的阳性克隆提取质粒，利用不对称PCR方法制备单链，升温至95度迅速降温至4度，促使单链形成稳定的空间结构和核酶活性；
（2）检测反应体系配制：在10ml测定溶解氧的溶液中（碘量法：GB7489-87）加入琼脂0.5克，微波加热3分钟；加入100ul水溶解的1 OD的核酶，摇匀；将其倒入平铺平皿中，厚度在2mm，待冷却后形成固体核酶光水解检测反应体系；
（3）检测：平行制备两个含待检测的核酶反应检测体系，一个放入太阳下光照，阴性反应液放入避光处，反应6小时；
（4）评定：将阴阳反应体系中蓝点的大小和数量做对比，并对阳性核酶作鉴定。
所述光水解核酶,其特征在于：所述光水解核酶是由脱氧核糖及四种含氮碱基组成的DNA,以及由核糖及四种含氮碱基组成的RNA，具有利用光能催化水分解成氢气和氧气的功能，同时具有特征稳定空间结构的核酸酶。
所述核酶光水解反应体系是指将核酸文库中的核酸分子分散于可检测溶解氧的水凝胶体系中，便于鉴别微小空间氧气的产生和分离。
所述核酶的制备方法是利用文库中单一核酸分子可通过聚合酶链式反应得到扩增富集。
所述一种光水解核酶应用于催化分解水的方法，其特征在于：所述反应条件为：在太阳光照射6-8小时，核酶催化水分解成氢气和氧气的反应方程式为：
      。
    所述一种光水解核酶应用于催化分解水的设备，其特征在于：主要包括光化反应板、气体压缩器、固定支撑、进出水管线器；气体压缩器由固定支撑连接固定；所述光化反应板倾斜放置通过进出水管线器与气体压缩器连接，光化反应板的上端连接两个进出水管线器，一个进出水管线器连接于气体压缩器的底部，另一个进出水管线器连接于气体压缩器的顶部；光化反应板的底端设置有排污开关；所述光化反应板内设置有双层反应管，能够利用光能分解水成氢气和氧气，气体上升通过连接于气体压缩器顶部的进出水管线器进入气体压缩器，同时冷水从排污开关排出；在气体压缩器的底部设置有进出水管线器，该进出水管线器另一端接三通分别连接排污阀和通过进出水管线器连接水箱。
所述光化反应板由两层粗面玻璃板形成一个具有内部空腔的结构，该空腔内由一层粗面玻璃板即中间层将其分隔成为一个三层两腔结构；所述形成空腔的粗面玻璃板板壁内侧附着一层核酶；中间层为透光板两面各附着一层核酶，如图2所示。
所述光化反应板为透光玻璃板。
所述设备内有核酶和水，经太阳照射后，酶催化水分解成氢气和氧气，以及水的补充渠道和氢气、氧气传出渠道。
所述光化反应板为能够接受太阳能和核酶、水的反应容器，并具有抗溶、抗暴、抗酸材料。
本发明所述光水解核酶制备氢气和氧气的工艺方法及设备，其有益效果在于：该方法利用寡核苷酸文库筛选分解水的核酶，核酶的准确率高，特异性强，活性强、稳定；所述设备专用于核酶催化水分解成氢气和氧气，结构精巧、制备方法简单，材料易得，使得成本低效率高；核酶催化水分解成的氢气和氧气作为能源属清洁能源，符合国家能源政策。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的其中一个实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的结构示意图；
1-光化反应板、2-气体压缩器、3-固定支撑、4-进出水管线器、5-水箱、6-排污阀、7-排污开关；
图2为光化反应板原理图；
8-核酶；
图3为核酶空间结构示意图；
图4为核酶空间结构示意图；
图5为核酶空间结构示意图；
图6为核酶空间结构示意图；
图7为核酶空间结构示意图；
图8为核酶空间结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的其中一个实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种光水解核酶，光水解核酶为序列表SEQ ID No.1 中的核酸序列所示。
序列表SEQ ID No.1为：
1007---
TATAGCAATGGTACGGTACTTCCTCATTTTCGGTTGGCTAGTTCCTACTGGGTTTTCAGTTCCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
1010----
TATAGCAATGGTACGGTACTTCCTCGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCGCTGGTCATCCCACAGCTACGTCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
(a) 序列特征：
长度：85bp
类型：核酸序列
链型：单链
拓扑结构：线性
(b) 分子类型：核酸
(c)最初来源：在设定的特殊环境下，从随机寡核苷酸文库筛选获得。
空间结构：RNAstructure 3.71软件分析的二级结构。
实施例2
一种光水解核酶的制备：
（1）核酶光水解反应体系：在10ml测定溶解氧的溶液中（碘量法：GB7489-87）加入琼脂0.5克，微波加热3分钟；加入100ul水溶解的1 OD的寡核苷酸文库（十的十二次方个分子数）摇匀；将其倒入平铺平皿中，厚度在2mm，待冷却后形成固体核酶光水解反应体系；
（2）反应：将阳性反应平皿放入太阳下光照，阴性反应液放入避光处，反应6小时；
（3）筛选：将阴阳反应体系中蓝点做对比，并挑出阳性体系中的蓝点；
（4）提取蓝点琼脂中的寡核苷酸，并通过聚合酶链式反应（PCR）扩增寡核苷酸为次级文库；
（5）将次级库重复1-4步骤3至12轮，得到富集的次级文库；
（6）将次级库转入质粒中，再转染大肠杆菌，挑取阳性克隆测序即为序列表SEQ ID No.1 中的核酸序列所示的光水解核酶。
实施例3
一种光水解核酶的检测鉴定方法如下：
（1）核酶的制备：将上述光水解核酶的制备步骤（6）中的阳性克隆提取质粒，利用不对称PCR方法制备单链，升温至95度迅速降温至4度，促使单链形成稳定的空间结构和核酶活性；
（2）检测反应体系配制：在10ml测定溶解氧的溶液中（碘量法：GB7489-87）加入琼脂0.5克，微波加热3分钟；加入100ul水溶解的1 OD的核酶，摇匀；将其倒入平铺平皿中，厚度在2mm，待冷却后形成固体核酶光水解检测反应体系；
（3）检测：平行制备两个含待检测的核酶反应检测体系，一个放入太阳下光照，阴性反应液放入避光处，反应6小时；
（4）评定：将阴阳反应体系中蓝点的大小和数量做对比，并对阳性核酶作鉴定。
实施例4
一种光水解核酶应用于催化分解水的方法如下：
所述反应条件为：在太阳光照射6小时，核酶催化水分解成氢气和氧气的反应方程式为：
      
实施例5
一种光水解核酶应用于催化分解水的设备，主要包括：光化反应板1、气体压缩器2、固定支撑3、进出水管线器4；气体压缩器2通过固定支撑3连接固定；光化反应板1倾斜放置通过进出水管线器4与气体压缩器2连接，光化反应板1的上端连接两个进出水管线器4，一个进出水管线器4连接于气体压缩器2的底部，另一个进出水管线器4连接于气体压缩器2的顶部；光化反应板的底端设置有排污开关7；光化反应板1内设置有三层两腔结构，能够利用光能分解水成氢气和氧气，气体上升通过连接于气体压缩器2顶部的进出水管线器4进入气体压缩器2，同时冷水从排污开关7排出；在气体压缩器的底部设置有进出水管线器4，该进出水管线器4另一端接三通分别连接排污阀6和通过进出水管线器4连接水箱5；光化反应板1由两层粗面玻璃板形成一个具有内部空腔的结构，该空腔内由一层粗面玻璃板即中间层将其分隔成为一个三层两腔结构；所述形成空腔的粗面玻璃板板壁内侧附着一层核酶8；中间层为透光板两面各附着一层核酶8；该设备运行时，水箱5内的水通过进出水管线器4流入气体压缩器2、光化反应板1，经太阳照射后，光化反应板1内的核酶8催化水分解成氢气和氧气，气体通过进出水管线器4再进入气体压缩器2往复循环，当气体压缩器2中的水过多时能够通过排污阀6与排污开关7进行调节。
 序列表
1007---
TATAGCAATGGTACGGTACTTCCTCATTTTCGGTTGGCTAGTTCCTACTGGGTTTTCAGTTCCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
1010----
TATAGCAATGGTACGGTACTTCCTCGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCGCTGGTCATCCCACAGCTACGTCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA