BEX1和LMO2及SNF5的相互作用及其对神经元细胞的增殖影响 技术领域：
本发明为利用酵母双杂交及共纯化、免疫共沉淀等技术发现并证实了这三个蛋白间的相互作用，并通过Northern、原位杂交、转染、激光共聚焦共定位技术、流式细胞技术、EMSA、等技术确定了SNF5通过BEX1影响LMO2在细胞中的功能，对于揭示神经系统中海马细胞增殖的分子生物学有重大意义，对短期记忆和学习的生理生化基础是一个重大发现。同时，也为其可能的异常情况奠定了相对的基因治疗理论基础。本发明涉及生物医学高技术中新方法、新基因、新蛋白的开发与应用领域。
发明背景：
神经系统是动物(人)最为复杂地结构，而学习和记忆又是高等动物所特有的功能，这一功能的行使需要更为复杂的结构来支持。海马是短期记忆的结构基础，其神经元与脑内其他部位的神经元不同，具有不断增殖和迁移的特征，而这一特征被认为与学习和记忆相关。
BEX1是近年来发现的脑和睾丸特异表达，定位于Xq22染色体上的，124个氨基酸的小蛋白。其同家族成员有BEX3和BEX2。BEX3被认为参与P75NTR及14-3-3的凋亡信号途径，但BEX1与BEX3仅有18.65％的一致性。
LMO2是重要的原癌蛋白，其在白细胞中错误的表达可引起急性白血病。文献表明，转LMO2基因小鼠因此单一因素即导致白血病。LMO2还是实质瘤发生的必须因素之一，因为LMO2对于血管内皮的发生是必须的，因此，可作为肿瘤治疗的靶蛋白，具有潜在的基因治疗开发意义。LMO2在神经系统特异的表达于海马，但其在神经系统的功能知之甚少。
SNF5又称为INI1，BAF47，是SWI/SNF复合体的共有组分。SWI/SNF复合体是近年来的研究热点之一，它可依赖水解ATP打开核小体八聚体。与其他的remodeling complex不同的是，这一复合体具有不确定性，即，它是根据“需要”的，由此，可使其他的蛋白发挥活性，如DNA的修复，或是转录等。SNF5被认为是转录因子的结合者，许多文献表明，SNF5与一些转录相关因子结合后，可促进其功能。SNF5的缺失可导致儿童多发性肿瘤(MRT)因此许多文献认为其是抑癌基因。SNF5及SWI/SNF复合体的功能如今正被研究的日益深入，已经在高等动物中发现了这一复合体的多个“版本”，而本发明即是发现了此复合体在人和小鼠的海马神经元中的一个新“版本”。
发明目的：
通过原位杂交发现了BEX1在中枢神经系统中的特异表达-以海马最高；通过酵母双杂找到了另一在海马特异表达的基因LMO2。此外还发现了其上游作用分子SNF5，这对于阐明海马--这一学习和短期记忆的重要物质基础--的分子机理有重大理论意义。
由于发现了BEX1的增殖作用，则其错误的表达很可能导致癌的发生。其三者(BEX1、LMO2、SNF5)的相互作用是海马中特有和正常的，如其异常，亦可导致疾病的发生。虽然目前尚无这类病例的发现，但一旦出现，可为其相映的基因治疗提供靶向治疗。
长远来看，这一发明对于阐明学习和记忆的分子基础是一个崭新的视角，可能具有潜在的巨大的研究和开发前景。
内容与要求：
在高等哺乳动物中枢神经系统的学习和短期记忆的物质基础—海马中发现了一个新的SWI/SNF复合体，这一复合体中含有BEX1和LMO2。而且，BEX1对于培养细胞有促进增殖的功能。这一功能因它和LMO2这一重要的原癌蛋白的相互作用以及SNF5的促进转录功能得以解释。
这一发明涉及以下几个实验结果：
1.原位杂交对BEX1的表达部位的描述，
2.Northern印记杂交对小鼠胚胎不同时期及成熟后的表达量的比较，
3.BEX1对SNF5的pull-down，
4.BEX1对LMO2的pull-down，
5.BEX1和LMO2及SNF5的激光共聚焦亚细胞共定位。
6.应用流式细胞技术检测S-phase increment，
7.BEX1参与LMO2在EMSA中的超迁移分析，
8.LMO2和SNF5在海马细胞的免疫共沉淀。
以上所述及的实验内容和结果也即本发明的技术指标。
附图说明：
图1.
BEX1与BEX3的序列比较，两蛋白的一致性为18.6％
图2.
BEX1的全胚胎原位杂交左图为正义探针杂交结果，为对照，右图为反义探针杂交结果，可见BEX1在中枢神经系统特异表达，特别是前脑和侧脑。在菱脑也有表达。
在脊髓有低量表达。
图3.
BEX1的中枢神经系统切片原位杂交
a.b.海马40倍，c.海马100倍，d.顶叶皮层40倍，e.颞叶皮层40倍，f.桥脑面神经核40倍，g.桥脑其他核团40倍，h.小脑蒲肯野细胞40倍，i.颈髓前脚运动神经元，j.胸髓后脚神经元
图4.
Northern印迹杂交
泳道1、2：10天胚胎，3、4：12天胚胎，5、6：14天胚胎，7、8：16天胚胎，9：成年鼠脑
a.BEX1基因，b.LMO2基因，c.ACT-B基因
图5.
免疫荧光激光共聚焦共定位
a.BEX1的亚细胞定位b.LMO2的亚细胞定位c.重叠
d.BEX1的亚细胞定位e.SNF5的亚细胞定位f.重叠
图6.
Pull-down分析SNF5与BEX1的相互作用
CK0是M17细胞转染空载体，CK1是细胞转染SNF5-Myc，为分析非特异结合，空sephrose和GST-sephrose亦对转染SNF5-Myc的细胞裂解液进行Pull-down(CK2和CK3)。CK4为流过液，
箭头所指为SNF5-Myc。
图7.
Pull-down分析BEX1与LMO2的相互作用
CK1为sephrose4B-GST-hBEX1。因BEX1与LMO2的分子量大小相似，为分析是否交叉反应造成假阳性而设此对照。CK2为空sephrose4B的Pull-down，CK3为sephrose4B-GST(CK3)的Pull-down，箭头所指处为LMO2。
图8.
EMSA分析BEX1是否参与了LMO2复合体的作用元件。
探针E1(tcg gcg cca ggt gct gcg tcc cga tag ggg ccg)由一个E-box和一个GATA-box组成
所用于超迁移的抗体anti-LMO2 antiserum and anti-hBEX1 antiserum，此二者的抗体均为GST融合蛋白免疫新西兰大白兔所得。
A为超迁移，B为核抽提物与探针形成的结合迁移，C为自由探针
泳道3-7和11-15为冷探针竞争证明结合特异性
泳道1，9(CK1)仅加入探针，泳道2，1O(CK2)加入探针和核抽提物作为对照。
图9.
EMSA分析BEX1是否参与了LMO2复合体的作用元件。
探针E2(agc cga cca tct gtt cag gta aac aga tgg tcg aca)由两个E-box组成。
其他同上。
图10.
用原核表达的BEX1作为竞争物以表明anti-bex1抗体形成的超迁移的特异性。
探针为E2。
CK0为仅加探针，
CK1为仅加探针和核抽提物，
CK2为免疫前血清
CK3为anti-LMO2
其他泳道的抗体均为anti-bex1
图11.
LMO2与SNF5的免疫共沉淀泳道1为anti-LMO2抗血清，泳道2为鼠海马蛋白提取物，泳道3为流过液，泳道4为免疫共沉淀。沉淀用血清为自制新西兰大白兔的anti-LMO2，所用检测抗体为SANTA CRUTZ的商品化抗体(人与鼠)。
图12。
培养细胞经转染SNF5、BEX后的各细胞周期的细胞数量。
所使用的细胞株为Hela和G-401。
Hela的BEX1表达量很低，而G-401是SNF5的缺失型细胞株
各对照在图旁有注。
实施例：
1.酵母双杂交筛选与BEX1的相互作用蛋白
将Hbex1构建于Pas2-1中，转化酵母Y190，测定自激活，而后将从CLONTECH公司购买的胎脑文库(构建于pACT2上)转化含有BEX1的Y190酵母。
所得克隆经β半乳糖苷酶活性的检测后，其阳性克隆提取质粒，转化DH5α，经测序确定读码框后再与诱饵蛋白共转化SFY526以排除假阳性。在此中，即发现两个克窿，其一编码SNF5，另一个编码LMO2。
2重组蛋白质表达
小量培养鉴定
1)将经鉴定的原核重组表达质粒转化宿主菌BL21(DE3)，涂布于含有相应抗生素的LB琼脂培养板上，37℃培养10-16小时。
2)挑选4-6个单菌落分别接种到含抗生素的5ml LB管中，于37℃剧烈摇动培养8～12小时。
3)取上述培养物按1/20的比例接种到两个含抗生素的5ml新鲜LB管中，37℃剧烈摇动培养1～1.5小时，使菌液的OD 600nm达到0.6-0.8。
4)向上述其中一个转接管中加入终浓度为0.1～1mmol/L的IPTG，37℃剧烈摇动，继续培养3～4小时。另一管为不诱导对照。
5)分别用1.5ml离心管收集培养液各约1ml，12000rpm，离心30秒，收集菌体。
6)菌体沉淀以100μl 1×sample buffer重悬混匀，于100℃水浴煮沸10分钟，SDS-PAGE上样前12000rpm离心2分钟。取10～20μl上清上样，进行12％SDS-PAGE。
7)按照分子克隆所述的方法(19)制备12％SDS-PAGE分离胶，混匀后，将其灌入预先制备好的制胶板内(Bio-Rad公司的Mini-Cell制胶系统)，室温凝固45分钟。制备5％SDS-PAGE浓缩胶。电泳首先以8V/cm进行，待上样缓冲液进入分离胶后调整为15V/cm，电泳约2小时。
8)待溴酚蓝即将出胶时，停止电泳。0.25％考马斯亮蓝R250染液染胶2h，脱色液(30％甲醇，10％乙酸)脱色至蛋白带型清晰可见时，分析蛋白质表达结果，以表达量最高的阳性质粒作为质粒种子保存。
重组蛋白质的大量表达
1)自经过鉴定的阳性质粒保存板中挑单菌落加入100ml新鲜的含相应抗生素的LB锥形瓶中。37℃剧烈摇动培养过夜。
2)将过夜菌液按1/20比例接种到500ml含相应抗生素的LB锥形瓶中，37℃剧烈摇动培养，至菌液的OD600nm值达0.6-0.8。
3)加入适当浓度的IPTG诱导表达3-4小时。
4)收集培养液，5000rpm离心10分钟，弃上清。PBS(138mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，1.8mmol/L KH2PO4)洗菌体沉淀。
5)按照5ml/g(约为菌液体积的1/25，即20ml)的量用PBS(或结合缓冲液，见3.1)重悬菌体沉淀，冰浴下以工作10秒/冷却20秒/300W/25次的参数，超声破碎细胞。12000rpm离心20分钟，分别取少量上清(含可溶形式表达蛋白)和沉淀(含包涵体蛋白)，进行SDS-PAGE检测，分析蛋白质在胞内表达形式。其余于-70℃冻存备用。
*诱导条件，包括诱导时菌液浓度、IPTG浓度、诱导时间、诱导温度，需根据所表达的蛋白质不同进行优化。
可溶形式GST融合蛋白的亲和纯化
1)蛋白质样品的前期处理见2.2。超声破菌离心后以0.45μm滤膜过滤上清。
2)轻混Glutathione Sepharose 4B树脂，使其与保存液混匀呈完全悬浮状态。吸取一定量树脂(1ml沉积的树脂可纯化5mg目的蛋白质)悬液加到聚丙烯柱内，使树脂在重力作用下沉积。
3)以5倍柱体积的PBS洗柱。
4)上样，使样品靠重力缓慢流过柱子。
5)以30倍柱体积PBS淋洗。
6)加入1倍柱体积的GST洗脱缓冲液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，10mmol/LGlutathione)，室温孵育10min后，收集流出液，其中含有被纯化蛋白质。
7)重复步骤6)一次。
8)以5倍柱体积的PBS洗柱，再生柱子。
3.脂质体介导的真核细胞转染法(LIPOFECTAMINETM 2000 Reagent)
1).转染前一天，用胰蛋白酶进行消化以收获对数期生长的细胞，计数，以0.5-1.0×106重新接种于6孔板中培养过夜至细胞达到90-95％汇合时，进行转染。
2).转染前将培养基换成不含抗生素的培养基。
3).在两个无菌的1.5ml离心管中各加入250μl不含血清和抗生素的DMEM培养液。在其中一个加入1μg质粒DNA，另一个加入3μl LIPOFECTAMINETM2000，单独混匀后室温放置约3分钟后，将两管溶液混合，室温放置20分钟。
4).将混合液加入培养板中的一个孔。37℃、5％CO2孵箱中培养24-48hr。
*对不同的细胞系进行转染时，质粒DNA和转染试剂的用量需进行优化。
4.GST Pull-Down实验
1)在两个平行装有50μl Glutathione Sepharose 4B的柱中，分别加入GST-HSD-0.7(1.1nmol)和GST(1.3nmol)，并以10倍柱体积的PBS冲洗。
2)在两个柱中各加入500μl睾丸提取液，孵育1h后，以50倍柱体积PBS-T(138mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，1.8mmol/L KH2PO4，0.05％Tween 20)冲洗。
3)以100μl GST Elution Buffer(50mmol/L Tris-HCl pH 8.0，10mmol/L Glutathione)洗脱。
4)洗脱液进行SDS-PAGE，并以相应抗体进行Western印迹分析。
5.细胞免疫荧光(24)
A.试剂
浓酸：浓硝酸∶浓盐酸＝2∶1(V/V)
4％多聚甲醛固定液：60ml水中加入4g多聚甲醛，60～80℃水浴中滴加1mol/L的NaOH至溶解透明。待溶液冷却至15℃时用HCl将pH调至7.0。最后用PBS补充至100ml。
透化液：0.5％Triton/PBS
封闭液：3％BSA/PBS
封片剂：以预先配制的2％DABCO/PBS(Triethy lenediamine)制备90％的甘油
II.实验步骤
1).盖玻片的处理：将盖玻片分次置入浓酸中浸泡2小时，用去离子水洗净后室温干燥。将经酸处理过的盖玻片投入十倍稀释的多聚赖氨酸溶液中，室温放置5min后取出于60℃干燥1hr或室温过夜。用前将盖玻片浸泡于75％乙醇中至少30min。
2).质粒转染：按方法18.3进行。
3).细胞免疫荧光染色：
(1)细胞固定：转染后48hrs用PBS清洗细胞两次，取出盖玻片，用滤纸将残留液体吸干，以4％多聚甲醛固定液室温固定10～15min。
(2)PBS漂洗，3×5min。
(3)细胞透化：室温下，0.5％Triton/PBS透化处理10min。
(4)PBS漂洗，3×5min。
(5)细胞封闭：以3％BSA/PBS封闭，37℃，30min或4℃过夜。
(6)一抗孵育：在Parafilm膜上加入50μl以PBS按一定的稀释度稀释的一抗(如果进行双免疫荧光分析则同时加入两种一抗)，将盖玻片有细胞的一面朝下伏于一抗上，密封于湿盒中，37℃，30min。
(7)PBS漂洗，3×5min。
(8)二抗孵育：在Parafilm膜上加入50μl以PBS按1∶50稀释的荧光素标记的二抗(如果进行双免疫荧光分析则同时加入两种二抗)，37℃，30min。
(9)PBS漂洗，3×5min。
(10)去离子水漂洗去盐，2×5min。
(11)封片：取10μl封片剂滴在载玻片上，将盖玻片有细胞的一面朝下封片，四周用指甲油封住。立刻用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察并照相。
6.免疫共沉淀
I.试剂
细胞裂解液：
20mmol/L HEPES(pH7.5) 150mmol/L NaCl
1％NP40 1mmol/L EDTA
100mmo/L NaF 10mmol/L焦磷酸钠
20mmol/L β-甘油磷酸钠 1mmol/L钒酸钠*
1mmol/L DTT* 2mmol/L PMSF*
10μg/ml Aprotinin*
*：使用时新鲜加入
I.实验步骤
1).细胞的裂解 鼠拉颈处死开颅取海马，加入5倍体积的冰预的裂解液，放置冰上匀浆裂解至细胞核破裂。其间追加一次PMSF，细胞裂解物于4℃14000rpm离心20min后收集上清冻存于-70℃。
3).免疫共沉淀1ml细胞裂解液中加入40μl 50％protein A agarose，4℃振摇3hrs以除去非特异吸附的蛋白质。12000rpm离心20sec收集上清。将40μl anti-0.7的免疫兔血清加入上清中，4℃振摇1hr后再追加50μl50％protein A agarose，继续振摇1hr。样品经上样缓冲液处理，用抗SNF5的商品化抗体作为一抗，用碱性磷酸酶标记的兔抗山羊抗体作为二抗进行Western Blot检测显色。
7.RNA的制备和Northern印迹分析
将受孕后不同天数的(10、12、14、16)孕鼠麻醉后剖腹取胚胎，以及将成年鼠引颈处死后取脑。将这些组织用Trizoil法提取总RNA，电泳后转膜，紫外交联。
以随机引物法标记的BEX1及LMO2 cDNA全长序列为探针，进行Northern Blot杂交分析。同时，以哺乳动物组织恒定表达的β-actin基因为对照，监测所用RNA质量及Northern Blot结果。
8.原位杂交
原位杂交所用探针为小鼠BEX1基因序列中最为特异的一段，其序列为：
1 cactctctcc agcccgccat ccctaacgga ggcacctgtt cctggtggcg cagctcctgg
61 tggcgcagag cacgcgggcc cgggcggcgc ggaaagcagc aggaggagga agagcggagc
121 aggtctgaga agcagaagct tcgcggcgca cctggtggtg agcatctcta gaaagaggag
181 aaggcaa
具体方法见罗氏公司所引原位杂交试剂盒说明书。